免疫檢查點抑制劑為尿路上皮癌（UC）患者的治療帶來了新的希望,，目前已有多種候選免疫生物標記物，例如PD-L1的表達和腫瘤突變負荷(TMB),，可以用于預(yù)測UC免疫治療的反應(yīng),。然而，這些生物標志物并不完善,，缺乏足夠的臨床應(yīng)用預(yù)測能力,。為了更好地了解UC中的免疫治療反應(yīng)，需要全面概述腫瘤免疫微環(huán)境,，包括三級淋巴結(jié)構(gòu)(TLS),。特別是UC腫瘤免疫微環(huán)境中的免疫細胞與TLS之間復(fù)雜的相互作用仍然知之甚少，這阻礙了新型癌癥免疫療法以及免疫療法反應(yīng)的預(yù)測性生物標志物的發(fā)現(xiàn)和開發(fā),，因此迫切需要更好地表征腫瘤免疫環(huán)境,。

來自荷蘭腫瘤研究所的團隊使用HALO平臺對多重免疫熒光染色的腫瘤切片進行了全景觀分析，以表征未經(jīng)預(yù)處理的腫瘤和術(shù)前抗PD1/CTLA-4檢查點抑制劑的腫瘤中不同腫瘤區(qū)室中的免疫細胞亞群,。

1  UC患者腫瘤內(nèi)免疫細胞亞群的異質(zhì)性分析
為了綜合評估UC患者腫瘤免疫微環(huán)境,，對僅進行前期膀胱切除術(shù)而未進行治療（n=32）和使用CTLA-4/PD-1抑制劑治療（n=24）的患者的腫瘤組織切片進行了多重熒光免疫組化染色（CD3、CD8,、FoxP3,、CD68、CD20,、PanCK,、DAPI）,。在分析中，使用HALO注釋工具將腫瘤區(qū)域分割成不同的感興趣區(qū)域,，以便對這些不同區(qū)域內(nèi)的免疫細胞進行綜合性的對比評估（圖1A）,。在使用HALO進行分析中，分別對腫瘤中心（Central tumor）內(nèi)的腫瘤（Tumor）和間質(zhì)（Stroma）區(qū)域的免疫細胞進行量化（腫瘤和間質(zhì)區(qū)域使用基于機器學(xué)習(xí)的HALO組織分型算法實現(xiàn)自動化的分割）,，并對方形空格內(nèi)（Tumor Tile）的免疫細胞進行空間采樣（Tumor Tile的劃分使用HALO高級注釋工具進行自動化分割）,，用以評估腫瘤內(nèi)免疫亞群的異質(zhì)性。
 
圖1未經(jīng)治療的尿路上皮癌表現(xiàn)出異質(zhì)免疫細胞浸潤,。A) 通過HALO平臺對未治療的UC中感興趣的注釋區(qū)域（腫瘤中心-藍色、腫瘤中心方格區(qū)域-黃色,、腫瘤邊緣-紅色,、TLS-綠色）示例以及對應(yīng)的H&E染色圖像；B) 未經(jīng)治療的UC隊列腫瘤中心（紅色）,、腫瘤邊緣（綠色）以及方格（小提琴圖）區(qū)域免疫亞群的密度及分布,；C) 在腫瘤中心區(qū)域分類的腫瘤和間質(zhì)區(qū)域內(nèi)以及腫瘤邊緣T細胞亞群的相對豐度；D) 在腫瘤中心區(qū)域分類的腫瘤和間質(zhì)區(qū)域內(nèi)以及腫瘤邊緣免疫細胞的密度對比,；E）復(fù)發(fā)（n=19）和非復(fù)發(fā)（n=12）之間腫瘤,、間質(zhì)和腫瘤邊緣免疫亞群細胞密度的對比。

結(jié)果發(fā)現(xiàn),，免疫亞群的中位密度在未治療的腫瘤組中差異很大,，特別是對于B細胞、FoxP3 T細胞和CD8 T細胞（圖1B）,。此外,，在腫瘤中具有低CD8 T細胞比率的腫瘤表現(xiàn)出較高比例的FoxP3 T細胞（圖1C）。對腫瘤中心區(qū)域的腫瘤和間質(zhì)區(qū)域以及腫瘤邊緣之間的免疫細胞密度進行了對比,，發(fā)現(xiàn)腫瘤邊緣的免疫細胞的豐度相對腫瘤中心顯著更高（圖1D）,。在非復(fù)發(fā)性腫瘤中，腫瘤邊緣的CD8 T細胞存在顯著高于復(fù)發(fā)性腫瘤（圖1E）,，而腫瘤和基質(zhì)中存在的免疫細胞并不能預(yù)測未經(jīng)治療的腫瘤的臨床結(jié)果,。綜合上述結(jié)果，可以發(fā)現(xiàn)腫瘤之間的UC免疫景觀是異質(zhì)性的,，并且在UC腫瘤邊緣發(fā)現(xiàn)了明顯的免疫浸潤,。

