文獻詳解欄目

每個人的時間精力有限，必須優(yōu)先閱讀相關(guān)文獻,，開設(shè)這個欄目也是希望為大家推薦高質(zhì)量的單細胞相關(guān)文獻,。如果大家對單細胞轉(zhuǎn)錄組感興趣可以關(guān)注一下，哪怕每天只學一點點,，積土成山,，積水成淵。

當然一個人的力量終歸是小的,，我也希望匯聚一群人,，形成一個場，這里頭最重要的生產(chǎn)力不是單個人多聰明,，多厲害,，而是每個人相互作用，形成的那個氛圍,。

希望大家能有所收獲,！

隨著分子生物學,、微流控與納米技術(shù)的發(fā)展，催生了許多類型的單細胞測序技術(shù),。過去的方法集中在單模態(tài)測量上,，如DNA序列、RNA表達量和染色質(zhì)可及性上,。雖然這些技術(shù)促進了我們對細胞多樣性與發(fā)育景觀的理解,，但是它們并不能很好地解析單細胞內(nèi)分子間互作關(guān)系。而這些互作關(guān)系是深入探索細胞狀態(tài)的關(guān)鍵,。此外,，隨著可用數(shù)據(jù)集規(guī)模的快速增長，迫切需要用于標準化與聯(lián)合分析且考量到批次效應與個體差異的計算方法,。

scRNA-seq是應用最為廣泛的單細胞測序技術(shù)之一,。而后出現(xiàn)了一系列互補技術(shù)如單細胞基因組、表觀基因組和蛋白質(zhì)組分析技術(shù),，涵蓋了單細胞基因組測序（Vitak, S. A. et al., 2017; Navin, N. et al., 2011）,、染色質(zhì)可及性（Pott, S., 2017; Corces, M. R. et al., 2016; Buenrostro, J. D. et al., 2015; Cusanovich, D. A. et al., 2015; Lake, B. B. et al., 2018）、DNA甲基化（Luo, C. et al., 2017; Smallwood, S. A. et al., 2014; Guo, H. et al., 2013; Mulqueen, R. M. et al., 2018）,、膜蛋白（Stoeckius, M. et al., 2017; Peterson, V. M. et al., 2017）,、小RNA（Faridani, O. R. et al., 2016）,、組蛋白修飾（Gomez, D. te al., 2013; Rotem, A. et al., 2015）和染色體構(gòu)象（Ramani, V. et al., 2017; Nagano, T. et al., 2013）等技術(shù)。目前已開發(fā)出研究單細胞空間結(jié)構(gòu)和譜系信息的方法（Frieda, K. L. et al., 2017; Shah, S. et al., 2016）,。

單細胞多模態(tài)綜合分析方法示意

Multimodal and integrative methods for single- cell analyses

目前已有多種方法測定單細胞各個時期不同參數(shù),，這些方法可以大致分為細胞狀態(tài)分析、細胞譜系分析,、擬時分析三大類,，圖中適用于不同類型的分析方法均已標注

單模態(tài)與多模態(tài)分析方法匯總

理想的實驗流程應當全面洞悉細胞的所有方面,，包括分子狀態(tài)、空間構(gòu)象,、胞外環(huán)境互作的全部過程,。盡管當下技術(shù)手段無法做到，但多模態(tài)技術(shù)與綜合計算方法可以是我們離該目標越來越近,。文章希望提出整合單細胞轉(zhuǎn)錄組學,、基因組學、表觀組學與蛋白組學的數(shù)據(jù)統(tǒng)一分析方法,，重點在結(jié)合其他數(shù)據(jù)類型分析scRNA-seq數(shù)據(jù),，尤其是整合來自于同一細胞的不同類型數(shù)據(jù)。

