1,、BRAF 基因及突變概述

BRAF基因是位于第7號染色體的長臂上（7q34）的原癌基因，BRAF蛋白是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,，為RAF激酶家族中的一員,。

圖1：BRAF V600E的蛋白晶體結(jié)構(gòu)及靶向藥物結(jié)合位點(diǎn)

BRAF基因突變發(fā)生在大量癌癥組織中，比如,，約100%的毛細(xì)胞白血病,、50%的黑色素瘤、20%~40%甲狀腺癌,，10%~15%的結(jié)直腸腺癌,，10%的腦膠質(zhì)瘤，4%的非小細(xì)胞肺癌,，小概率發(fā)生在其它類型白血病和卵巢癌中,。 

BRAF基因突變通常發(fā)生在蛋白激酶激活區(qū)域，主要包括點(diǎn)突變,、小片段缺失,、擴(kuò)增、基因融合等,，最常發(fā)生的突變類型就是BRAF V600E,，BRAF V600是位于15號外顯子第600位密碼子的纈氨酸被替代，該突變使其蛋白活性上調(diào)至500倍,。帶有BRAF V600E突變的結(jié)直腸癌患者可能同時會存在高腫瘤突變負(fù)荷,、高微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（~30%-50%）、高CpG島甲基化表型（~70%）,，甲基化介導(dǎo)的基因表達(dá)表觀調(diào)控改變,。

2、BRAF介導(dǎo)的信號通路

RAF激酶家族（ARAF、BRAF和CRAF）是RAS-RAF-MEK-ERK信號級聯(lián)（MAPK信號）的核心組成部分,，可傳導(dǎo)細(xì)胞增殖,、分化等信號并參與完成成熟細(xì)胞功能。當(dāng)生長因子與細(xì)胞表面的受體（EGFR）結(jié)合后,，受體的酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域被激活并通過RAS激酶發(fā)出信號,。RAF蛋白是活化的RAS蛋白的直接效應(yīng)子，RAF分子的二聚化通過磷酸化和激活MEK進(jìn)一步傳遞該信號級聯(lián),，磷酸化的MEK激活ERK,，活化后的ERK從胞質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞核，磷酸化和活化核內(nèi)的效應(yīng)分子,，最終啟動與細(xì)胞增殖有關(guān)的靶基因轉(zhuǎn)錄,，促進(jìn)細(xì)胞增殖、分化,、遷移,、存活和促血管生成。 

BRAF基因?qū)τ谡＜?xì)胞的生長至關(guān)重要,，但不受抑制的BRAF信號傳導(dǎo)會促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展,。 當(dāng)BRAF基因突變，KRAS/AKT通路過度激活,，細(xì)胞循環(huán)紊亂,，檢查點(diǎn)相關(guān)通路異常，腫瘤細(xì)胞過度增殖,，同時參與調(diào)控影響上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)換,，影響機(jī)體免疫反應(yīng)。因此,，BRAF基因突變也預(yù)示著不良預(yù)后。

圖2：RAS/BRAF/MEK/ERK 和PI3K/AKT/mTOR 信號通路及其抑制劑

3,、BRAF基因的突變特點(diǎn),、治療方法及耐藥機(jī)制

BRAF V600E突變型結(jié)直腸癌多見于右半結(jié)腸（81%），多發(fā)于女性（65%）,，幾乎不與KRAS突變同時發(fā)生,。CSCO指南推薦結(jié)直腸癌患者行靶向治療前，應(yīng)檢測BRAF V600E突變和RAS突變狀態(tài),。BRAF V600E突變和RAS突變幾乎不同時發(fā)生,。 Mayo clinic的一項(xiàng)多中心回顧性隊(duì)列研究顯示，結(jié)直腸癌患者中,，發(fā)生BRAF non-V600E突變的頻率為2.2%（208/9643）,，占所有BRAF突變患者的21%（208/965）。BRAF non-V600E突變多發(fā)于左半結(jié)腸（63%），常見于男性（54%）,，多為MSS（94%）,，且與KRAS突變可以同時存在（26%）。

