撰文：huacishu

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1、作者討論了目前對ecDNA的結(jié)構(gòu)以及它如何促進(jìn)癌基因表達(dá)的理解,，包括與ecDNA染色質(zhì)組織和核定位相關(guān)的屬性,；

2、作者描述了檢測和測序ecDNA的新工具的開發(fā)及其在癌癥中鑒定ecDNA結(jié)構(gòu)和豐度的用途,；

3,、作者討論了ecDNA染色質(zhì)組織的改變及其對癌基因調(diào)控的影響，提示這些新的ecDNA特性可能會產(chǎn)生意想不到的致癌功能,，這可能為治療干預(yù)提供了機會,。

美國杰克遜基因醫(yī)學(xué)實驗室Roel G. W. Verhaak教授課題組在國際知名期刊Nat Rev Genet在線發(fā)表題為“Extrachromosomal DNA amplifications in cancer”的論文。染色體外DNA（ecDNA）擴增是癌癥改變的重要驅(qū)動因素,。ecDNA的功能與其獨特的性質(zhì)有關(guān),，例如其圓形結(jié)構(gòu)與染色質(zhì)化和表觀遺傳調(diào)控景觀的改變有關(guān)，以及其在細(xì)胞分裂期間隨機分離的能力,，這增加了細(xì)胞間拷貝數(shù)的異質(zhì)性,。

在這篇綜述中，作者綜述了目前已知的ecDNA是如何生成的,，以及其遺傳和表觀遺傳結(jié)構(gòu)如何影響癌癥中原癌基因的調(diào)控,。作者還討論了最近發(fā)現(xiàn)的ecDNA功能如何影響腫瘤發(fā)生,，強調(diào)其可以作為癌癥新的治療靶點。

原癌基因異常高表達(dá)是腫瘤發(fā)生的標(biāo)志,，它可由染色體結(jié)構(gòu)或數(shù)目異常引起,。體細(xì)胞拷貝數(shù)改變是癌基因表達(dá)變化的最常見驅(qū)動因素。染色體外DNA（ecDNA）是一種環(huán)狀DNA元件,，已成為體細(xì)胞拷貝數(shù)擴增的最重要形式之一,。自1965年在神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)ecDNA以來，在大規(guī)模DNA測序數(shù)據(jù)集中對ecDNA的重新評估表明,，它存在于大多數(shù)癌癥類型中（圖1a）,。與其他類型的局灶性擴增相比，含有ecDNA的腫瘤患者的臨床結(jié)果更差,，這證實了ecDNA元素的功能重要性,。

兩個普遍接受的特征使ecDNA成為原癌基因擴增的獨特且異常有效的載體。首先,，它們的圓形結(jié)構(gòu)與轉(zhuǎn)錄升高相關(guān),，與線性擴增相比，導(dǎo)致原癌基因表達(dá)增加,。其次,，擺脫了染色體位置限制和缺少著絲粒，ecDNA不平等地分離到子細(xì)胞中,，這可以快速增加ecDNA拷貝數(shù)并驅(qū)動腫瘤內(nèi)異質(zhì)性（圖1b）,。因此，ecDNA代表了具有獨特分子特征的癌癥中癌基因擴增的重要載體,，其中大多數(shù)目前尚未完全了解,。

在這篇綜述中，作者討論了目前對ecDNA的結(jié)構(gòu)以及它如何促進(jìn)癌基因表達(dá)的理解,，包括與ecDNA染色質(zhì)組織和核定位相關(guān)的屬性,。描述了檢測和測序ecDNA的新工具的開發(fā)及其在癌癥中鑒定ecDNA結(jié)構(gòu)和豐度的用途。討論了ecDNA染色質(zhì)組織的改變及其對癌基因調(diào)控的影響,，作者認(rèn)為,，這些新的ecDNA特性可能會產(chǎn)生意想不到的致癌功能，這可能為治療干預(yù)提供了機會,。

ecDNA的結(jié)構(gòu)性質(zhì)

合成和擴增

當(dāng)產(chǎn)生的染色體異常包含原癌基因或為細(xì)胞提供增殖或生存優(yōu)勢的致癌調(diào)節(jié)元件時,，就會發(fā)生克隆選擇。據(jù)報道,，至少有70個基因組區(qū)域在癌癥中被反復(fù)擴增,，包括含有原癌基因的位點，如EGFR,、MYC,、MYCN和CCND2,。在癌癥中以高拷貝數(shù)水平進(jìn)行局部擴增的大多數(shù)基因在腫瘤子集中被染色體外擴增，在所有新診斷和未治療的癌癥中有14%檢測到ecDNAs（圖1a）,。一些ecDNA只包含增強子而不包含基因,，這表明選擇含有ecDNA的腫瘤細(xì)胞可以基于ecDNA的作用，而不僅僅是激活癌基因表達(dá),。

