本文介紹由以色列魏茨曼科學研究所免疫學系的Ido Amit和美國加州大學伯克利分校電氣工程與計算機科學系的Nir Yosef共同通訊發(fā)表在 Nature Biotechnology 的研究成果：大多數(shù)空間轉錄組學技術都受到其分辨率的限制，雖然與單細胞RNA測序的聯(lián)合分析可以緩解這一問題,，但目前的方法僅限于評估離散的細胞類型,，揭示每個位點內(nèi)細胞類型的比例,。為了識別同一類型細胞內(nèi)轉錄組的連續(xù)變異，本文作者利用變分推理開發(fā)了空間轉錄組圖譜的反卷積模型（DestVI）,。經(jīng)實驗證明,，DestVI在估計每個位點內(nèi)每種細胞類型的基因表達方面優(yōu)于現(xiàn)有的方法，DestVI還可以為實驗中的細胞組織提供高分辨率,、準確的空間特征,，并識別不同組織區(qū)域或不同條件之間基因表達的細胞類型特異性變化。

空間轉錄組學(ST)為定義細胞生態(tài)位的組織和調(diào)節(jié)細胞間的相互作用提供了新的機會,。它已被應用于復雜組織的研究,，如小鼠大腦和人類心臟。目前已存在多種用于對組織切片進行ST分析的方法,，盡管這些的分析都具有豐富的數(shù)據(jù),，但也需要自動化和定量的計算分析。為了克服這一限制,，此類數(shù)據(jù)集通常與來自同一組織的單細胞RNA測序 (scRNA-seq) 數(shù)據(jù)集相匹配,。分析這類數(shù)據(jù)集時，首先從scRNA-seq數(shù)據(jù)推斷出一個細胞類型字典,，然后使用線性模型估計每個位點中每種細胞類型的比例,。雖然對scRNA-seq數(shù)據(jù)進行更深層次的聚類可以提供更精細的轉錄組分辨率，但會使反卷積問題更加困難,，結果可能不太準確,。

因此，作者提出了一種用于ST數(shù)據(jù)中細胞類型的多分辨率反卷積的貝葉斯模型（DestVI）,，與其他方法不同,，DestVI使用條件深度生成模型來學習離散的細胞類型特異性圖譜和連續(xù)的亞細胞類型潛在變異。通過這種方式,，它可以恢復細胞類型比例 (CTP) 以及每個位點轉錄狀態(tài)的細胞類型特異性快照,。DestVI具有一個事后分析管道，通過突出空間變化的主軸來幫助指導不同形式的下游分析,。該管道還使用戶能夠使用細胞類型特異性差異表達 (DE) 提取特定組織切片或同一組織內(nèi)不同區(qū)域的分子特征,。

空間轉錄組學的多分辨率反卷積

DestVI使用兩種不同的潛在變量模型 (LVM) 來推斷CTP以及特定細胞類型的連續(xù)子狀態(tài)。DestVI將一對數(shù)據(jù)集作為輸入：來自同一組織的查詢ST數(shù)據(jù)和參考scRNA-seq數(shù)據(jù),，并用細胞類型標簽進行注釋,。輸出包括每個位點的CTP和每個位點中每個細胞類型的細胞狀態(tài)的連續(xù)估計（圖1）。然后,，這些信息可用于下游分析和生物學假設的制定,。

圖1 DestVI的ST分析流程圖

為了對參考 scRNA-seq 數(shù)據(jù)進行建模，DestVI的第一個LVM（單細胞潛在變量模型（scLVM）；圖2）假設為：對于每個基因g和細胞n,，觀察到的轉錄本數(shù)量服從負二項分布,。為了對ST數(shù)據(jù)建模，DestVI的第二個LVM（空間轉錄組潛在變量模型（stLVM）,；圖 3）假設為：對于每個基因g和每個位點s,，觀察到的轉錄本數(shù)量也服從負二項分布。并且,，為了促進與scRNA-seq測量結果的一致性,，stLVM使用由scLVM訓練的相同解碼器神經(jīng)網(wǎng)絡，為了擬合stLVM,，DestVI依賴于一種最大后驗概率估計（MAP）方案,。由此產(chǎn)生的模型支持多種類型的任務來分析新的數(shù)據(jù)集，其中一些任務作者在DestVI下游分析的自動化管道中實現(xiàn),。同時,，作者還提出了一種細胞類型特異性DE程序，它有助于對同一組織內(nèi)不同條件或不同區(qū)域的組織進行比較分析,。

圖2 scLVM的原理圖

圖3 stLVM的原理圖

使用模擬數(shù)據(jù)驗證DestVI

大多數(shù)反卷積的基準分析側重于給定算法重現(xiàn)每個位點中細胞類型比例的能力,。然而，為了全面評估DestVI的性能,，以推斷除CTP之外連續(xù)的細胞狀態(tài),，作者構建了一個更細致的模擬框架，該框架還考慮了細胞類型的變異性（圖4）,。在該模擬方案中,，每個位點由CTP以及每種類型的細胞狀態(tài)定義。

