常規(guī)PCR:是指在DNA聚合酶催化下,，以母鏈DNA為模板以特定引物為延伸起點(diǎn),，利用脫氧核苷三磷酸 (dNTP)，通過變性、退火,、延伸等步驟,，體外復(fù)制出與母鏈模板DNA互補(bǔ)的子鏈DNA的過程。

    但是常規(guī)PCR其實(shí)對(duì)PCR擴(kuò)增的終產(chǎn)物進(jìn)行半定量和定性的分析,，無法對(duì)起始模板準(zhǔn)確定量,，無法對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。

相比較于常規(guī)PCR,，實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)不僅實(shí)現(xiàn)了對(duì)模板的定量,，且具有靈敏度高、特異性和可靠性更好,、自動(dòng)化程度高和無污染的特點(diǎn),，使得熒光定量PCR逐漸取代常規(guī)PCR。

染料法以SYBR Green法為代表,，SYBR Green染料游離時(shí)熒光微弱，一旦與雙鏈DNA的小溝區(qū)域結(jié)合后,，熒光大大增強(qiáng),，反應(yīng)管中的熒光強(qiáng)度與反應(yīng)管中雙鏈DNA的數(shù)量成正比例關(guān)系，因此可以通過檢測(cè)熒光計(jì)算反應(yīng)管中產(chǎn)生的雙鏈DNA（PCR產(chǎn)物）的量,。

局限性：該方法沒有特異性,，非特異性擴(kuò)增的產(chǎn)物也會(huì)被計(jì)入。

Taq-Man探針法是最經(jīng)典的探針方法,，設(shè)計(jì)一條與擴(kuò)增產(chǎn)物能互補(bǔ)雜交的探針,，在探針的5’端標(biāo)記熒光基團(tuán)（供體：激發(fā)熒光），在探針3’端標(biāo)記淬滅基團(tuán)（受體：抑制熒光）,。

1. 當(dāng)探針完整時(shí),，熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)距離很近（探針長(zhǎng)度）因熒光共振能量轉(zhuǎn)移，熒光基團(tuán)在入射光激發(fā)下不發(fā)出熒光,。

2. PCR反應(yīng)進(jìn)行時(shí),，探針雜交在擴(kuò)增產(chǎn)物上，當(dāng)引物介導(dǎo)的延伸反應(yīng)到達(dá)探針位置時(shí),，因taq酶擁有5’-3’的外切酶活性,，會(huì)從5'端切割（水解）探針，從而使5’端的熒光基團(tuán)和3’端的淬滅基團(tuán)分離,，使它們的間距超過10nm,，超出熒光共振能量轉(zhuǎn)移的范圍,，熒光基團(tuán)此時(shí)在合適入射光的作用下，就能發(fā)出自身波長(zhǎng)的熒光,。

3. 探針雜交是特異性的,，所以熒光的種類和量能特異性的代表目標(biāo)產(chǎn)物的種類和量。

在PCR反應(yīng)過程中,，每經(jīng)過一個(gè)循環(huán),PCR產(chǎn)物量增加.相應(yīng)的熒光信號(hào)強(qiáng)度也跟著增加,此時(shí)收集一個(gè)熒光強(qiáng)度信號(hào),。經(jīng)過若干個(gè)循環(huán)后，可以得到一條以循環(huán)數(shù)(cycle threshold,CT)為橫坐標(biāo)和熒光強(qiáng)度(△Rn)變化為縱坐標(biāo)的“S'形熒光擴(kuò)增曲線,。

人為地分為基線期,、指數(shù)擴(kuò)增期和平臺(tái)期三個(gè)階段:

① 基線期，擴(kuò)增的熒光信號(hào)被熒光背景信號(hào)所覆蓋,，此時(shí)熒光信號(hào)極小,，我們無法判斷熒光強(qiáng)度的變化。

② 指數(shù)擴(kuò)增期,，熒光信號(hào)呈指數(shù)增長(zhǎng),，擴(kuò)增產(chǎn)物的量與起始模板量存在線性關(guān)系。

③ 線性增長(zhǎng)期:原料的消耗,、產(chǎn)物的積累,、酶活的損耗等導(dǎo)致DNA的擴(kuò)增不再呈指數(shù)擴(kuò)增。

④ 平臺(tái)期,，由于底物耗盡等因素.熒光信號(hào)不再呈指數(shù)增加,。

3.2 熒光閾值

是在熒光擴(kuò)增曲線指數(shù)增長(zhǎng)期設(shè)定的一個(gè)熒光強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)(即PCR擴(kuò)增產(chǎn)物量的標(biāo)準(zhǔn)）。一般為PCR反應(yīng)前3-15個(gè)循環(huán)熒光信號(hào)標(biāo)準(zhǔn)差的10倍,。手動(dòng)設(shè)置：熒光閾值可以設(shè)定在PCR擴(kuò)增的指數(shù)期中后期,。

3.3 基線

    是背景曲線的一段，在擴(kuò)增反應(yīng)的最初數(shù)個(gè)循環(huán)里熒光信號(hào)變化不大,，接近一條直線,。

3.4 Ct值

    閾值循環(huán)數(shù):表示每個(gè)PCR反應(yīng)管內(nèi)熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的熒光閾值所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)，研究表明,，每個(gè)模板的C-值與該模板起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系,，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小,。Ct.值一般取15-35太大或者太小都會(huì)導(dǎo)致定量的不準(zhǔn)確。我們利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可做出以起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo),CT值為縱坐標(biāo)的一條標(biāo)準(zhǔn)曲線,。只要獲得未知模板的CT值,即從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出該模板的起始拷貝數(shù),。