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題目：The apple FERONIA receptor-like kinase MdMRLK2 negatively regulates Valsa canker resistance by suppressing defence responses and hypersensitive reaction

刊名：MOLECULAR PLANT PATHOLOGY

作者：Yuanyuan Jing, Changhai Liu et al.

單位：Northwest A&F University

日期：12 April 2022?

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摘要

由真菌Valsa mali引起的潰瘍病是中國(guó)和其他東亞國(guó)家蘋果樹最具破壞性的病害之一。植物激酶受體 FERONIA 參與植物細(xì)胞的生長(zhǎng),、發(fā)育和免疫,。然而，關(guān)于 FERONIA 在蘋果防御V中的功能知之甚少,。在本研究中,，我們發(fā)現(xiàn)MdMRLK2在易感病蘋果的枝條中被病菌高度誘導(dǎo)，但在抗性品種的枝條中則沒有,。35S：MdMRLK2蘋果相對(duì)于野生型（WT）植物表現(xiàn)出受損的抗性,。進(jìn)一步分析表明，相對(duì)于野生型,，35S: MdMRLK2蘋果植物在V. mali感染時(shí)脫落酸 (ABA) 水平升高,，水楊酸 (SA) 水平降低。MdMRLK2過表達(dá)還抑制多酚積累,，并抑制感染期間苯丙氨酸解氨酶 (PAL),、β-1,3-葡聚糖酶 (GLU) 和幾丁質(zhì)酶 (CHT) 的活性。此外,，MdMRLK2 與 MdHIR1（一種過敏誘導(dǎo)的反應(yīng)蛋白）相互作用,，并抑制 MdHIR1 介導(dǎo)的過敏反應(yīng) (HR)，可能是通過損害 MdHIR1 自身相互作用,?？偟膩?lái)說(shuō)，這些發(fā)現(xiàn)表明MdMRLK2的過表達(dá)可能通過（a）改變 ABA 和 SA 水平,，（b）抑制多酚積累,，（c）抑制 PAL、GLU 和 CHT 活性,，以及（d）通過破壞 MdHIR1 自我相互作用來(lái)阻斷 MdHIR1 介導(dǎo)的過敏反應(yīng),。

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主要結(jié)果

3.1 MdMRLK2過表達(dá)負(fù)調(diào)控蘋果對(duì)V. mali的抗性

MRLK2的表達(dá)在M. mellana的枝條中被高度誘導(dǎo)，但在M. yunnaensis的樹枝中沒有被誘導(dǎo)（圖 1a）,，表明它可能在抗性中起負(fù)面作用,。我們檢查了MdMRLK2在V. mali易感栽培品種 Gala-3 (GL-3) 中的表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)MdMRLK2在V. mali感染的葉子和樹枝中被迅速而強(qiáng)烈地誘導(dǎo)表達(dá)（圖 1b,，c）,。為了探索MdMRLK2在蘋果防御V. mali中的作用，我們生成了兩個(gè) 35S：MdMRLK2轉(zhuǎn)基因株系 OE-1 和 OE-2,，其MdMRLK2表達(dá)水平分別增加了 15.2 倍和 19 倍（圖 1d,，e）,。分析了野生型（WT）、OE-1 和 OE-2 蘋果植物中 MdMRLK2 的蛋白質(zhì)水平,，清楚地表明兩個(gè) OE 系表達(dá) MdMRLK2 并且 MdMRLK2 條帶在 OE 系中強(qiáng)于在WT植物（圖 1f）,。此外，我們用V. mali接種了 WT 和 OE 系的葉子和樹枝,。接種三天后，OE系中的病變區(qū)域明顯大于WT植物（圖 1g,，h）,。接種后 5 天（dpi），OE 系中的樹枝病變長(zhǎng)度顯著長(zhǎng)于 WT 植物（圖 1i,，j）,。我們還用V. mali接種了三個(gè)MdMRLK2 RNAi 蘋果愈傷組織系。WT愈傷組織中的病變區(qū)域明顯大于MdMRLK2 RNAi系,，并且基于臺(tái)盼藍(lán)染色,，WT愈傷組織顯示出比MdMRLK2 RNAi系更多的細(xì)胞死亡（ 圖S1 ）。這些結(jié)果表明MdMRLK2在V. mali抗性中起負(fù)調(diào)控作用,。