2  UC患者不同免疫表型中免疫細胞的分布特征
先前有研究根據(jù)CD8+ T細胞的浸潤模式將免疫表型分為免疫炎癥型（immune-inflamed）、免疫豁免型（immune-excluded）及免疫沙漠型（immune-desert）,。這些不同的免疫表型具有預(yù)后相關(guān)性和免疫治療反應(yīng)的預(yù)測價值,。目前，關(guān)于UC中CD8免疫表型中除細胞毒性T細胞外存在不同免疫亞群的知識有限,，而它們的存在可能影響CD8效應(yīng)因子功能和CD8腫瘤免疫的擴展,。因此,，根據(jù)未治療的UC隊列中腫瘤和間質(zhì)和腫瘤邊緣區(qū)域的CD8+ T細胞密度對免疫表型進行分類（圖2A）。
 
圖2 UC免疫表型在腫瘤中心和腫瘤邊緣顯示出不同的免疫細胞豐度和細胞毒性T細胞排斥模式,。A) 通過mIF和CD8 IHC染色對未經(jīng)治療的UC患者進行免疫表型的區(qū)分,；B）復(fù)發(fā)及未復(fù)發(fā)組之間免疫表型的分布；C-E）腫瘤中心區(qū)域的腫瘤（C）,、間質(zhì)（D）及腫瘤邊緣（E）不同免疫表型的免疫亞群的細胞密度對比,。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，多數(shù)UC患者（42%）屬于免疫炎癥性,，但單獨的腫瘤免疫表型并不能評估未治療隊列的復(fù)發(fā)結(jié)果（圖2B）,，盡管被認定為免疫沙漠型的患者表現(xiàn)出較高的復(fù)發(fā)率（87.5%）。對不同免疫表型的腫瘤亞組中免疫成分進行了對比分析,，發(fā)現(xiàn)在腫瘤區(qū)域內(nèi),，免疫炎癥型中免疫細胞密度通常較高，特別是與免疫沙漠型相比,，巨噬細胞的密度顯著更高（圖2C）,；在間質(zhì)區(qū)域內(nèi)，免疫沙漠型中的免疫細胞密度最低,，與其他免疫表型相比,，CD4+ T細胞密度顯著降低（圖2D）；在腫瘤邊緣區(qū)域,，免疫炎癥型的巨噬細胞豐度顯著高于免疫豁免型和免疫沙漠型（圖2E）,。

3  未經(jīng)治療和免疫治療的UC中T細胞耗竭的標志物
耗盡的 CD8 T細胞的特點是效應(yīng)功能受損和免疫抑制檢查點（如 TIM3、LAG3 和 PD1）持續(xù)表達,。鑒于T細胞耗竭作為免疫治療靶點的意義,，在未經(jīng)治療的隊列中使用IHC來檢查 TIM3 和 LAG3 的表達，以及 CD8 和 PD1 的共表達（圖3A-B）,。CD8/PD-1共表達的分析基于HALO Multiplex IHC算法進行自動化的評估,。特別的，在分析中腫瘤和間質(zhì)區(qū)域的識別使用了基于卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)算法的HALO AI進行,，該算法可以更穩(wěn)健的進行算法的訓(xùn)練,，識別圖像中更多的特征，達到更高的準確度,。
 
圖3 未經(jīng)治療和經(jīng)免疫治療的UC中T細胞衰竭的標志物,。A)TIM-3免疫組化染色的代表性腫瘤示例；B)在未治療的UC中CD8（紫色）和PD-1（黃色）雙重免疫組化染色的代表性腫瘤示例,，黑色箭頭標記CD8+&PD-1+ T細胞（紅色）,；C）未治療的UC患者復(fù)發(fā)和無復(fù)發(fā)組之間腫瘤中心內(nèi)腫瘤和間質(zhì)區(qū)域的CD8+&PD-1+ T細胞密度對比；D)未治療和經(jīng)免疫治療的膀胱切除術(shù)患者腫瘤和間質(zhì)區(qū)域內(nèi)CD8+&PD-1+ T細胞密度對比,。

