檢測細(xì)胞增殖的方法很多,，MTT、CCK8,、BrdU 等等,，你知道細(xì)胞可以CFSE 染色用流式來檢測細(xì)胞增殖么？好啦,，不知道的同學(xué)搬好小板凳排排坐啦,！

CFSE 是一種熒光染料,，脂溶性高，易進(jìn)入細(xì)胞,，可以與胞內(nèi)氨基酸發(fā)生不可逆的結(jié)合,，在細(xì)胞的分裂過程中能夠進(jìn)入子代細(xì)胞，同時熒光強(qiáng)度也變?yōu)槟讣?xì)胞的一半,，可用流式或熒光顯微鏡對其進(jìn)行分析,。

下面我們就開始動手，用流式來檢測脾淋巴細(xì)胞的增殖,。

— 先準(zhǔn)備一些試劑 —

???

— 實驗正式開始 — 

1. 脾淋巴細(xì)胞的制備

無菌操作取出小鼠脾臟,，研磨成單細(xì)胞懸液，用紅細(xì)胞裂解液或者小鼠淋巴細(xì)胞分離液去除紅細(xì)胞,，將細(xì)胞過 40 μm 細(xì)胞濾網(wǎng)后,，進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)。樣本清洗液洗滌（可用 PBS 或者不含血清雙抗的培養(yǎng)基代替）,，1 500 rpm 離心 5 min,，用 PBS 重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度為 107/ml,。

2. CFSE 標(biāo)記脾細(xì)胞

取部分細(xì)胞作為不染色組陰性對照,，其他細(xì)胞加入 CFSE 溶液，使得終濃度為 5 μm,，室溫避光孵育 15 min,，加入 5 倍體積的完全培養(yǎng)基，室溫靜置 5 min,，釋放多余的未結(jié)合的 CFSE 來終止其染色。1 500 rpm 離心 5 min,，用與 CFSE 染色時相同體積的 RPMI 1640 完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀,，使其細(xì)胞濃度仍為 107/ml。

3. ConA 與脾細(xì)胞孵育

取 96 孔圓底細(xì)胞培養(yǎng)板,，CFSE 染色組和不染色組分別設(shè)置 ConA 組和 PBS 組,，將細(xì)胞進(jìn)行鋪板，先將 CFSE 染色和不染色的細(xì)胞 2 倍稀釋,，每孔 100 μl 細(xì)胞鋪板,。

將 ConA 儲存液進(jìn)行 100 倍稀釋，在 ConA 組中每孔加入 100 μl 配置好的 ConA 工作液,，使得終濃度為 5 μg/ml（這時就是 200 倍稀釋啦）,，在 PBS 組中加入 100 μl 完全培養(yǎng)基（這樣鋪板密度就為 5×10⁵/孔）,。將細(xì)胞培養(yǎng)板置于 37 ℃，5% CO2 的培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 72 小時。

4. 流式上機(jī)檢測

收集各組細(xì)胞，染色組細(xì)胞進(jìn)行 CD3 表面染色,，以對脾細(xì)胞中的淋巴細(xì)胞的增殖進(jìn)行檢測。流式 FITC 通道分析增殖的脾細(xì)胞所占的比例。

???

— 看看我做的結(jié)果吧 —

用的 BD C6 流式細(xì)胞儀,，直接截圖啦。首先是不染色組,，圈出 P1 門,，直方圖圈出細(xì)胞，基本都是 CFSE 陰性的,。

接下來看染色組,，因我們分析的是脾淋巴細(xì)胞，所以是在 CD3 in P1 門里看 CFSE 陽性,，發(fā)現(xiàn)幾乎所有細(xì)胞都被 CFSE 染色,。細(xì)胞增殖僅為 1%。

在 ConA 刺激組的直方圖中,，我們可以明顯看到與 PBS 組相比,，左邊多出 3 個小峰，這就是增殖的脾淋巴細(xì)胞啦,，同樣在散點圖中也能看到與 PBS 組相比多出三個分群,，這就說明細(xì)胞在 72 h 里傳了三代。