文章分為四大塊,，首先探討了多模態(tài)單細胞分析方法,，其次研究了不同實驗不同數(shù)據(jù)整合分析，然后討論了單細胞空間測序數(shù)據(jù)整合分析方法,，最后給出了整合分析方法的前景與必要性,。(本文中我把第二和第三塊的內(nèi)容合在了一起)

最初的單細胞分析方法主要關(guān)注細胞某狀態(tài)下的某類分子水平。而現(xiàn)在更引人矚目的是同時分析單細胞內(nèi)多種分子以建立更全面的單細胞分子視圖,。通常這些方法是將scRNA-seq數(shù)據(jù)與其它分析手段的結(jié)合,，目前主要有四種策略從單細胞中得到多模態(tài)數(shù)據(jù)：

1.1

FACS結(jié)合scRNA-seq

嚴格來說這種方法算單模態(tài)。

一些scRNA-seq workflow采用流式分選細胞,，隨后進行scRNA-seq（MARS-seq/Smart-seq/2）,，這樣可以同時獲得單細胞與對應的熒光信號，將熒光所表示的蛋白質(zhì)水平與轉(zhuǎn)錄組在同一細胞中關(guān)聯(lián)（Ramsk?ld, D. et al., 2012; Jaitin, D. A. et al., 2014; Picelli, S. et al., 2013 ）,。早期研究（Hayashi, T. et al., 2010）利用FACS結(jié)合半定量RT-PCR（作者稱之為FBSC‐PCR）,，結(jié)合scRNA-seq，明確了細胞表面marker可以區(qū)分細胞類型與狀態(tài)(Wilson, N. K. et al., 2015;該文結(jié)合了Smart-seq2),，(Paul, F. et al., 2015;該文結(jié)合了MARS-seq)和鑒定稀有細胞的思路,。Paul, F. et al., 2015與Nestorowa, S. et al., 2016利用該workflow研究發(fā)現(xiàn)了小鼠造血祖細胞由轉(zhuǎn)錄組定義不同細胞簇的免疫表型,，Wilson, N. K. et al., 2015則分離了小鼠HSCs，鑒定細胞維持干性相關(guān)的表面marker,。但是囿于熒光光譜的重疊現(xiàn)象,，利用該法測到的每個細胞的參數(shù)范圍有限。

1.2

  細胞內(nèi)組分分離分析

針對熒光無法分選的部分,，F(xiàn)ACS顯然是不合適的,，尤其是需要同時測得單細胞基因組與胞內(nèi)蛋白的scRNA-seq實驗。此時需要物理分離或通過不同tag篩選出不同組分,。

G&T-seq通過加入oligo(dT)特異性分離mRNA同時保留基因組DNA從而實現(xiàn)了基因組轉(zhuǎn)錄組平行測序（Macaulay, I. C. et al., 2015）DR-seq通過則通過加入barcode特異擴增cDNA序列實現(xiàn)基因組轉(zhuǎn)錄組平行測序（Dey, S. S. et al., 2015）,。這使得單細胞基因表達水平與其對應基因型聯(lián)系起來，深度揭示單細胞間DNA拷貝數(shù)變異與染色體重排對下游mRNA豐度的具體關(guān)聯(lián),。這些方法適用于研究體細胞基因高度變異的腫瘤組織,。

DNA甲基化與轉(zhuǎn)錄組水平結(jié)合研究是基于Macaulay, I. C. et al., 2015的G&T-seq和 Smallwood, S. A. et al., 2014的scBS- seq技術(shù)發(fā)展的，同普通BSP一樣,，用亞硫酸氫鈉處理DNA片段隨后進行擴增,，結(jié)合G&T-seq，可以分析同一細胞內(nèi)的DNA甲基化模式和基因表達數(shù)據(jù)（Angermueller, C. et al., 2016）,。由于DNA甲基化存在不穩(wěn)定性和異質(zhì)性,，因此若要研究DNA甲基化與基因表達間的關(guān)系，則必須將表觀基因組變異與細胞間的異質(zhì)性區(qū)別開來,。
通過DNA甲基化與轉(zhuǎn)錄組關(guān)聯(lián)分析,，為啟動子甲基化與基因表達間的負相關(guān)性提供深層次的證據(jù)。此外,，利用barcode系統(tǒng)選擇性標記基因組DNA與cDNA,，結(jié)合index系統(tǒng)，可以對數(shù)千個單細胞進行染色質(zhì)可及性與基因表達水平間的關(guān)聯(lián)分析,，同時鑒定出影響基因表達的順式調(diào)控元件（Cao, J. et al., 2018）,。

