菌落總數(shù)與大腸菌群數(shù)測(cè)定

主要內(nèi)容

菌落總數(shù)測(cè)定

大腸菌群測(cè)定

MPN法原理(拓展內(nèi)容)

菌落總數(shù)的定義:

食品檢樣經(jīng)過(guò)處理,，在一定條件下 ( 如培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時(shí)間等)培養(yǎng)后,，所得每m(g)檢樣中形成的微生物菌落總數(shù),。

適用范圍: 

在平板計(jì)數(shù)瓊脂上生長(zhǎng)發(fā)育的嗜中溫需氧菌或兼性厭氧菌的菌落總數(shù)測(cè)定。

衛(wèi)生學(xué)意義:

●用來(lái)判斷食品本身的新鮮程度

●判定食品的衛(wèi)生質(zhì)量--加工,、貯存運(yùn)輸過(guò)程中是否受到污染

●必須配合大腸菌群的檢驗(yàn)和其他病原菌項(xiàng)目的檢驗(yàn),，才能作出比較全面準(zhǔn)確的評(píng)定

實(shí)驗(yàn)原理：

不同稀釋度的樣品，營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基,，36℃,，48h(水產(chǎn)品30℃，72h)

實(shí)驗(yàn)器材與試劑：

樣品,，無(wú)菌生理鹽水,，平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基，1mL吸管,，培養(yǎng)皿

傾注培養(yǎng)

培養(yǎng)結(jié)果

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菌落計(jì)數(shù)：

肉眼觀(guān)察，可用放大鏡,，可標(biāo)記

必要時(shí)分區(qū)計(jì)數(shù),，菌落成片者作廢

菌落計(jì)數(shù)方法：

注意事項(xiàng)：

1.無(wú)菌操作

2.標(biāo)記

3.何時(shí)更換吸管

4.吸吹混勻

5.瓊脂培養(yǎng)基保溫

大腸菌群定義:

在一定培養(yǎng)條件下能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣的需氧和兼性厭氧革蘭氏陰性

無(wú)芽胞桿菌,。

檢測(cè)意義:

該菌主要來(lái)源于人畜糞便,，作為糞便污染指標(biāo)評(píng)價(jià)食品的衛(wèi)生狀況，推

斷食品中腸道致病菌污染的可能,。

檢測(cè)方法:

第一法大腸菌群MPN計(jì)數(shù)法

第二法大腸菌群平板計(jì)數(shù)法

實(shí)驗(yàn)原理：

36℃,，48h，產(chǎn)氣(小倒管協(xié)助判斷)  

三步法:初發(fā)酵,、復(fù)發(fā)酵

實(shí)驗(yàn)器材及試劑:

樣品,、無(wú)菌生理鹽水、LST肉湯,，BGLB肉湯,、1mL吸管、10mL吸管、試管,、小倒管

☆初發(fā)酵

器材與試劑

樣品,、225ml無(wú)菌生理鹽水、9ml無(wú)菌生理鹽水,、雙料LST肉湯,，單料LST肉湯，10mL吸管,、1mL吸管,、吸球等

實(shí)驗(yàn)步驟：

1、吸取樣品的方法（如圖）

加注樣品

2,、初發(fā)酵結(jié)果

右邊為陽(yáng)性結(jié)果,，小倒管內(nèi)有氣體產(chǎn)生

3、復(fù)發(fā)酵

(1)選取產(chǎn)氣試管

(2)接種至10mIBGLB肉湯中.

(3)培養(yǎng): 36℃,，48h

(4)觀(guān)察指標(biāo):若產(chǎn)氣則報(bào)告大腸菌群陽(yáng)性,。

4、分離培養(yǎng)

器材與試劑

初發(fā)酵結(jié)果(4只發(fā)酵管),、酒精燈,、接種環(huán)、伊紅美蘭平板培養(yǎng)基

(1)制備伊紅美藍(lán)平板:

45℃,，無(wú)菌,，傾注，15mL

(2)選產(chǎn)酸產(chǎn)氣的發(fā)酵管

(3)接種至伊紅美藍(lán)平板分區(qū)劃線(xiàn)法

(4)培養(yǎng):36°C,，48h

(5)菌落特征:

深紫黑色,、有金屬光澤紫黑色、無(wú)或略有金屬光澤淡紫紅色,、中心顏色深

典型菌落

(6)革蘭染色,、鏡檢:選特征菌落

※分區(qū)劃線(xiàn)法的操作要點(diǎn)：

1.劃下一個(gè)區(qū)前必須滅菌接種環(huán)

2.劃線(xiàn)時(shí)接種環(huán)同平板呈30-40°角

3.每次劃線(xiàn)應(yīng)該壓到上一個(gè)區(qū)域的2-3條線(xiàn)

4.用接種環(huán)的“面”而不是“弧”在平板上滑動(dòng)

1、器材與試劑

結(jié)晶紫,、盧戈碘液,、95%乙醇、酸性復(fù)紅,、生理鹽水,、酒精燈、載玻片,、濾紙

2,、步驟：

（1）涂片:接種環(huán)，挑取菌落,生理鹽水一滴,，涂勻

（2）熱固定:通過(guò)火焰若干次

（3）初染:結(jié)晶紫一滴,，1min,水洗

（4）媒染:盧戈碘液一滴,，1min，水洗

（5）脫色: 95%乙醇,，30s或至無(wú)色為止

（6）復(fù)染:復(fù)紅一滴,，30s

涂片

熱固定

初染

媒染

脫色

復(fù)染

(1)選取鑒定為無(wú)芽孢G桿菌的菌落1-3個(gè)

(2)接種至10ml乳糖蛋白胨培養(yǎng)液

(3)培養(yǎng): 37C，24h 

(4)觀(guān)察指標(biāo):產(chǎn)酸,，產(chǎn)汽

※大腸菌群檢測(cè)的操作要點(diǎn)：:

1.無(wú)菌操作

2.吸管使用

3.洗去染液的方法

4.顯微鏡保養(yǎng)

5.液體接種

MPN法( Most Probable Number Method )

目的:對(duì)某種細(xì)菌進(jìn)行選擇性計(jì)數(shù)

核心思想:泊松分布

實(shí)施方法:多次稀釋直至無(wú)菌,，每個(gè)稀釋度分別接種若干培養(yǎng)管，根據(jù)陽(yáng)性管數(shù)估算MPN值

因?yàn)榧?xì)菌在樣本內(nèi)的分布是隨機(jī)的,，所以檢測(cè)細(xì)菌時(shí),，可按概率理論計(jì)算菌數(shù)。

1.細(xì)菌進(jìn)入發(fā)酵管的概率近似服從泊松分布:

X:細(xì)菌濃度,，k:進(jìn)入發(fā)酵管的細(xì)菌數(shù)

2.若在n管發(fā)酵中,，令接種水樣量為Vi，陽(yáng)性管數(shù)為Pi,， 陰性管數(shù)為Qi,則該檢驗(yàn)結(jié)果發(fā)生的概率為:

其中C為常系數(shù)

V為總水樣量,，x為細(xì)茵個(gè)數(shù)

3.當(dāng)y(x) >max，X→MPN

4.由于y(x)為單極值函數(shù),，令dy/dx=0,即

5.解此方程,，得x=MPN

6.該方程為超越方程，一般采用數(shù)值法求近似解

7.日常實(shí)驗(yàn)時(shí)采用查表法推算MPN值,。

文章參考：

1.國(guó)標(biāo)菌落總數(shù),、大腸菌群等；

2.圖片來(lái)源網(wǎng)絡(luò)及微信好友分享,；

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