結(jié)果發(fā)現(xiàn),，與TIM-3相比,，LAG-3的表達在未治療的腫瘤中幾乎不存在，CD8+&PD-1+ T細胞明顯存在于未經(jīng)治療的UC中,。經(jīng)過定量分析,，發(fā)現(xiàn)腫瘤和間質(zhì)區(qū)域中CD8+&PD-1+ T細胞的豐度與腫瘤復(fù)發(fā)沒有相關(guān)性（圖3C）。此外,，與未經(jīng)治療的膀胱切除術(shù)相比,，無論治療反應(yīng)如何，CD8+&PD-1+ T細胞均有較高的富集,，而CD8+&PD-1+ T細胞在實現(xiàn)免疫治療CR的腫瘤中分布最高（圖3D）,。總之,，TIM-3在淋巴細胞高度表達,，在膀胱切除術(shù)中，尤其是免疫治療后,，在有反應(yīng)和無反應(yīng)的患者中均發(fā)現(xiàn)了大量的CD8+&PD-1+ T細胞。

4  UC患者TLS的組成與檢查點抑制劑的變化
TLS的存在與未治療和治療的惡性腫瘤的良好臨床結(jié)果密切相關(guān),，而其他研究沒有發(fā)現(xiàn)相關(guān)或免疫抑制TLS功能,。研究假設(shè)TLS免疫成分的異質(zhì)性可能會影響未治療和治療環(huán)境中抗腫瘤免疫和患者的臨床結(jié)果。因此通過7-plex多重熒光免疫組化panel（CD21,、DA-LAMP,、CD23、PNAd,、CD20,、CD3、DAPI）分析TLS的成熟度,。TLS成熟階段由密集CD20+ B細胞區(qū)域中是否存在CD21+濾泡樹突細胞（FDC）和CD23+生發(fā)中心（GC）細胞來定義,。早期TLS（無FDC、無GC）,、原發(fā)性卵泡樣(PFL)TLS（有FDC但無GC）和繼發(fā)性卵泡樣(SFL)TLS的比例被確定為每位患者所有分析的TLS中的分數(shù),。分析中，研究還采用無監(jiān)督學(xué)習(xí)策略對具有不同免疫細胞組成的TLS簇進行了聚類分析,?；赥LS中B細胞、CD4 T細胞,、CD8 T細胞,、FoxP3 T細胞和巨噬細胞的細胞密度（cells/mm2）進行K-Means算法訓(xùn)練，最終獲的tSNE聚類結(jié)果預(yù)測每個TLS子類型,。
 
圖4 尿路上皮癌中顯示出不同的TLS簇,，以及響應(yīng)者和未響應(yīng)者間對TLS組成的治療效果差異,。A）mIHC染色的TLS的示例（1）及對應(yīng)區(qū)域的H&E染色（2），其中肌肉（紅色箭頭）,、脂肪組織（藍色箭頭）和纖維炎癥消退床（黃色箭頭）中形成TLS,。（3）和（4）圖為圖2的放大區(qū)域；B）未經(jīng)治療的UC患者TLS中免疫細胞密度的異質(zhì)性,；C）按復(fù)發(fā)情況進行分組,，TLS內(nèi)免疫細胞亞群的密度對比；D）未經(jīng)治療隊列中患者TLS免疫細胞亞群的聚類圖示,；E）每個TLS簇內(nèi)單位面積內(nèi)免疫細胞亞群的密度,；F）復(fù)發(fā)和未復(fù)發(fā)的UC患者間每個TLS簇的相對面積對比：F）未經(jīng)治療、CR以及治療無反應(yīng)的UC患者TLS簇分數(shù)的比較,。

結(jié)果發(fā)現(xiàn),，總共在未治療的腫瘤中發(fā)現(xiàn)754個TLS聚集體，主要發(fā)現(xiàn)在固有肌層,、脂肪組織和纖維炎癥消退床周圍（圖4A）,。在定量分析中，TLS揭示了異質(zhì)性的免疫細胞組成,，并且TLS的大小在未治療的UC患者中差異巨大（圖4B）,。復(fù)發(fā)組與未復(fù)發(fā)的組之間的TLS中的免疫細胞密度沒有發(fā)現(xiàn)差異（圖4C）。由于關(guān)于TLS免疫結(jié)構(gòu)以及免疫成分如何影響臨床結(jié)果的知識有限,，使用k-means聚類算法根據(jù)免疫細胞密度及其在未治療腫瘤中的相對豐度對TLS進行分組,。發(fā)現(xiàn)在未治療的腫瘤中鑒定了五個不同的TLS簇（圖4D），其特征在于不同豐度的免疫細胞（圖4E）,。在未治療UC中,，各組間TLS豐度未觀察到差異(圖4F)。在免疫治療無應(yīng)答者的患者中,，與未治療腫瘤或免疫治療應(yīng)答者相比,，簇1(FoxP3 T細胞低)TLS顯著富集(圖4G)。此外,，與未治療的腫瘤相比,，在免疫治療(non-CR或CR)腫瘤中，簇5(巨噬細胞低)TLS顯著升高(圖4G),。這些結(jié)果表明,，UC在免疫治療后顯示不同的TLS簇，細胞組成發(fā)生改變,。