由于基因組中隨機位置的DNA損傷以及錯誤修復(fù),，可能會出現(xiàn)局部擴增。在其最簡單的形式中,，ecDNA元件由通過端到端連接循環(huán)的兩個DNA雙鏈斷裂產(chǎn)生的單個染色體DNA片段組成（圖2）,。更常見的是，ecDNA由來自不同染色體的數(shù)十到數(shù)百個分離的DNA片段組成,，重組成單個元素（圖2）,。復(fù)雜的ecDNA結(jié)構(gòu)形成至少與兩種機制有關(guān)：第一,，染色體破碎,，產(chǎn)生聚集重排并導(dǎo)致ecDNA形成，在原發(fā)性癌癥中檢測到的約36%的ecDNA中,，染色體三聯(lián)體的足跡證明了這一點,；第二，斷裂-融合-橋循環(huán)（BFB）,，如在一些ecDNA上發(fā)現(xiàn)的頭對頭折回反轉(zhuǎn)所證明（圖2）,。

分布

ecDNA分子的數(shù)量因細(xì)胞而異，這意味著有絲分裂期間ecDNA的分離不均勻（圖1b）,。ecDNAs中沒有著絲粒,，在細(xì)胞周期的中期無絲分裂階段，通過紡錘體復(fù)合力阻止了均勻的有絲分裂分布,。然而,，如果有絲分裂后子細(xì)胞的細(xì)胞核中不包含ecDNA元素，它們就會被微核所包裹,。因此,，需要存在確保有絲分裂ecDNA分布的機制。ecDNA在S期早期復(fù)制,，這一特性通常與活性轉(zhuǎn)錄相關(guān)（圖3）,。在DNA復(fù)制開始時，ecDNA分子從核周邊重新定位到核中心,，這可能意味著存在ecDNA特異性復(fù)制機制,。在M期和分離期間，ecDNA優(yōu)先結(jié)合線性染色體的端粒區(qū)域,。

在患者腫瘤中已觀察到適應(yīng)性反應(yīng),，其中含ecDNA的亞克隆在靶向治療下迅速縮小,，但在治療壓力消除后重新出現(xiàn)。在應(yīng)激條件下,，動態(tài)降低和增加ecDNA水平的能力可能特別有效,，其中可能包括腫瘤微環(huán)境中遇到的缺氧和高酸度。表觀遺傳狀態(tài)與應(yīng)激反應(yīng)相關(guān),，可促進(jìn)EGFR位點的瞬時位點特異性拷貝數(shù)增加,，特別是在染色體外時。在穩(wěn)定的環(huán)境下,，如細(xì)胞培養(yǎng)中,，ecDNA通常會丟失，因此ecDNA的優(yōu)勢可能較小,。因此,，即使ecDNA在每個細(xì)胞周期復(fù)制一次，它也不遵循大多數(shù)有絲分裂遺傳規(guī)則,，使腫瘤能夠快速進(jìn)化并保持高度的遺傳異質(zhì)性,。

ecDNA的轉(zhuǎn)錄調(diào)控

染色質(zhì)組織

最近的證據(jù)表明，與染色體DNA相比,，ecDNA具有增加的染色質(zhì)可及性和較不緊湊的核體組織的特點（圖4a）,。與腫瘤樣品中的線性擴增子相比，在染色體外環(huán)形擴增子中觀察到轉(zhuǎn)座酶可及染色質(zhì)測序（ATAC-seq）測定的信號更高,，并對DNA拷貝數(shù)進(jìn)行歸一化,。在髓母細(xì)胞瘤腫瘤中證實了循環(huán)和擴增位點內(nèi)ATAC-seq信號密度的增加。作者觀察到,，與同源線性DNA的染色質(zhì)相比,，ecDNA上的染色質(zhì)平均可接近性高出兩倍，80%的ecDNA區(qū)域高度可接近,。

總的來說,，ecDNA上的基因區(qū)域比它們的線性對應(yīng)部分更容易接近。染色質(zhì)可接近性的增加導(dǎo)致ecDNA cargo基因表達(dá)水平的增加,，這顯著高于基于ecDNA拷貝數(shù)的預(yù)期,。驅(qū)動ecDNA上染色質(zhì)可及性增加的機制目前尚不清楚。

