1.KRAS突變型與KRAS野生型結(jié)直腸癌的分子比較

作者總結(jié)了每個節(jié)點的KRAS激活信號通路和相關(guān)抑制劑（圖1A）,。一旦KRAS發(fā)生突變，KRAS中內(nèi)在的GTP-GDP循環(huán)就會被破壞,，從而使突變的KRAS蛋白在活性狀態(tài)下積累,，從而組成性地激活下游的MAPK和PI3K信號級聯(lián)，從而導(dǎo)致細胞增殖和存活,?？蛑辛谐龅母鞣NKRAS抑制劑是針對KRAS信號通路的每個節(jié)點開發(fā)的，然后在臨床前或臨床研究中進行評估（圖1A）,。Kaplan-Meier生信分析表明,，通過全外顯子組測序鑒定的KRAS突變組的結(jié)果較差（圖1B），在調(diào)整年齡,、性別,、臨床分期和MSI狀態(tài)后，該關(guān)聯(lián)在多因素回歸模型中仍然顯著（圖1C）,。為了獲得對KRAS突變體(Mut)和KRAS野生型(WT)組不同臨床結(jié)果的機制見解,，作者基于轉(zhuǎn)錄組表達譜進行了基因集富集生信分析(GSEA)。KRAS-Mut組在腫瘤中的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和Wnt信號通路等致癌信號通路中表現(xiàn)出更高的富集（圖1D）,。然而,，KRAS-WT組主要在基因組中表現(xiàn)出富集趨化因子受體結(jié)合趨化因子、淋巴和非淋巴細胞之間的免疫調(diào)節(jié)相互作用、PD-1信號傳導(dǎo)等,，表明免疫激活更強（圖1D）,。作者還利用蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)來識別差異調(diào)節(jié)與腫瘤惡性表型相關(guān)的IGFBP2和KRT18在KRAS-Mut亞型中顯著富集，而與中性粒細胞和巨噬細胞相關(guān)的CD177,、MMP1和ARG1在WT亞型中富集,。和來自CPTAC隊列的磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)，并比較了KRAS-Mut與KRAS-WT腫瘤的全球差異調(diào)節(jié),。

圖1 KRAS-Mut與野生型結(jié)直腸癌的分子比較

越來越多的證據(jù)集中在與腫瘤發(fā)生和免疫逃避有關(guān)的基因組突變,，并在癌癥進化過程中賦予選擇性優(yōu)勢。作者首先比較了KRAS-Mut與KRAS-WT中的腫瘤突變負荷,，并觀察到TCGA和CPTAC隊列沒有差異,。隨后進一步比較了KRAS-Mut和KRAS-WT樣本中的體細胞拷貝數(shù)改變(SCNA)和非整倍性評分。在染色體水平上,，KRAS-Mut腫瘤比WT腫瘤表現(xiàn)出較低程度的臂級SCNA,，且改變主要集中在chr5q、chr9q和chr12（圖1F）,。此外,，作者觀察到KRAS-Mut與WT腫瘤相比，非整倍性評分（腫瘤中手臂水平增益和損失的總數(shù)）顯著降低（圖1G）,。使用體細胞相互作用函數(shù),，作者進行了成對的Fisher精確檢驗，以檢測KRAS突變與CRC中最常見的25個突變基因之間的關(guān)系（圖1H）,。ARID1A和ACVR2A突變與腫瘤中的KRAS突變相互排斥,，進一步表明CRC的遺傳畸變,。

2. 分析KRAS-Mut結(jié)直腸癌的單細胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)格局

大量研究表明,，TME在腫瘤進展和免疫逃逸中起著至關(guān)重要的作用，并對免疫治療的反應(yīng)產(chǎn)生影響,。作者利用基于大量RNA-seq數(shù)據(jù)的xCell算法來量化基質(zhì)和免疫細胞浸潤,，并研究了CRC中細胞亞群的變化。具有KRAS突變的腫瘤以上皮細胞和Treg細胞增加為特征,，而KRAS-WT腫瘤以CD4T細胞,、巨噬細胞、pDC等為特征（圖2A）,。

