一頓操作猛如虎，一看戰(zhàn)績(jī)0-5,。

盡管引物設(shè)計(jì)是PCR實(shí)驗(yàn)成功的前提,，但是蠻多小伙伴的實(shí)戰(zhàn)經(jīng)驗(yàn)稍顯不足。

今兒就向大家介紹2種引物設(shè)計(jì)方法,。

This    is    the    dividing    line.

引 物 設(shè) 計(jì)

盡管是老生常談了,，但是小編還是想先把引物設(shè)計(jì)的原則放出來(lái)(其實(shí)是復(fù)制粘貼啦，哪哪都有),。

1,、引物應(yīng)用核酸系列保守區(qū)設(shè)計(jì)并具有特異性。最好位于編碼區(qū)5\'端的300-400bp區(qū)域內(nèi),，可以用DNAMAN,，Alignment軟件看看結(jié)果。

2,、不能形成2級(jí)結(jié)構(gòu),。

3、引物長(zhǎng)度一般在17-25bp之間,，上下游引物不能相差太大,。

4,、G+C含量在40-60%之間，45-55%最佳,。

5,、堿基要隨機(jī)分布，盡量均勻,。

6,、引物自身不能有連續(xù)4個(gè)堿基的互補(bǔ)。

7,、引物之間不能有連續(xù)4個(gè)堿基的互補(bǔ),。

8、引物5‘端可以修飾,。

9,、3’端不可修飾，而且要避開(kāi)AT,，GC富集的區(qū)域,，避開(kāi)T/C,A/G連續(xù)結(jié)構(gòu)（2-3個(gè)）。

10,、引物3\'端要避開(kāi)密碼子的第三位,。

11、引物整體設(shè)計(jì)自由能分布5\'端大于3‘端,。

12,、定量產(chǎn)物長(zhǎng)度80-150bp最好，最長(zhǎng)是300bp,。

原則忒多啦,，小伙伴們，先別暈,，看下方,。

方法一：PrimerBank法

網(wǎng)址：

https://pga.mgh./primerbank/index.html

打開(kāi)以上網(wǎng)址，進(jìn)入PrimerBank網(wǎng)站界面,，如下圖

個(gè)人覺(jué)得這是最便捷的引物獲取方法,，該網(wǎng)站可以非常迅速地檢索到已經(jīng)他人驗(yàn)證的引物序列及相關(guān)反應(yīng)條件。

圖中第一個(gè)方框,，一般選擇NCBI Gene ID,；第二個(gè)方框選擇你所關(guān)注的物種，常用的就是Mouse和Human了,，如果為其它物種,，則選擇All Species即可；第三個(gè)方框中需要輸入你關(guān)注的基因ID號(hào)碼。

如何獲取基因ID呢,，這里就需要打開(kāi)NCBI網(wǎng)站,，選擇Gene，并輸入你的目的基因如p53 homo,，選擇第一個(gè),，可見(jiàn)其ID號(hào)為7157。如下圖所示,。

然后將ID號(hào)7157輸入上方PrimerBank網(wǎng)站的For text框中,，并選擇種屬為人，點(diǎn)擊Submit后,，跳轉(zhuǎn)頁(yè)面如下,。

網(wǎng)站會(huì)自動(dòng)推薦3對(duì)已經(jīng)驗(yàn)證的引物，小伙伴們可以直接拿著用了,。

方法二：Ensembl+NCBI BLAST法

很多人會(huì)推薦大家使用Oligo、PP或DNA man之類(lèi)的,，小編這里想推薦一個(gè)更好用的網(wǎng)站,，Ensembl，非常實(shí)用,。

網(wǎng)址1：

http://asia./index.html

網(wǎng)址2：

https://www.ncbi.nlm./tools/primer-blast/index.cgi?LINK_LOC=BlastHome

首先打開(kāi)Ensembl網(wǎng)站,，選擇物種為Human，檢索基因?yàn)锽RCA2（其它物種可在左下方箭頭處尋找）,。如下圖所示,。

順手點(diǎn)擊Go，跳轉(zhuǎn)至以下界面,。由于我們要拿到轉(zhuǎn)錄組的序列,，所以需要進(jìn)一步點(diǎn)擊左側(cè)的Transcript篩選框。

點(diǎn)擊轉(zhuǎn)錄組篩選框后,，可見(jiàn)以下界面,，我們可以選擇第一個(gè)。

繼續(xù)點(diǎn)進(jìn)去,，然后在左側(cè)選擇cDNA，點(diǎn)擊后如下圖所示,。