增強子共擴增

ecDNA的圓形結(jié)構(gòu)導(dǎo)致染色質(zhì)元素的三維重新定向,，從而實現(xiàn)局部和遠(yuǎn)端增強子-基因接觸（圖4b）,。除了過去的報告表明擴增子邊界是由DNA脆弱位點形成的之外，最近的研究還提供了證據(jù),，證明在癌細(xì)胞起源類型中活性的共擴增鄰近增強子元件在形成擴增子邊界中起主要作用,。

在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中，基于局部增強子的存在或不存在，描述了兩類不同的擴增子,。I類擴增子結(jié)合了局部增強子元件,，結(jié)構(gòu)簡單，很少結(jié)合來自其他染色體的額外遠(yuǎn)端DNA片段,。相比之下,，II類擴增子缺乏局部增強子共擴增，但通過連接來自遠(yuǎn)處位點的DNA片段進(jìn)行補償,。共擴增的遠(yuǎn)距離DNA片段含有譜系特異性增強子元件和絕緣體,，形成具有新的空間相互作用調(diào)控鄰域的高度復(fù)雜的多片段擴增子。共擴增調(diào)控元件及其與癌基因啟動子的接觸不僅保留在ecDNA上,，而且積極促進(jìn)癌基因表達(dá)和癌細(xì)胞適合性,。

總之，ecDNA中癌基因的表達(dá)僅部分由ecDNA上癌基因劑量的增加決定,。將這些新的見解整合到ecDNA驅(qū)動的癌基因去調(diào)控的統(tǒng)一模型中,，該模型將包括局部和遠(yuǎn)處增強子強度、染色質(zhì)緊密程度和可接近性,、增強子結(jié)合位點處的轉(zhuǎn)錄因子親和力和DNA拷貝數(shù)之間的相互作用,，這些共同決定了ecDNA的轉(zhuǎn)錄輸出。

ecDNA樞紐

在間期,，細(xì)胞核在空間上被組織成一個分區(qū)結(jié)構(gòu),，轉(zhuǎn)錄活性位點向核內(nèi)部聚集,。富含RNA聚合酶II（RNAPII）的核室充當(dāng)轉(zhuǎn)錄工廠,。ecDNA的轉(zhuǎn)錄激活狀態(tài)可能有助于ecDNA簇的形成，并表明ecDNA利用類似原理形成核聚集體,，并可能與其他ecDNA共享轉(zhuǎn)錄機制（圖5a）,。

溴脫氧核糖核酸和末端外結(jié)構(gòu)域4（BRD4）蛋白積累在轉(zhuǎn)錄活性調(diào)控元件上以促進(jìn)基因表達(dá)，在ecDNA中樞形成中起著重要作用,。BRD4抑制是依賴于癌基因MYC的癌癥的一種治療策略,，有趣的是，ecDNA陽性細(xì)胞中BRD4的抑制導(dǎo)致了含有ecDNA的MYC和編碼其他基因的ecDNA的中樞的分散,，以及減少cargo基因表達(dá),。盡管相對于線性基因組而言，單個ecDNA分子和ecDNA樞紐優(yōu)先與RNAPII相關(guān),，但在ecDNA樞紐中RNAPII分子相對更豐富,，進(jìn)一步證實了ecDNA樞紐在轉(zhuǎn)錄調(diào)控中的作用。RNAPII的抑制不會破壞ecDNA中樞,，這表明RNAPII可能在其形成后被招募到ecDNA,。

綜上所述，這些結(jié)果表明，ecDNA中樞是生物學(xué)上相關(guān)的核體,，在癌基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用,，因此可能影響癌癥的維持和進(jìn)展。

反式轉(zhuǎn)錄調(diào)控

ecDNA還與線性基因組物理接觸,，特別是與轉(zhuǎn)錄活躍的染色體區(qū)域,，這反映在ecDNA-染色體相互作用組中RNAPII和H3K27ac信號的富集上。因此,，與未連接到ecDNA的區(qū)域相比,，具有高ecDNA-染色體接觸頻率的區(qū)域的基因表達(dá)增加（圖5b）。因此,，共擴增ecDNA增強子調(diào)節(jié)同一ecDNA上癌基因的調(diào)節(jié)功能可能延伸到染色體基因,，尤其是癌基因。