關(guān)于胞內(nèi)蛋白與mRNA關(guān)聯(lián)研究，有兩種思路可供借鑒,。其一（Darmanis, S. et al., 2016）是將FACS sort到的細胞裂解后分離裂解液,，分別進行蛋白質(zhì)與RNA定量。作者采用PEA (鄰近探針延伸分析) 檢測蛋白并用RT-qPCR定量,，采用qRT-PCR定量mRNA,。該法可以同時檢測82個mRNA/75個蛋白；其二（Genshaft, A. S. et al.）是將FACS sort到的細胞在微流控芯片中同時進行逆轉(zhuǎn)錄和PEA而不分離裂解液,。該法可以同時檢測96個mRNA/38個蛋白,。這兩種方法檢測的蛋白與mRNA數(shù)量與質(zhì)量均有限。

1.3

泛化測序數(shù)據(jù)統(tǒng)一

此處泛化統(tǒng)一是指將多種數(shù)據(jù)類型（蛋白數(shù)據(jù)/譜系數(shù)據(jù)/基因表達數(shù)據(jù)）整合為一個通用型數(shù)據(jù)類型。
CITE-seq與REAP-seq可以同時將細胞表面膜蛋白信息與mRNA轉(zhuǎn)為cDNA信息,，通過測序可以同時檢測到二者實際水平,。具體是利用帶有polyA的不同barcode的抗體結(jié)合細胞表面蛋白，barcode可以與mRNA一起檢測,。與FACS-scRNAseq相比,，針對不同表位的不同抗體barcode都是特異的，可以從根本上消除熒光信號重疊對檢測數(shù)量的限制,，這使得區(qū)分不同免疫細胞的細微差別成為可能,。但是該法對于胞內(nèi)蛋白與mRNA共檢測是行不通的。作者認為可以與PEA結(jié)合來解決這一問題,，或是采用SPLiT-seq,、sci-RNA-seq的研究思路來解決。

這些技術(shù)的出現(xiàn)表明若將可以細胞信息轉(zhuǎn)化為有序的barcode,，我們就可以在分析單細胞轉(zhuǎn)錄組時將這些信息同時獲取,。這種策略不僅適用于分析細胞的自然狀態(tài)，也適用于大規(guī)?；驍_動研究。目前有Perturb-Seq（Dixit, A. et al., 2016）和CRISPR-Seq（Adamson, B. et al., 2016; Datlinger, P. et al., 2017; Jaitin, D. A. et al., 2016）,，他們將scRNA-seq與CRISPR-cas9結(jié)合進行遺傳篩選,，使得研究正向遺傳學的大規(guī)模基因擾動試驗成為可能,。具體原理是給單個基因擾動和受到影響的細胞添加barcode,，通過scRNA-seq能夠鑒定出這兩者，從而推斷CRISPR靶向基因和由此產(chǎn)生的單個細胞的轉(zhuǎn)錄譜間的關(guān)系,。目前應用在基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)（Dixit, A. et al., 2016）,、未折疊蛋白反應（Adamson, B. et al., 2016）、免疫細胞分化發(fā)育（Datlinger, P. et al., 2017）和T細胞受體激活（Jaitin, D. A. et al., 2016）,，非編碼區(qū)調(diào)控元件（Klann, T. S. et al., 2017）,。此外，還可以結(jié)合CRISPR-dcas9系統(tǒng),，擴展到轉(zhuǎn)錄調(diào)控,、表觀遺傳調(diào)控領(lǐng)域中（Thakore, P. I. et al., 2016; Liu, X. S. et al., 2016; Hilton, I. B. et al., 2015; Konermann, S. et al., 2015; Gilbert, L. A. et al., 2017）,18年發(fā)展了同時靶向和敲除基因的技術(shù)（Boettcher, M. et al., 2018）。