對比BRAF V600E突變及BRAF野生型的晚期結(jié)直腸癌患者,，攜帶BRAF non-V600E突變患者的中位生存期（OS）顯著延長（11.4個月 vs. 43.0個月 vs. 60.7個月,，P <0.001），多因素分析結(jié)果顯示BRAF non-V600E突變是結(jié)直腸癌預(yù)后更好的獨(dú)立預(yù)測因子,。 

BRAF V600E突變可以作為信號通路的單體,，引起MAPK通路自發(fā)持續(xù)異常激活，且不依賴RAS活性,，導(dǎo)致結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展以及對EGFR單抗如西妥昔單抗,、帕尼單抗的耐藥，對BRAF抑制劑和信號通路下游MEK抑制劑敏感,。 BRAF V600E基因突變的激酶活性最高,，對BRAF單體抑制劑（維莫非尼，達(dá)拉非尼和康奈非尼）,、MEK抑制劑（考比替尼,，比美替尼和曲美替尼）及二者聯(lián)合方案均敏感。 

在單獨(dú)使用RAF或MEK抑制劑的患者中,，約50%會在治療后的6~7個月內(nèi)產(chǎn)生耐藥,。目前的研究表明，耐藥患者中有60~70%的患者存在MAPK通路的再激活,，這涉及到多種機(jī)制,，可能和NRAS突變、BRAF擴(kuò)增和MEK1/2突變等相關(guān),。 另外,，有研究表明，BRAF V600E突變耐藥也可能是相關(guān)自噬信號通路被激活,。自噬是一個保守的細(xì)胞循環(huán)過程,，在BRAF V600E突變的黑色素瘤中發(fā)現(xiàn)，在經(jīng)過BRAF V600E抑制劑治療的腫瘤中,，自噬明顯增加,。自噬可以促進(jìn)腫瘤的發(fā)生進(jìn)展，并保護(hù)癌細(xì)胞免受化療的細(xì)胞毒性作用,。

為此,，與敏感細(xì)胞系相比，BRAF抑制劑(BRAFi)耐藥細(xì)胞往往表現(xiàn)出增加的自噬,。BRAF抑制劑誘導(dǎo)的自噬有多種機(jī)制,，如激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)應(yīng)激蛋白gatekeeper GRP78,、腺苷酸活化蛋白激酶，ERK1/2或mTOR被抑制,，這會導(dǎo)致自噬相關(guān)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子TFEB和TFE3表達(dá)上調(diào),，引起自噬。

圖3：BRAF V600E抑制劑誘導(dǎo)自噬的相關(guān)信號通路

除了直接靶向RAF的抑制劑外,，發(fā)生BRAF突變的患者也對MEK抑制劑敏感,。MEK蛋白是細(xì)胞外信號相關(guān)激酶（ERK）途徑的上游調(diào)節(jié)劑，抑制MEK1和MEK2可以抑制MAPK途徑的下游信號傳導(dǎo),。目前有三種靶向MEK的別構(gòu)抑制劑——考比替尼（Cobimetinib）,、曲美替尼（Trametinib）和比美替尼（Binimetinib）獲批用于治療BRAF V600突變的黑色素瘤。 臨床前研究和臨床證據(jù)均表明,，在BRAF V600E突變的腫瘤細(xì)胞中,，RAF抑制劑聯(lián)用MEK抑制劑可增加腫瘤細(xì)胞凋亡水平，表現(xiàn)出更有效及持久的治療響應(yīng),，可以有效提高患者的無進(jìn)展生存期（PFS）,。

多項(xiàng)全球關(guān)鍵性臨床研究結(jié)果顯示，對比達(dá)拉非尼單藥治療,，達(dá)拉非尼聯(lián)合曲美替尼雙靶向治療方案可幫助BRAF V600E突變黑色素瘤患者實(shí)現(xiàn)更高的疾病緩解,，達(dá)到更長的無進(jìn)展生存。2020版CSCO診療指南也將雙靶聯(lián)合治療列入BRAF V600E陽性的黑色素瘤,、結(jié)直腸癌及肺癌的推薦用藥,。

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