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qPCR是分子診斷學(xué)最常用的一種方法,，今天小編就嘗試對引物設(shè)計方面進(jìn)行整理，希望讓qPCR實(shí)驗不再是煩惱,。 01 引物設(shè)計原則  1. 引物長度：18-30bp,； 2. GC含量：30%-80%，最好是 40%-60%之間,； 3. 引物Tm值最好在 60℃左右,，上下游的兩條引物Tm差異不要超過4℃； 4. 避免引物與目的基因之間發(fā)生錯配,，特別是引物3'端,； 5. 避免特定堿基的連續(xù)重復(fù)，特別是引物 3’端出現(xiàn)3個或以上連續(xù)的C或者G堿基重復(fù); 6. 避免引物自身形成發(fā)夾結(jié)構(gòu),； 7. 避免引物之間形成二聚體,，特別是引物3'端,；引物自身不能有連續(xù) 4 個堿基的互補(bǔ)； 8. 引物設(shè)計跨內(nèi)含子,，這里上下游引物可以在不同的外顯子,，或者同一個引物剛好跨兩個外顯子； 9. 引物 5′ 端可以修飾,，引物 3′ 端不可修飾,； 10. 引物特異性比對：NCBI primer-blast； 02 擴(kuò)展產(chǎn)物大小   1. 產(chǎn)物大小一般控制在80-300bp,，150bp最適長度,，相對短的擴(kuò)增產(chǎn)物，擴(kuò)增效率會要高,； 2. 產(chǎn)物GC含量在40%-60%,；  03 驗證  數(shù)據(jù)庫參考： 1. NCBI Refseq（NCBI Reference Sequence）數(shù)據(jù)庫中基因類型為lncRNA，pseudo的全部基因,； 2. mirbase數(shù)據(jù)庫中human,，mouse，rat全部成熟體序列的microRNA,； 3. circbase數(shù)據(jù)庫中human,，mouse全部circRNA； 堅持的三個最重要設(shè)計原則 1. 引物跨內(nèi)含子設(shè)計,，避免基因組污染帶來的影響,； 2. 引物在基因（NCBI Refseq）對應(yīng)的所有轉(zhuǎn)錄本同源區(qū)設(shè)計； 3. 引物特異性,，設(shè)計引物全部使用NCBI primer-blast比對工具進(jìn)行引物特異性比對,；   END |
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