另一個應用是結(jié)合CRISPR-cas9的譜系追蹤技術(shù),。單細胞譜系追蹤是去年的大熱方向之一,，此處提到三種mRNA+lineage方法：scGESTALT、ScarTrace,、LINNAEUS,。這三種方法各有不同，但大體是利用CRISPR-cas9連續(xù)切割結(jié)合到基因組上的barcode，細胞會用NHEJ來應對這種損傷,。但NHEJ容易出錯,，從而在DNA序列中產(chǎn)生隨機突變，這些突變通過細胞分裂進行遺傳,，結(jié)合scRNAseq利用這些突變作為復合barcode來構(gòu)建組織或器官發(fā)育譜系,。

另一種略有不同的方法是MEMOIR，它結(jié)合smFISH與CRISPR-cas9系統(tǒng),，可以同時檢測細胞譜系與空間位置,。

1.4

scRNA-seq數(shù)據(jù)挖掘

普通的scRNA-seq流程除了可以做轉(zhuǎn)錄本豐度外，還可以進行諸如體細胞突變,、遺傳變異,、RNA isoform等分析。

關(guān)于體細胞突變目前已有研究（Lodato, M. A. et al., 2015）,該文通過對人大腦的少量單細胞全基因組測序,，分析了發(fā)生的細胞突變,，構(gòu)建了人大腦神經(jīng)細胞譜系。作者發(fā)現(xiàn)突變大多發(fā)生在高轉(zhuǎn)錄活性相關(guān)位置,，這表明可能可以通過scRNA-seq數(shù)據(jù)來分析神經(jīng)細胞突變情況,，根據(jù)轉(zhuǎn)錄狀態(tài)重構(gòu)神經(jīng)細胞譜系。此外,，分析scRNA-seq數(shù)據(jù)中的拷貝數(shù)變異,，可以研究癌癥非整倍體與異質(zhì)性等情況（Tirosh, I. et al., 2016; Fan, J. et al., 2018）。
單細胞分析也為理解DNA自然變異如何影響基因表達與細胞狀態(tài)提供了新思路,。有研究結(jié)合GWAS+scRNAseq,，鑒定出了不同個體之間的eQTL（Kang, H. M. et al., 2018）。

1.4

多模態(tài)數(shù)據(jù)分析

多模態(tài)測序策略正在催生與之相匹配的數(shù)據(jù)分析方法,。多模數(shù)據(jù)集可以檢測到細胞間的細微差異,，而單模數(shù)據(jù)很可能無法做到這一點。由于scRNAseq數(shù)據(jù)存在dropout,，故而它更容易忽略細胞間的細微差別,；但與來自同一細胞的其他數(shù)據(jù)互補分析可以改善這一問題。例如,，很難通過scRNA-seq數(shù)據(jù)區(qū)分不同的T細胞亞群,，但聯(lián)合膜蛋白分析則可以顯著提高亞群分辨率（Stoeckius, M. et al., 2017），同樣,，RNA+chromatin,、RNA+methylation聯(lián)合可能揭示單個細胞間的調(diào)控異質(zhì)性，不再贅述,。