3.2 MdMRLK2的過表達(dá)增加了蘋果植株的ABA含量,，但降低了蘋果植株對(duì)V. mali感染的SA含量

接下來(lái)測(cè)量了三種在抗病性中起重要作用的激素的含量：ABA、SA 和 JA,。在第 0 天,，WT 和 OE 系之間的 ABA 含量沒有差異，但在 3 dpi 時(shí),，35S：MdMRLK2系的葉片中 ABA 水平比 WT 植物的葉片高 50.2%（圖 2a）,。在樹枝中，與 WT 相比,，OE-1 和 OE-2 植物中的 ABA 水平分別高出 3.6 倍和 3.3 倍（圖 2b）,。相比之下，OE-1 和 OE-2 的葉片 SA 含量分別比 WT 植物低 18.8% 和 26.9%（圖 2c）,，并且樹枝中的 SA 含量顯示出相似的趨勢(shì)（圖 2d）,。植物抗性相關(guān)基因如PR1、PR4,、PR5和PAL在 WT 植物的葉和枝中的表達(dá)水平高于 OE 系（圖 S2）,。35S：MdMRLK2系和 WT 植物之間的 JA 含量沒有顯著差異（圖S3）。為驗(yàn)證 ABA 和 SA 在V. mali抗性中的作用,，在接種V. mali前將 ABA 和 SA 噴灑在葉片上,；與對(duì)照組相比，ABA 處理后的病變區(qū)域明顯更大,，SA 處理后的病變區(qū)域更?。▓D 2e）,。

3.3 MdMRLK2的過表達(dá)降低了蘋果植株在V. mali感染后多酚含量

植物組織中的多酚濃度是植物抗逆性的良好預(yù)測(cè)指標(biāo)。因此,，我們測(cè)定了 WT 和 OE 系的葉和枝中沒食子酸,、阿魏酸、對(duì)香豆酸和綠原酸的含量,。接種V. mali后葉片和樹枝中的多酚含量均增加,，但 WT 中多酚含量的增加明顯高于轉(zhuǎn)基因品系（圖 3a-h）。這一結(jié)果表明,，MdMRLK2在響應(yīng)馬里弧菌感染時(shí)在調(diào)節(jié)多酚積累中起負(fù)調(diào)控作用,。

3.4 MdMRLK2的過表達(dá)抑制蘋果植株病期間的PAL、GLU和CHT活性

進(jìn)行了進(jìn)一步的分析以確定在接種后疾病相關(guān)酶的活性是否增加,。葉的PAL 活性在 WT 植物中顯著增加了 71.7%,，但在 OE-1 中僅增加了 62.2%，在 OE-2 中增加了 48.6%（圖 4a）,。同樣,，WT 樹枝中的 PAL 活性分別比 OE-1 和 OE-2 樹枝中的高 27.8% 和 35.7%（圖 4b）。葉片GLU 活性在 WT 植物中增加 2.71 倍,，但在 OE-1 和 OE-2 植物中僅增加 2.0 倍（圖 4c）,，WT 植物中的枝條 GLU 活性是 OE 系的 1.5 倍（圖 4d） . 在V. mali之后，WT 植物的葉子和樹枝中的 CHT 活性比 OE 系增加的程度更大感染（圖 4e,，f）,。

3.5 MdMRLK2與MdHIR1相互作用，限制了MdHIR1介導(dǎo)的HR

為了探索 MdMRLK2 降低植物抗病性的分子機(jī)制,，我們進(jìn)行了酵母雙雜交 (Y2H) 篩選,，發(fā)現(xiàn) MdMRLK2 靶向過敏誘導(dǎo)的反應(yīng)蛋白 1 (MdHIR1) (圖 5a )。雙分子熒光互補(bǔ) (BiFC) 測(cè)定證實(shí)了它們的相互作用 (圖 5b ),。當(dāng) MdMRLK2-cYFP 和質(zhì)膜定位的水通道蛋白 MdPIP2-nYFP 共表達(dá)時(shí),，在黃色熒光蛋白 (YFP) 通道中未觀察到熒光信號(hào)（圖 S4）。我們還在本氏煙草中進(jìn)行了熒光素酶互補(bǔ)測(cè)定; MdMRLK2-cLUC 和 MdHIR1-nLUC 的共表達(dá)重構(gòu)了熒光素酶活性,，cLUC 與 nLUC,、MdMRLK2-nLUC 與 cLUC 和 MdHIR1-nLUC 與 cLUC 的表達(dá)用作陰性對(duì)照（圖 5c）。共免疫沉淀測(cè)定還表明 MdMRLK2 與 MdHIR1 相互作用（圖 5d）,。亞細(xì)胞定位分析表明 MdHIR1 定位于質(zhì)膜（圖 S5）,。此外，MdHIR1在葉子和樹枝中的相對(duì)表達(dá)被證明對(duì)V. mali感染有反應(yīng)（圖 6a,，b）,。