圖2 分析KRAS-Mut結(jié)直腸癌的單細胞轉(zhuǎn)錄組圖譜

為了更準確地描繪KRAS-MutCRC的細胞亞群景觀,，作者從SMC和KUL數(shù)據(jù)集中收集并整理了10x單細胞RNA-seq轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，并通過互惠PCA工作流程將它們整合到組合的scRNA-seq數(shù)據(jù)集中,。最后,，共獲得來自16個KRAS-WT和13個KRAS-Mut結(jié)直腸腫瘤的55539個單細胞，并通過Seurat4.0進行生信分析,。作者采用基于圖形的聚類方法基于PCA空間中的歐幾里得距離,，并使用Louvain算法進行模塊化優(yōu)化,，以將CRC細胞聚類成具有差異表達特征的29個簇。通過基于標記的注釋鑒定出六種主要細胞類型,，即淋巴細胞/漿細胞,、上皮細胞、成纖維細胞/內(nèi)皮細胞,、骨髓細胞,、T/自然殺傷（NK）/NKT淋巴細胞和肥大細胞（圖2B）。作者發(fā)現(xiàn),，基于卡方檢驗,，KRAS-Mut與KRAS-WT腫瘤中T細胞、B細胞,、骨髓細胞和基質(zhì)細胞的分布存在顯著差異（圖2B）,，因此，作者提取了四種主要的細胞類型,，并進一步將它們細分為特定的細胞亞群,。作者采用與上述相同的工作流程，將T細胞,、B細胞,、骨髓細胞和基質(zhì)細胞分別分為8個、5個,、8個和11個亞群（圖2C）,。比較分析顯示，KRAS-WT腫瘤中CD4T細胞,、CD8T細胞和調(diào)節(jié)性T細胞的細胞亞群分布顯著升高,，而IgG漿細胞（B細胞）、SPP1巨噬細胞（骨髓細胞）和肌成纖維細胞（基質(zhì)細胞）在KRAS-Mut腫瘤中顯著增加（圖2C,、D）,。

3. 識別KRAS-Mut亞群的分子亞型

作者進一步整合了來自CPTAC數(shù)據(jù)集的公開可用的轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù),，以研究KRAS-Mut腫瘤的共識分子亞型和治療脆弱性（圖3A）,。基于三種組學(xué)類型的無監(jiān)督聚類使用相似性網(wǎng)絡(luò)融合(SNF)方法對數(shù)據(jù)進行生信分析,，并將KRAS突變CRC分為兩個穩(wěn)健的子集（KM1和KM2,，圖3B）。無監(jiān)督聚類也應(yīng)用于每個單獨的組學(xué)數(shù)據(jù)層,，并顯示僅來自轉(zhuǎn)錄組,、蛋白質(zhì)組或磷酸化蛋白質(zhì)組的子集的平均輪廓寬度小于來自集成多組學(xué)的子集（圖3C），這表明整合三種組學(xué)數(shù)據(jù)可以更準確地對KRAS-Mut結(jié)直腸癌進行分類。該分析分別在mRNA,、蛋白質(zhì)和磷蛋白水平上鑒定出5種mRNA,、10種蛋白質(zhì)和19種磷蛋白作為亞型特征（圖3D）。進一步探索識別特征在其他在獨立的結(jié)直腸癌數(shù)據(jù)集中,，作者利用TCGA,、CIT和GSE87211隊列中確定的mRNA特征和CCRC隊列中的蛋白質(zhì)特征在KRAS-Mut腫瘤中進行無監(jiān)督聚類。作者進一步比較了CPTAC和TCGA并沒有發(fā)現(xiàn)兩個亞型之間存在統(tǒng)計學(xué)上的顯著差異（圖3E）,。

圖3 通過KRAS-Mut亞群的分子亞型識別結(jié)直腸癌患者的基因組和預(yù)后特征

為了探索亞型特征的潛在臨床效用,，作者比較了兩個分子亞群之間的預(yù)后。CPTAC隊列中的KM1亞型與更好的預(yù)后相關(guān),，并且相對于KM2亞型沒有死亡結(jié)果,，盡管考慮到小樣本量，生存生信分析沒有統(tǒng)計學(xué)意義（圖3G),。作者還比較了獨立隊列中基于KRAS分子亞型的預(yù)后,，并確定在TCGA、CIT,、GSE87211和CCRC隊列中,，KM1亞型與更好的生存率顯著相關(guān)（圖3H）。多因素Cox比例風險回歸生信分析進一步表明,，在調(diào)整臨床病理因素后,，KRAS突變亞型與這些KRAS-Mut樣本中的患者生存結(jié)果相關(guān)。