單細胞多模態(tài)分析思路很可能受到bulk-seq多組學聯(lián)合分析的啟發(fā)（Meng, C. et al., 2016）,，Argelaguet開發(fā)了一種名為MOFA( multi- omics factor analysis)的方法,，該方法在多組學bulk-seq數(shù)據(jù)中效果良好，同時測試了單細胞DNA甲基化數(shù)據(jù)與RNA數(shù)據(jù)聯(lián)合處理情況,，效果也可以,。這暗示適用于bulk-seq的多組學數(shù)據(jù)處理方式可能也適用于單細胞多模態(tài)數(shù)據(jù)。鑒于單細胞數(shù)據(jù)規(guī)模遠超bulk-seq,，多視圖機器學習不失為一種重要的補充手段（Colomé- Tatché, M. & Theis, F. J., 2018）,。
單細胞多模態(tài)研究策略為解析細胞內(nèi)不同組分間的關(guān)系提供了新方法。如CITE-seq和REAP-seq可以輕易鑒別出相關(guān)度較低的RNA-protein模塊,，表明此處存在活躍的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié),。還有一個很有意思的是通過測量剪接過的成熟RNA與未剪接RNA的相對豐度，可以建立RNA與蛋白的關(guān)聯(lián)動態(tài)模型（La Manno, G. et al., 2018）,。
此外,，還可以在不同類型數(shù)據(jù)間建立統(tǒng)計模型。前面提到的sci-CAR文章建立了染色質(zhì)可及性與基因表達水平間的統(tǒng)計模型,，通過染色質(zhì)可及性數(shù)據(jù)估計細胞內(nèi)基因表達水平（Cao, J. et al., 2018）,，另一組研究人員建立了gRNA與基因表達水平間的線性回歸模型，用以識別細胞應答的前后關(guān)系,，重構(gòu)轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)（Perturb-Seq（Dixit, A. et al., 2016））,。通過這種手段可以研究目標物種復雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

前面主要講了在同一測序?qū)嶒炌慌毎M行的多模態(tài)數(shù)據(jù)整合,，而不同測序?qū)嶒灁?shù)據(jù)整合分析才是亟需解決的關(guān)鍵問題,。同bulk seq 數(shù)據(jù)一樣，處理批次效應是綜合分析不同實驗室,、不同workflow產(chǎn)出數(shù)據(jù)的首要問題（SVA包（Leek, J. T. 2014））。然而目前bulk seq水平的處理方法無法處理單細胞數(shù)據(jù)（（Haghverdi, L, et al.,  2018,，作者用MNN處理數(shù)據(jù),，該法在mnnpy中得到改進）;  Butler, A, et al,. 2018）。目前最新方法利用CCA/MNN可以識別出兩個數(shù)據(jù)集間共有的部分,，判定細胞間共有的生物學狀態(tài),然后以這些相同狀態(tài)的細胞為基準消除批次效應,。

2.1

常規(guī)scRNA-seq數(shù)據(jù)整合分析

此處作者介紹了他自己在Seurat V2中開發(fā)的方法（Satija, R, et al., 2015;），該法用CCA鑒別出不同數(shù)據(jù)集間相同的細胞類型且可以避免出現(xiàn)由批次效應或常規(guī)PCA造成的假陽性細胞類型,；接下來采用動態(tài)時間規(guī)整算法校正數(shù)據(jù)集間細胞密度差異,。這兩步驟可以將細胞投影到一個低維空間，具有相同生物學狀態(tài)的細胞相互接近且消除了不同數(shù)據(jù)集帶來的影響,。

另一種方法即mnnCorrect,，最早用于計算機領(lǐng)域圖形識別。該法尋找不同數(shù)據(jù)集間最接近的細胞,，將之判定為潛在的狀態(tài)相同細胞,，隨后利用成對MNNs距離計算一個批次參數(shù)（batch vector），用以校正原始表達矩陣（Haghverdi, L., 2018）。

