Case Reports

Hinyokika Kiyo

. 2021 Sep;67(9):419-421.

 doi: 10.14989/ActaUrolJap_67_9_419.

[A Case Report of 2,8-Dihydroxyadenine Urolithiasis]

大分子在腎結(jié)石形成中的作用

晶體聚集體的形成是腎結(jié)石發(fā)病機(jī)制中的關(guān)鍵過(guò)程之一,，涉及晶體（主要是一水草酸鈣，COM）和尿液成分（例如蛋白質(zhì)）之間的相互作用,，這些成分充當(dāng)結(jié)石中晶體之間的粘合劑“膠水”,。為了更好地了解導(dǎo)致晶體聚集的蛋白質(zhì)-晶體相互作用，我們使用三種合成聚陰離子測(cè)量了模型蛋白對(duì)散裝 COM 晶體特性以及它們?cè)诰w表面的吸附的影響：聚（天冬氨酸）（polyD ),、聚谷氨酸 (polyE) 和聚丙烯酸 (polyAA),。這些陰離子大分子將散裝溶液中 COM 晶體聚集的量減少到與正常尿液中蛋白質(zhì)混合物觀察到的相似程度,，聚合物之間幾乎沒(méi)有差異。相比之下,，聚合物在 COM 晶體生長(zhǎng)的測(cè)量中表現(xiàn)出差異,。聚（精氨酸）（polyR）和聚（賴氨酸）（polyK）等聚陽(yáng)離子微弱地減少了聚集，對(duì)晶體生長(zhǎng)的影響可以忽略不計(jì),。發(fā)現(xiàn)所有聚離子都與 COM 晶體表面相關(guān),，這可以通過(guò)電泳遷移率測(cè)量中 COM 晶體的 zeta 電位變化來(lái)證明。另一方面,，聚陽(yáng)離子和聚陰離子的許多二元混合物可以促進(jìn) COM 聚集和可能的生長(zhǎng),，這似乎是由聚合物聚集體形成而不是晶體電荷穩(wěn)定性的喪失所介導(dǎo)的。類似地,，晶體聚集促進(jìn)行為可以通過(guò)形成弱電荷聚陰離子的聚集體來(lái)驅(qū)動(dòng)，如 Tamm-Horsfall 蛋白,，表明聚合物（蛋白質(zhì)）聚集可能在結(jié)石形成中起關(guān)鍵作用,。聚陰離子-COM 晶體表面相互作用對(duì)聚合物側(cè)基化學(xué)成分的敏感性通過(guò) polyD 和 polyE 之間晶體聚集行為的巨大差異來(lái)證明，這與原子力顯微鏡 (AFM) 測(cè)量各種 COM 表面上的生長(zhǎng)抑制和化學(xué)力相關(guān)顯微鏡 (CFM) 測(cè)量 COM 晶體表面和用羧酸鹽或脒基部分裝飾的 AFM 尖端之間的解結(jié)合力（分別模擬聚陰離子和 polyR 側(cè)鏈）,。與 polyD 相比,，在 COM (100) 表面上 polyE 缺乏強(qiáng)相互作用似乎是關(guān)鍵差異。最后,，聚陰離子和聚陽(yáng)離子的同時(shí)存在似乎改變了聚陽(yáng)離子在 CFM 中介導(dǎo)解結(jié)合力和促進(jìn)晶體生長(zhǎng)的能力,。總之,，聚陰離子與 COM 表面密切相關(guān)并影響結(jié)晶,，而聚陽(yáng)離子則沒(méi)有，盡管基于聚陰離子的物理化學(xué)性質(zhì)觀察到重要差異,。觀察結(jié)果表明,，聚合物聚集體的形成促進(jìn)了聚陰離子-聚陽(yáng)離子混合物和弱電荷聚陰離子的 COM 聚集，這在橋接晶體表面中起關(guān)鍵作用,。盡管基于聚陰離子的物理化學(xué)性質(zhì)觀察到重要差異,。觀察結(jié)果表明，聚合物聚集體的形成促進(jìn)了聚陰離子-聚陽(yáng)離子混合物和弱電荷聚陰離子的 COM 聚集,，這在橋接晶體表面中起關(guān)鍵作用,。盡管基于聚陰離子的物理化學(xué)性質(zhì)觀察到重要差異。觀察結(jié)果表明,，聚合物聚集體的形成促進(jìn)了聚陰離子-聚陽(yáng)離子混合物和弱電荷聚陰離子的 COM 聚集,，這在橋接晶體表面中起關(guān)鍵作用。

關(guān)鍵詞：腎結(jié)石,，草酸鈣,，原子力顯微鏡,，粘附，聚集,，聚電解質(zhì)