5  TLS在不同區(qū)域的分布與免疫細胞的表達
盡管B細胞和TLS富集與良好的臨床結(jié)果和免疫治療反應(yīng)相關(guān),，但其他研究報告沒有正相關(guān)性，這表明B細胞和TLS可能具有相反的作用。研究假設(shè)TLS的一個子集可能與抗腫瘤免疫無關(guān),，特別是在通過經(jīng)尿道切除術(shù)(TUR)獲得的預(yù)處理組織中,。TUR活檢主要收集高度暴露于尿毒素、微生物病原體（尤其是存在膀胱腫瘤的情況下）和炎癥介質(zhì)的淺表組織,。這些TLS可能會使與腫瘤相關(guān)的TLS分析變得模糊,，尤其是在腫瘤的淺表部分。為了檢驗這一點,，研究探討了淺層區(qū)域的TLS組成是否與深層組織區(qū)域的TLS不同,。
 
圖5 不同的TLS模式和T輔助性細胞在尿路上皮癌淺層和深層TLS之間的不同表達。A) 通過mIHC和H&E染色,，在無應(yīng)答的免疫治療患者中,，基線TUR和治療后膀胱切除術(shù)中TLS豐度的示例；B）兩個不同的TUR例子顯示TLS中明顯存在CD4 T細胞,；C）淺層（n=10）和深層TLS（n=30）之間的TLS聚集免疫細胞密度的比較,；D）不同區(qū)域位置（淺層/深層）以及TLS的成熟狀態(tài)間TLS的評分。

結(jié)果發(fā)現(xiàn),，在免疫治療預(yù)處理TUR中觀察到高TLS存在,，特別是在非CR腫瘤中，而TLS豐度在其相應(yīng)的治療后組織中受到限制（圖5A）,。預(yù)處理TUR中的TLS豐度在尿路上皮黏膜下層中特別高（圖5B）,。存在于尿路上皮黏膜下層(淺表TLS)的TLS的特征是明顯的CD4 T細胞存在，而更深的TLS僅顯示有限的CD4 T細胞對免疫細胞組成的貢獻(圖5B),。接下來,，對未經(jīng)治療的UC中的淺層和深層TLS進行分層,，以比較TLS組成和TLS簇的相對豐度,。在未經(jīng)治療的腫瘤中，淺表TLS顯示出顯著更高的CD4 T細胞存在（圖5C）,。最后,，在一個單獨的、更大的隊列（n=40,，涉及來自原始未治療隊列的20名患者）,。在指定TLS成熟度后，發(fā)現(xiàn)與更深的TLS相比,，淺層TLS顯示出更高比例的早期TLS和更低的生發(fā)中心陽性TLS（圖5D）,。綜合上述的研究結(jié)果表明，淺層TLS可能在成分上與深層TLS不同,。這些觀察結(jié)果可能會影響UC中免疫生物標志物的方法,，并為進一步剖析TLS群體和研究它們在UC腫瘤免疫微環(huán)境中抗腫瘤免疫中的確切作用提供理論基礎(chǔ)。
本研究基于多重熒光免疫組化染色，使用HALO平臺全面評估了UC患者腫瘤組織中免疫表型和TLS的組成和空間分布特征,。特別的,，針對不同免疫細胞的密度對TLS進行了聚類分析，發(fā)現(xiàn)與未治療的腫瘤相比,，TLS簇在抗CTLA-4/PD-1ICI治療的腫瘤中顯示出獨特的免疫細胞組成,。此外，根據(jù)TLS在腫瘤組織內(nèi)不同區(qū)域的分布進行了分析,，發(fā)現(xiàn)在淺層組織區(qū)域的TLS群體,，CD4 T細胞表達比深層TLS更明顯?？傊?，該研究結(jié)果對UC中腫瘤免疫景觀進行了更加全面的概述，可為后續(xù)進一步的研究提供基礎(chǔ),。