CCA/mnnCorrect在整合處理不同來源的scRNA-seq數(shù)據(jù)時表現(xiàn)良好,。這將極大提升發(fā)現(xiàn)稀有細胞,、微弱轉(zhuǎn)錄差異細胞及與之對應maker的能力（Haghverdi, L, et al,.2018；Butler, A,et al,. 2018） ,。這為建立一個統(tǒng)一的單細胞參考數(shù)據(jù)集提供了依據(jù),。在此基礎(chǔ)上，scRNA-seq數(shù)據(jù)整合分析得到了快速發(fā)展（Hie, B. L, et al., 2018; Barkas, N. et al., 2018; Park, J.-E., 2018; Korsunsky, I. et al., 2018; Stuart, T. et al., 2018; Welch, J. et al., 2018）,。這種多數(shù)據(jù)集整合分析的應用遠不止用于校正批次效應這么單一,。它可以在單細胞尺度上深入比較細胞間的狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)細胞對環(huán)境及基因擾動的特異性響應,，對不同疾病及不同治療下的患者的測序數(shù)據(jù)進行標準化,。
scRNA-seq數(shù)據(jù)整合分析還可以擴展至跨物種分析。Karaiskos,N比較了兩種果蠅早期胚胎的空間基因表達模式,，通過構(gòu)建空間基因表達圖譜,，該研究系統(tǒng)比較了兩個果蠅的同源基因表達譜，鑒定出了彼此間的進化波動,。Tosches比較了爬行動物與哺乳動物腦細胞間的相關(guān)性,。Baron分析了人與小鼠胰島細胞scRNA-seq數(shù)據(jù)，鑒定出了二者間的保守亞群,。Alpert開發(fā)出了cellAlign,，在一維水平上比對了人與小鼠的擬時軌跡，發(fā)現(xiàn)人胚胎合子激活要比小鼠晚,，小鼠中比人活躍的基因皆與蛋白合成相關(guān),。跨物種分析未來是光明的,，但對于多物種整合分析而言,，精確鑒定物種間同源基因是多物種整合分析至關(guān)重要的一步。

2.2

多重scRNA-seq數(shù)據(jù)集間的細胞分類

以細胞分類信息的形式串聯(lián)不同的scRNA-seq數(shù)據(jù)集,，或者借鑒到自己實驗中,，是優(yōu)于合并數(shù)據(jù)集然后de novo聚類這種方法的。且隨著有參細胞圖譜的開發(fā),，這種方式將更加尋常,。目前已開發(fā)對應方法：scmap- cell & scmap- cluster，其中scmap-cell 用乘積量化（product quantization）算法進行比對,，而scmap-cluster則用于識別未知數(shù)據(jù)集中的cluster,。

利用已有的注釋數(shù)據(jù)集，目前開發(fā)的新方法采用奇異值分解,、線性判別分析和支持向量機算法來對細胞進行分類,。此外,，隨著引用數(shù)據(jù)集的大小、范圍與深度越來越高,，監(jiān)督聚類在解析細胞類型方面要比無監(jiān)督聚類強得多,。通過以上這些方法，可以更精確地識別并解析細胞亞群,。

2.3

不同來源和類型的單細胞數(shù)據(jù)整合分析

satija已有相關(guān)文章研究：Comprehensive Integration of Single-Cell Data
這一部分講的是將scRNA-seq數(shù)據(jù)與其它不同來源和類型數(shù)據(jù)諸如甲基化,、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)等整合分析的方法。

將scRNA-seq數(shù)據(jù)與其它類型,、不同來源的單細胞數(shù)據(jù)整合分析是無法提取到數(shù)據(jù)間的共同特征的,，因為它們不是一個類型的數(shù)據(jù)，需要不同的分析方法,。這點在基于基因組的數(shù)據(jù)（如染色質(zhì)可及性與甲基化數(shù)據(jù)）與基于基因的數(shù)據(jù)（如基因與蛋白表達數(shù)據(jù)）間整合分析尤為明顯,。但如果這些數(shù)據(jù)來自于同一類細胞群，由于存在著共同的生物學狀態(tài),，此時可以聯(lián)立分析以發(fā)現(xiàn)不同數(shù)據(jù)集類型間的對應關(guān)系,。