圖4 半模擬框架圖

為了評估每個模擬點推斷的CTP和細胞類型特異性基因表達的準確性,，作者用幾種方法對DestVI進行了基準測試,，如離散反卷積方法和將ST數(shù)據(jù)與scRNA-seq數(shù)據(jù)嵌入的方法。實驗證明,，在CTP估計方面,，嵌入方法的性能通常低于專門為反卷積設計的方法（圖5a），因為這些嵌入方法沒有明確考慮空間點可能包含混合的細胞類型,。對于細胞類型特異性基因表達的插補（圖5b）,，反卷積方法的性能在很大程度上取決于聚類水平。事實上,，這些方法在更高分辨率（每種細胞類型超過四個集群）下優(yōu)于基于嵌入的方法，但在低子集群分辨率下表現(xiàn)較差,。DestVI的無子聚類方法優(yōu)于該任務中的所有方法,，因為這些基準測試方法都沒有利用輸入子群（即集群和子集群）的分層特性，而作者通過加入一個額外的基線來利用這些信息并表明了DestVI 與其相比具有優(yōu)勢?？傊?，DestVI能夠在CTP的離散水平和細胞類型特異性基因表達的連續(xù)水平上提供更準確的估計。

圖5 基準測試方法性能評估

單細胞空間轉錄組數(shù)據(jù)集的驗證

由于Visium或Slide-seq實驗中缺乏真實數(shù)據(jù),，因此這是評估DestVI在真實數(shù)據(jù)集上性能的一個障礙,。然而，sci-Space提供了一種評估DestVI的方法,，因為它包含了單細胞分辨率的轉錄信息和粗略空間信息（約200 μm）,。實驗結果表明，在這種更現(xiàn)實的情況下,，無論是在預測CTP還是在推斷細胞類型特異性基因表達方面,，DestVI仍然是表現(xiàn)最好的方法。

DestVI識別淋巴結中的空間免疫反應

在DestVI的首次應用中,，作者研究了通過恥垢分枝桿菌（MS）刺激48小時后小鼠耳淋巴結抗原特異性免疫的空間模式,。為了進行空間分析，作者使用Visium 平臺來分析四個淋巴結切片（其中兩個切片用MS刺激,，另兩個切片來自對照 (PBS) 注射,，并在同一Visium載玻片的兩個捕獲區(qū)域進行處理）。通過DestVI,，作者還探索了感染誘導的每個細胞轉錄狀態(tài)差異是如何與空間組織變化相關聯(lián)的,，實驗結果發(fā)現(xiàn)單核細胞傾向于形成空間連貫的生態(tài)位，與對照組相比,，在受刺激的淋巴結中具有更強的共定位程度（圖6）,。總而言之,，DestVI分析的獨特特征能夠對原始和病原體攻擊的淋巴結內(nèi)的細胞類型和狀態(tài)進行穩(wěn)健的空間表征,。

圖6 DestVI在小鼠淋巴結中的應用

DestVI識別腫瘤核心中巨噬細胞的缺氧狀態(tài)

為了將DestVI應用于更復雜且結構更少的組織，作者使用Visium對同基因小鼠腫瘤模型 (MCA205) 進行了空間分析,。通過實驗分析可知,，DestVI能夠提供MCA205腫瘤中主要免疫亞群空間組織的精確詳細視圖?？傮w來說,，DestVI可以正確地將免疫細胞的細胞類型映射到位點坐標上，并識別出一個清晰且特有的生態(tài)位,，該生態(tài)位涉及巨噬細胞群體內(nèi)缺氧反應的代謝變化,。進一步的實驗驗證表明，DestVI可以成為探索免疫治療下不同腫瘤模型中復雜細胞類型特異性表型變化的可靠工具,。

作者提出的DestVI是一種使用輔助scRNA-seq數(shù)據(jù)集對ST圖譜進行反卷積的多分辨率方法,。通過模擬表明,，基于對scRNA-seq數(shù)據(jù)進行聚類的經(jīng)典反卷積方法可能難以應用，并且在細胞類型連續(xù)變化的情況下可能會丟失重要信息,。DestVI通過在scRNA-seq數(shù)據(jù)上學習特定細胞類型的潛在變量,，使用深度生成模型并將這些潛在變量映射到空間數(shù)據(jù)上來解決這個問題。與作者開發(fā)的自動化管道相結合,，DestVI可以提供可解釋的分析,，以便比較不同條件下或同一組織切片的不同生態(tài)位之間的細胞基因表達水平。并且,，在該研究中,，作者為DestVI使用了一組固定的超參數(shù)。

DestVI還可以從建模角度進一步改進,，例如,，可以通過使用更具原則性的錯誤發(fā)現(xiàn)率 (FDR) 控制程序來改進DE分析的輸出。此外,，將位點位置顯式地合并到stLVM模型中也可能是有益的,。

文中描述的DestVI的兩種應用都側重于10x Visium協(xié)議，與Slide-SeqV2,、HDST和Seq-Scope等新興技術相比,，該協(xié)議的空間分辨率通常較低。即便如此,，對大多數(shù)高分辨率方法生成的數(shù)據(jù)進行分析仍然具有挑戰(zhàn)性,，因為無法保證單個細胞的完美空間結構。DestVI概括了最初Seq-Scope研究的主要發(fā)現(xiàn),，與最初使用的單細胞管道相比,，它在整個組織中提供了更多可聚集的細胞類型比例。在模擬實驗中,，DestVI 在更稀疏的數(shù)據(jù)集上仍然具有競爭力,。最后，作者認為DestVI方法可以提供必要的分辨率,，并進一步增強對局部信號環(huán)境的理解,，以及了解它們?nèi)绾斡绊懠毎δ芎涂臻g線索，例如特定細胞亞群之間的相互作用,、化學梯度和代謝串擾,。

Lopez, R., Li, B., Keren-Shaul, H. et al. DestVI identifies continuums of cell types in spatial transcriptomics data. Nat Biotechnol (2022). 

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https://github.com/romain-lopez/DestVI-reproducibility

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