4. KRAS-Mut結(jié)直腸癌的腫瘤基因組變異

為了進一步了解KRAS突變的結(jié)直腸癌患者的基因組景觀,，作者分析了來自WES-seq和SNP陣列分析的體細胞突變數(shù)據(jù),。在CPTAC和TCGA隊列中進行了SMG生信分析，并比較了KM1,、KM2和KRAS-WT子集中的基因突變頻率,。TCGA和CPTAC隊列的突變譜顯示，ARID1A和BRAF在KRAS-WT亞組中的突變率高于KRAS-Mut亞組（圖4A),。然后,，作者分析了CRC腫瘤中KM1,、KM2和KRAS-WT亞型之間在三核苷酸環(huán)境中發(fā)生的96種可能突變矩陣中的單核苷酸變體(SNV)(圖4B),。

圖4 KRAS-Mut結(jié)直腸癌中的腫瘤基因組圖譜

隨后，作者從基因組數(shù)據(jù)中提取了5個突變特征（圖4C）,，包括SBS15和SBS44,、SBS1的自發(fā)或酶促脫氨、和SBS10b（圖4C）,。歸因于SBS44特征的突變計數(shù)顯示KRAS-WT腫瘤顯著增加,，而SBS15特征顯示KM1亞型顯著減少（圖4D）。作者還分析了KM1和KM2亞組的SCNA水平，發(fā)現(xiàn)KM1腫瘤明顯升高,。Arm級SCNA結(jié)果表明,，chr2、chr5p,、chr7q,、chr8p、chr12和chr16中的細胞帶包含最常擴增或缺失的區(qū)域,。局灶級SCNA顯示KM1亞型2q31.2,、5p15.33、7q36.3和KM2亞型12p13.33的細胞帶包含明顯放大的局灶區(qū),，KM1亞型的16p13.3和KM2亞型的1p35.3-36.32,、8p11.22、18q11.2的細胞帶包含頻繁缺失的區(qū)域（圖4E）,。CNA的基因組改變促成了KRAS突變亞型的分子異質(zhì)性,。

5. 以特定臨床特征和分子過程為特征的KRAS突變模式

在CRC腫瘤中進一步探討了KRAS突變模式與臨床特征和分子亞型的關(guān)系。KRAS突變亞型的前50個差異表達的mRNA轉(zhuǎn)錄物,、蛋白質(zhì)和磷蛋白顯示在熱圖中（圖5A）,。有趣的是，所有MSI陽性腫瘤都聚集在KRAS-WT亞組中,，并導(dǎo)致高突變表型,、MSI和免疫相關(guān)CMS1轉(zhuǎn)錄組亞型以及BRAF和ARID1A突變的聚集。KM2與晚期腫瘤分期,、間充質(zhì)表型,、CMS4轉(zhuǎn)錄組亞型、ProS-C蛋白質(zhì)組亞型和免疫亞型2相關(guān)（圖5B）,，這表明間質(zhì)浸潤,、血管生成和更糟預(yù)后。KM1亞型主要表現(xiàn)為腫瘤早期,、CIN表型,、上皮和代謝相關(guān)的CMS3轉(zhuǎn)錄組亞型、ProS-E蛋白質(zhì)組亞型和免疫亞型1（圖5B）,，這表明上皮特征和更好的生存結(jié)果,。在TCGA隊列中也得到了類似的結(jié)果（圖5C)。

圖5 以特定臨床特征和分子過程為特征的KRAS-Mut模式

作者進一步分析了腫瘤生物學(xué)特征以探索KRAS-Mut亞群中具有代表性的免疫和癌癥相關(guān)過程,。在前六個差異分子特征中,，KM2子集在CPTAC中表現(xiàn)出最高的巨噬細胞、MDSC,、缺氧特征,、EMT特征,、Pan-F-TBRs和基質(zhì)評分富集，其次是KM1子集和KRAS-WT子集隊列（圖5D）,。作者還在TCGA隊列中進行了相同的生信分析并獲得了相似的結(jié)果,。KM2的特征是活化樹突細胞(aDCs)、脂肪細胞,、星形膠質(zhì)細胞,、M2巨噬細胞、間充質(zhì)干細胞(MSCs)等的增強,，而KM1亞群以記憶B細胞和NK細胞為特征（圖5E）,。