MATCHER是一種在一維水平上比較不同類型測序數(shù)據(jù)擬時軌跡的方法。簡單來說就是比對不同類型測序數(shù)據(jù)的擬時軌跡,，以確定這些數(shù)據(jù)集間的對應關(guān)系,。這種方法可以識別不同數(shù)據(jù)集間的“等效細胞”而不需預先知道彼此間的對應關(guān)系。開發(fā)者用scM&T- seq（Angermueller, C. et al., 2016）和scRNA-seq數(shù)據(jù)做了驗證,，準確預測了DNA甲基化與基因表達之間的關(guān)系,。

其他sc-seq數(shù)據(jù)不同于scRNA-seq數(shù)據(jù)一樣可以借助Marker解析細胞類型，因此可以利用scRNA-seq解析出的細胞信息為其他sc-seq數(shù)據(jù)分析做參考,。有研究（ Lake, B. B. et al., 2018）對不同腦組織切片進行了單核RNAseq（snRNA-seq）與單細胞轉(zhuǎn)座子超敏性位點測序（scTHS-seq）,，通過梯度推進算法利用單細胞基因表達譜指導了染色質(zhì)可及性測序數(shù)據(jù)集的細胞分類：作者首先鑒別出snRNA-seq數(shù)據(jù)集與scTHS-seq數(shù)據(jù)集共有的細胞亞群，訓練一個可以將基因表達與染色質(zhì)可及性數(shù)據(jù)關(guān)聯(lián)的模型,；然后利用該模型去分類scTHS-seq中剩余未被分類的細胞,。這種方法可以更細致地對大腦組織中的細胞進行分類。同樣,，可以整合scATAC-seq數(shù)據(jù)集來分析單細胞DNA甲基化或轉(zhuǎn)座酶染色質(zhì)可及性間的細胞分類。

目前正在開發(fā)的新方法有利用假定等價特征,、或識別在所有類型數(shù)據(jù)中的假定相關(guān)共享特征來進行數(shù)據(jù)交叉模態(tài)分類,。Welch開發(fā)了一種集成非負矩陣分解（iNMF）的方法，名為LIGER,，可以跨模態(tài)整合數(shù)據(jù),。他們對同一類型皮質(zhì)細胞分別進行了亞硫酸鹽測序（snmC- seq）與scRNA-seq并對其進行了分類。他們假設(shè)基因體甲基化與其表達水平負相關(guān)從而整合了不同模態(tài)測序數(shù)據(jù)進行細胞分類,。在seurat v3.0中,，作者也引入了假定等價特征或關(guān)聯(lián)特征進行多模態(tài)整合數(shù)據(jù)細胞分類的方法,。這些方法優(yōu)點如上所述，即可以利用scRNA-seq的細胞分類信息來指導scATAC-seq數(shù)據(jù)細胞分類,，鑒別出染色質(zhì)可及性與DNA甲基化的細胞特異模塊,。

2.4

空間數(shù)據(jù)與測序數(shù)據(jù)整合

組織中細胞的空間結(jié)構(gòu)常反映出細胞間的功能差異與細胞命運和譜系的差異。不同基因表達引導細胞向不同方向分化,，不同細胞精確排列形成不同組織,。關(guān)鍵是單細胞實驗通常在分析前細胞已被解離，組織原位信息無法保留,，scRNA-seq得到的表達譜不能完全反應細胞空間信息,。具有相似基因表達譜的細胞可能存在于不同的空間位置中，故而細胞分離過程中空間信息的缺失是很多單細胞實驗的主要缺點,。結(jié)合高分辨率基因表達譜與空間表達圖譜 (spatial expression maps) 將細胞空間坐標與基因表達譜聯(lián)系起來,，可以解決這一問題。有兩類方法：計算模型或者RNA原位定量,，可以同時收集到細胞空間坐標與基因表達值,。