我們假設(shè) MdMRLK2 與 MdHIR1 的結(jié)合可能會(huì)干擾 MdHIR1 介導(dǎo)的 HR。為了驗(yàn)證這一假設(shè),，我們?cè)诒臼蠠煵莺吞O果葉中共同表達(dá) 35S：GFP（綠色熒光蛋白）和 35S：MdHIR1-GFP和 35S：MdMRLK2-GFP和 35S：MdHIR1-GFP ,。有趣的是,，35S: MdMRLK2-GFP與 35S: MdHIR1-GFP的共表達(dá)限制了 MdHIR1 介導(dǎo)的過敏反應(yīng)，并且在本氏煙和蘋果（圖 6c,、d和7a）中共表達(dá) 35S: MdMRLK2-GFP和 35S: MdHIR1-GFP比在兩個(gè)N中共同表達(dá) 35S：GFP和 35S：MdHIR1-GFP（葉子的左側(cè)）的葉子中 HR 區(qū)域明顯更?。ㄈ~子的右側(cè)）。然后我們測(cè)量了過表達(dá) MdHIR1的本氏煙和蘋果葉中活性氧 (ROS) 的積累,。正如我們預(yù)期的那樣,，MdHIR1誘導(dǎo)的 ROS 積累在共表達(dá) 35S：MdMRLK2-GFP和 35S：MdHIR1-GFP（葉右側(cè)）的葉子中比在共表達(dá) 35S：GFP和 35S：MdHIR1的葉子中低得多（圖 6e和7b，c）,。此外,，臺(tái)盼藍(lán)染色顯示，表達(dá) 35S: MdMRLK2-GFP 和 35S: MdHIR1-GFP 的本氏煙葉比表達(dá) 35S: MdHIR1-GFP和 35S: GFP的葉細(xì)胞死亡少（圖 6f）,。為了測(cè)試MdHIR1在蘋果與病原菌相互作用期間的功能，我們?cè)谔O果葉上接種了病原菌,，它們共同表達(dá) 35S：GFP與 35S：MdHIR1 -GFP和 35S：MdMRLK2-GFP與 35S：MdHIR1-GFP,。共表達(dá) 35S：MdMRLK2-GFP 和 35S：MdHIR1-GFP 的葉片區(qū)域比共表達(dá)35S：GFP和 35S：MdHIR1-GFP的葉片區(qū)域具有更大的病變（圖 7d）?？傊?，這些結(jié)果表明MdHIR1正向調(diào)節(jié)植物對(duì)病原菌抗性。MdMRLK2 和 MdHIR1 之間的相互作用限制了 MdHIR1 介導(dǎo)的 HR,，并分別降低了在本氏煙草和蘋果的葉子中對(duì)病原菌的抗性,。

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結(jié)論

我們發(fā)現(xiàn)MdMRLK2過表達(dá)通過抑制 HR ，改變激素和多酚水平降低了蘋果的 潰瘍病抗性（圖 9）,。激素和多酚水平在植物抗性中起重要作用,。在接種V.mali之后 ，與 WT 相比,， 過表達(dá)MdMRLK2的蘋果植物具有更高的 ABA 和更低的 SA 水平,，減少了多酚的積累，以及更低的 PAL,、GLU 和 CHT 活性,。MdMRLK2 和 MdHIR1 之間存在直接相互作用。此外,，MdMRLK2 損害了 MdHIR1 的自我相互作用并限制了 MdHIR1 介導(dǎo)的 HR,。總體而言,，我們的研究結(jié)果揭示了蘋果 FERONIA 受體激酶 MdMRLK2 在防御蘋果潰瘍病方面的新功能,。

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原文鏈接：

https://bsppjournals.onlinelibrary./doi/10.1111/mpp.13218

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