ecDNAs作為移動增強子的這一有趣的新興功能創(chuàng)造了轉(zhuǎn)錄的合成非整倍體效應(yīng),，與整個染色體或染色體臂的拷貝數(shù)增加如何增加所有常駐基因的表達(dá)水平相當(dāng),。它還為為什么ecDNA通常包含非編碼染色體DNA提供了額外的解釋，并可能解釋了僅包含調(diào)控元件而不包含基因的ecDNA的反調(diào)控功能,。此外,，這種反式激活劑模型提供了一種次要但潛在重要的機制，通過該機制ecDNA可以在染色體轉(zhuǎn)錄水平上快速促進(jìn)腫瘤內(nèi)異質(zhì)性,。然而,，ecDNA與特定染色體區(qū)域的親和力以及ecDNA-染色體相互作用組形成的詳細(xì)過程仍有待發(fā)現(xiàn)。

結(jié)論和展望

治療靶向的機會

許多致癌基因通過擴增被激活,，包括癌細(xì)胞中特有的外周DNA,。主要的治療策略是直接抑制這些擴增癌基因的蛋白產(chǎn)物。這種方法對于編碼蛋白激酶的癌基因尤其成功,。例子包括用于治療HER2陽性乳腺癌的抗HER2單克隆抗體曲妥珠單抗,，以及被批準(zhǔn)用于治療攜帶EGFR擴增的非小細(xì)胞肺癌的小分子阿法替尼。然而,，大多數(shù)通過局部擴增激活的癌基因,，包括ecDNA，不是激酶,。

長期以來,，以MYC、TERT和MCL1等頻繁擴增的基因為靶點一直被認(rèn)為是遙不可及的,。干擾ecDNA的維持,、傳播、結(jié)構(gòu)或功能可提供抑制癌基因激活的機會,，甚至可防止ecDNA介導(dǎo)的靶向治療耐藥性,。在理想情況下,，單一藥物有可能改善多種癌癥類型的預(yù)后，而不管擴增的癌基因是什么,，只要結(jié)構(gòu)是染色體外的,。ecDNA的獨特特征—它們的復(fù)制、分離,、聚集成中心,、微核的發(fā)生和排出—提供了至少五種潛在的治療策略，如下文所述和圖6所示,。

策略1：靶向ecDNA復(fù)制

DNA復(fù)制始于雙螺旋被螺旋酶解旋,。有95種人類DNA螺旋酶，每種都具有DNA或RNA結(jié)構(gòu)特異性,。ecDNA復(fù)制可能受到獨特的螺旋酶活性的影響,，如通過特定螺旋酶進(jìn)行線粒體DNA復(fù)制。另一種選擇包括干擾脫氧核糖核酸三磷酸DNA的從頭合成,，以限制核苷酸生產(chǎn),。核糖核苷酸還原酶是染色體DNA復(fù)制的限速酶，可以使用吉西他濱或羥基脲作為靶點,。ecDNA特異性復(fù)制酶是否存在目前尚不清楚,。

策略2：針對ecDNA分離

復(fù)制后，ecDNA可能在染色體DNA上分離到子細(xì)胞,。目前尚不清楚是什么使ecDNA能夠附著到染色體上,。更好地理解ecDNA分離可能提供了調(diào)節(jié)該過程的機會。

策略3：將ecDNA集群定位到中心

特定的ecDNA功能,，如ecDNA中樞形成,，可能在藥理學(xué)上受到干擾，從而降低ecDNA cargo的轉(zhuǎn)錄和活性,，例如通過靶向BET蛋白BRD4,。

策略4：以ecDNA為靶點

顯色三倍體和其他DNA斷裂事件后的DNA修復(fù)導(dǎo)致ecDNA形成。DNA損傷修復(fù)過程的擾動,，如同源重組和非同源末端連接，可能對受益于ecDNA擴增的腫瘤不利,，并可能與其他DNA損傷治療（如放療）結(jié)合最有效,。

策略5：靶向ecDNA微核

最后，通過目前未知的分子機制,，ecDNA比染色體DNA更容易被微核排出和消除,，羥基脲也促進(jìn)了這一過程。微核化可能會阻止捕獲的ecDNA的DNA修復(fù),，從而使ecDNA容易受到電離輻射等DNA損傷策略的影響,。對參與微核排出的分子途徑的深入分析可能揭示新的治療靶點,。

治療性ecDNA靶向的挑戰(zhàn)