FISH方法是原位基因檢驗的金標準，但是它檢測基因數(shù)目較少,。新方法將探針與糾錯碼相結(jié)合,，可以一次性檢測到數(shù)百個基因表達情況，或使用空間條形碼來記錄mRNA逆轉(zhuǎn)錄過程中的空間信息,。這些數(shù)據(jù)集可以通過計算方法進行整合,，同時獲取高通量的空間信息與基因表達信息。

目前計算整合FISH與scRNA-seq數(shù)據(jù)已有相關(guān)文章報道,。這個思路最初由Satija和Achim提出,，應用于腦組織研究中，后來擴展到其他組織研究中,，為個體本身提供了完整的空間表達圖譜,。該類研究通常關(guān)注關(guān)鍵基因的空間分布，獲取它們的空間表達模式,，并為單個基因建立對應表達模型,，利用這些空間表達模型，將單細胞數(shù)據(jù)mapping到空間信息中,。藉由該方法得到的整合數(shù)據(jù)集,，可以研究幾乎所有基因的空間輪廓，進而研究每種細胞所在區(qū)域情況,。

目前最新的方法可以從該類整合數(shù)據(jù)中系統(tǒng)分析基因空間表達趨勢,。但是該類方法只適用于已有明晰空間結(jié)構(gòu)的組織或個體，如早期胚胎與動物肝臟,；在成熟個體或?qū)嶓w腫瘤應用仍不現(xiàn)實,。一些研究提出了一種粗整合方案：scRNA-seq鑒定細胞簇marker基因后,，用FISH或免疫組化檢測一小部分感興趣基因，將之與scRNA-seq相整合,。但是此類研究較為粗糙,，并未提供系統(tǒng)的解決方案 (Puram, S. V. et al., 2017；Pandey, S. et al., 2018),。

近年來,，有兩種高分辨率的空間基因表達測定方法被開發(fā)出來，可以檢測大范圍2D或3D組織內(nèi)單個細胞數(shù)十至數(shù)百基因表達情況（Wang, X. et al., 2018,；Codeluppi, S. et al., 2018）,。這些方法極大降低了組織背景熒光，提高了信噪比,。這兩種方法（osmFISH&STARmap）均可以保有組織原位三維空間信息,。這些方法可以原位獲取許多細胞和基因的精確表達譜，可以在細胞原位進行分子分型,，評估細胞分布環(huán)境,，推斷細胞各類細胞的三維分布，將細胞信息推到解剖學水平上去,?？臻g數(shù)據(jù)與scRNA-seq數(shù)據(jù)整合，可以為研究組織構(gòu)成與功能提供全新的手段,。

隨著單細胞技術(shù)日趨成熟,，每個細胞所檢測的測量量與檢測到的細胞和分子數(shù)量都在逐漸增加。因此整合不同實驗得到的不同模態(tài)數(shù)據(jù)成為必然,。目前正在進行的人類細胞圖譜和關(guān)鍵模式生物圖譜是當下最大規(guī)模的多模態(tài)數(shù)據(jù)整合工作,。整合單細胞一系列多模態(tài)數(shù)據(jù)，我們可以獲取轉(zhuǎn)錄組之上的細胞圖譜,，洞悉細胞的整體狀態(tài),。分析單細胞多模態(tài)數(shù)據(jù)之間的關(guān)系，可以揭示細胞功能的潛在基礎(chǔ),，推斷各模態(tài)間的因果關(guān)系,。

生物學中有一個主要問題：什么是細胞類型？

解決方案正如那個 老問題：“什么是基因,？” 的答案一般,，該問題是通過跨物種DNA序列比較與多種模式下的生化分析來解答的。故而本問題的答案必是在多種模式與條件下,，對單細胞進行細致分析來回答。