6. 通過蛋白質(zhì)組學(xué)和磷酸蛋白質(zhì)組學(xué)分析KRAS突變模式的功能注釋

接下來，為了進一步闡明KRAS突變亞型的生物學(xué)意義,，作者在KM1和KM2腫瘤亞群的RNA,、蛋白質(zhì)和磷蛋白水平上進行了ssGSEA/轉(zhuǎn)錄后修飾(PTM)和Metascape生信分析。RNA和蛋白質(zhì)水平的通路富集表明,，KM1主要富集在過氧化物酶體,、MYC靶點和Wntβ-連環(huán)蛋白通路中，而KM2主要富集在EMT,、凝血,、血管生成、KRAS信號上調(diào)和肌生成過程中（圖6A）,。磷蛋白數(shù)據(jù)集的PTM生信分析顯示,，KM2的特征是PKACA、VEGF,、PI3K(LY-294002)和JAK(tofacitinib)的激酶活性上調(diào),，而KM1腫瘤的特征是MEK、PI3K的藥物靶點/mTOR（dactolisib）和紫杉醇,。此外,，EMT過程的代表性蛋白（COL3A1、VIM,、ECM1和LAMC1）和血管生成途徑（POSTN,、VCAN和ITGAV）在KM2亞型中顯著過表達（圖6B）。然而,，RBM15和HNRNPM以及RFC4和CDK11B在KM1亞型中明顯過表達（圖6B）,。然后，作者比較了CPTAC隊列中KM1和KM2亞組中磷酸化位點的表達,。作者發(fā)現(xiàn)粘附信號相關(guān)磷酸化位點FLNA-S1630和MYO1F-S1023以及間充質(zhì)表型相關(guān)位點VIM-S5,、COL1A1-S176和TFB1I1-S143的磷酸化在KM2亞組中顯著上調(diào),。此外,，在KM1亞組中,，酪氨酸蛋白激酶受體EPHB2-S776和細胞周期相關(guān)蛋白CDK11A-S577和CDK13-S432的水平顯著升高（圖6C）。然后,，作者進行了基于差異磷酸化位點的途徑和過程富集生信分析作者發(fā)現(xiàn)許多途徑和功能顯著富集,，例如基于肌動蛋白絲的過程，粘著斑和RhoGTPases的信號傳導(dǎo),，并且這些功能和途徑中的大部分是介導(dǎo)的通過KRAS亞型（圖6D）,。

圖6 通過磷酸化蛋白質(zhì)組分析對KRAS-Mut亞型進行功能注釋

7. 揭示KRAS-Mut結(jié)直腸癌的亞群特異性療法

為了探索KRAS-Mut亞型在CRC中的潛在脆弱性，作者在癌癥依賴圖(DepMap)數(shù)據(jù)集中比較了基于大規(guī)模RNAi篩選的結(jié)直腸癌細胞系之間的基因依賴關(guān)系,。41個KRAS突變的CRC細胞系被整理并分類為KM1或KM2子集,。作者確定了31個基因在KM1和KM2子集之間具有顯著不同的分數(shù)（圖7A），作者將13個基因確定為子集特異性癌癥依賴性基因（圖7B）,，其中,，KM2亞型包括PI3K/AKT信號相關(guān)的ZFP36L1和VEGF信號相關(guān)的COL5A1和TLN1，KM1亞型具有細胞周期/有絲分裂依賴性CCNB3,、RAD21和核心Wnt信號分子CTNNB1,。

圖7 分子特征與藥物敏感性之間的相關(guān)性揭示了KRAS-Mut結(jié)直腸癌的亞群特異性藥物

為了進一步確定KRAS突變CRC亞型的亞群特異性治療劑，作者應(yīng)用了三個藥物反應(yīng)數(shù)據(jù)庫（CTRP-v2,、PRISM和GDSC1）來研究KM1和KM2細胞亞群的潛在治療劑（圖7C）,。進行KM1和KM2亞組之間的差異藥物反應(yīng)生信分析，以確定每組中估計AUC值較低的特定化合物,。這些分析產(chǎn)生了8個CTRP衍生化合物（KM13個,，KM25個）和10個PRISM衍生化合物（KM17個，KM23個）和11個GDSC衍生化合物（圖7C）,。隨后進行了多視角生信分析以研究這些化合物在CRC中的治療潛力,。KM2亞型的6種化合物和KM1亞型的3種化合物的CMap評分低于90（圖7D）。作者進一步比較了候選藥物靶點的蛋白質(zhì)表達模式,，并檢索了實驗和臨床證據(jù)以過濾潛在藥物（圖7D）,。此外，氟尿苷和CDKi在KM1CRC患者中具有良好的治療潛力,。作者還探索了與每個KRAS亞型中對MEKi,、ERKi或AKTi的敏感性高度相關(guān)的潛在基因調(diào)節(jié)因子，這可能是對這些抑制劑反應(yīng)的潛在指標,。最后,，作者生成了一個示意圖，總結(jié)了KRAS-Mut亞型中的信號通路,，以概述作者在KRAS-突變型CRC中的發(fā)現(xiàn)（圖7E）,。