盡管ecDNA導(dǎo)向的藥物開發(fā)有機遇，但仍存在一些復(fù)雜因素：

首先,，很明顯,，它們在大小和結(jié)構(gòu)復(fù)雜性等不同性質(zhì)上有所不同。這種分子異質(zhì)性可能意味著需要不同的策略來靶向ecDNA的不同亞類,；

第二個潛在的復(fù)雜因素是我們關(guān)于ecDNA克隆性的數(shù)據(jù)有限,。與酪氨酸激酶抑制劑類似，靶向亞克隆ecDNA可為缺乏ecDNA的細(xì)胞創(chuàng)造生長優(yōu)勢,，并推動快速克隆選擇和治療抗性,；

第三，目前對ecDNAs重新整合到基因組的能力缺乏了解,。整合可能隨機發(fā)生在DNA損傷部位,，這提供了另一條可能限制治療效果的軌跡，因為ecDNA可能作為耐藥性機制重新整合,，然后在治療取消后重新出現(xiàn)在染色體外,；

最后，靶向位于細(xì)胞核中的分子需要能夠穿過多個細(xì)胞膜和內(nèi)體逃逸,，從而增加了化學(xué)生物學(xué)的復(fù)雜性,。填補這些知識空白對于最大限度地實現(xiàn)成功的抗ecDNA治療至關(guān)重要。由于多種機制可能有助于ecDNA的生成,、維持和進(jìn)化,，因此本綜述中討論的單一機制可能不足以成功治療攜帶癌癥的ecDNA。

此外,，鑒于癌癥的異質(zhì)性,，一刀切的方法可能無法奏效，ecDNA驅(qū)動的癌癥亞類對上述治療方法的敏感性不同,。然而,，作者認(rèn)為降低ecDNA頻率可以降低ecDNA驅(qū)動的治療抵抗風(fēng)險，從而提高治療效果,，最終延長患者生存期,。

見解

正如作者所指出的，人們在表征外周DNA的獨特序列和染色質(zhì)組成方面取得了重要進(jìn)展,。關(guān)于這些特性的許多問題仍然沒有答案,。例如，導(dǎo)致ecDNA上染色質(zhì)緊密性改變的分子機制仍然未知,，ecDNA與其他ecDNA和染色體DNA的相互作用是如何形成的,。未來對這些機制的研究不僅有可能揭示新的生物學(xué)特性，還可能揭示可能作為治療靶點的因素,。

此外,，使用新的單細(xì)胞方法進(jìn)行的研究有望對ecDNA細(xì)胞間異質(zhì)性和結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系產(chǎn)生重要的新見解,。最后，許多其他有機體,，如酵母和其他有機體也含有環(huán)狀DNA,，在維持、染色質(zhì)調(diào)節(jié)和復(fù)制等特性方面可能部分類似于ecDNA,，這表明關(guān)于癌癥中ecDNA的一些懸而未決的問題可能只能通過多模型系統(tǒng)中的跨學(xué)科研究方法來解決,。因此，為了充分發(fā)揮ecDNA的潛力,，改善ecDNA驅(qū)動的癌癥患者的治療和診斷,，需要對ecDNA相關(guān)研究進(jìn)行持續(xù)的研究。

教授介紹

Roel Verhaak博士是杰克遜基因組醫(yī)學(xué)實驗室的計算生物學(xué)教授和副主任,。他參與并共同領(lǐng)導(dǎo)了癌癥基因組圖譜（TCGA）的膠質(zhì)瘤項目,，同時在哈佛大學(xué)和麻省理工學(xué)院以及德克薩斯大學(xué)安德森癌癥中心工作，這項工作有助于提高我們對這種致命腦瘤的認(rèn)識,。他是最早認(rèn)識到癌癥中染色體外DNA擴增的頻率和潛力的人之一,。Roel的研究主要集中在腦腫瘤上，主要利用對空前規(guī)模和復(fù)雜性的數(shù)據(jù)集的計算分析,。Roel的研究重點是分析癌癥基因組數(shù)據(jù),，以提高我們對癌癥生物學(xué)的理解。他對理解腦腫瘤的疾病進(jìn)展以及研究染色體外DNA擴增在癌癥中的作用有著專門的研究興趣,。他的團(tuán)隊將功能建模的方法與大型數(shù)據(jù)集和計算方法相結(jié)合,。

參考文獻(xiàn)

Yi E, Chamorro González R, Henssen AG, Verhaak RGW. Extrachromosomal DNA amplifications in cancer. Nat Rev Genet. 2022;10.1038/s41576-022-00521-5. doi:10.1038/s41576-022-00521-5

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