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1.0 簡(jiǎn)介

幾十年來(lái),，表征尿液大分子的作用一直是結(jié)石研究的主要焦點(diǎn)，發(fā)表了許多關(guān)于該主題的評(píng)論[ 1-4 ],。從第一次發(fā)現(xiàn)大分子作為石基質(zhì)[ 5 ]的主要成分開(kāi)始,，大多數(shù)研究都集中在蛋白質(zhì)上，其中蛋白質(zhì)占 ca,?；|(zhì)質(zhì)量的 65%；然而,，在尿液和結(jié)石基質(zhì)中發(fā)現(xiàn)的糖胺聚糖和其他多糖也受到了關(guān)注[ 6 – 9 ]然而,，在尿液和結(jié)石基質(zhì)中許多來(lái)自各種植物產(chǎn)品和提取物的順勢(shì)療法藥物被認(rèn)為含有結(jié)石形成的多糖抑制劑[10 - 12 ]。RNA和DNA等大分子也存在于結(jié)石中,，盡管含量非常低,，因此很少受到關(guān)注。超分子組裝體,，例如包含細(xì)胞膜的脂質(zhì)雙層,，也可以以類似于大分子的方式發(fā)揮作用，因?yàn)樗鼈儼c可以共同與晶體或石頭表面相互作用的官能團(tuán)的界面,。在這些例子中,，定義明確的結(jié)合部分的存在表明了大分子在結(jié)石發(fā)病機(jī)制中的作用的一般模型，這構(gòu)成了結(jié)石形成機(jī)制的主要知識(shí)空白,。

本文的討論僅限于含有草酸鈣 (CaOx) 作為這些微晶聚集體的主要結(jié)晶成分的結(jié)石,。大約 75% 的分析結(jié)石含有一水草酸鈣 (COM)、二水草酸鈣 (COD) 或這兩種相的混合物的晶體,。大多數(shù) CaOx 結(jié)石形成者沒(méi)有明顯的代謝紊亂,，這表明大分子在 CaOx 結(jié)石形成中起主要作用。雖然不同相的磷酸鈣晶體（即羥基磷灰石,、堿式磷酸鈣和透鈣磷石）經(jīng)常作為次要成分在結(jié)石中發(fā)現(xiàn),，但它們不太常見(jiàn)地占結(jié)晶部分的大部分，并且通常它們只是結(jié)合在一起的主要成分具有潛在的疾病過(guò)程,。同樣,，尿酸的結(jié)晶相，鳥(niǎo)糞石（磷酸銨鎂）和 L-胱氨酸常見(jiàn)于結(jié)石中,，僅與特定的生理紊亂有關(guān),。在這些情況下，大分子在觸發(fā)這些結(jié)石形成方面可能不太重要,。

蛋白質(zhì)和其他有機(jī)成分幾乎覆蓋在 CaOx 結(jié)石中每個(gè)微晶的每個(gè)表面[ 13 ],，盡管總有機(jī)物含量通常僅為 2-3%（按重量計(jì)）[ 14-16 ],。采用蛋白質(zhì)組學(xué)方法的最新研究表明，在 CaOx 結(jié)石中發(fā)現(xiàn)了數(shù)百種蛋白質(zhì),，并且許多相同的蛋白質(zhì)存在于其他類型的結(jié)石中[ 17 – 24 ]. 在其他石頭類型中,，基質(zhì)成分往往占總石頭質(zhì)量的較大部分（Neil Mandel，私人通訊）,，但通常對(duì)不同石頭類型中基質(zhì)成分之間的差異知之甚少,。因此，本文對(duì)與 CaOx 的大分子相互作用的強(qiáng)調(diào)與最常見(jiàn)的結(jié)石有關(guān),，但對(duì)其他結(jié)石類型的普遍適用性尚不確定,。

腎結(jié)石的形成是生物礦化的一種形式，在自然界中無(wú)處不在,。生物礦化的一個(gè)常見(jiàn)過(guò)程是控制大分子和晶體表面之間的相互作用,，這被認(rèn)為是由多價(jià)離子促進(jìn)的，多價(jià)離子在通常形成的鈣基晶體中橋接蛋白質(zhì)和離子之間的相反電荷基團(tuán)[ 25 , 26 ],。值得注意的是,，蛋白質(zhì)會(huì)影響生命系統(tǒng)中的鈣化，例如軟體動(dòng)物殼,、人體骨骼和血管斑塊（例如動(dòng)脈粥樣硬化）的形成[ 27 – 29 ]. 在腎結(jié)石的情況下，尿液成分和 CaOx 晶體之間的相互作用可能會(huì)影響結(jié)石發(fā)病機(jī)制中的一個(gè)或多個(gè)關(guān)鍵過(guò)程,，包括晶體成核,、生長(zhǎng)、聚集以及晶體和/或聚集體與腎臟上皮表面的附著[ 30 ] . 各種尿液成分已成為晶體聚集和細(xì)胞附著的可能抑制劑,，特別是陰離子蛋白和糖胺聚糖[ 31 – 34 ],。然而，在一些研究中,，據(jù)報(bào)道,，尿液大分子也可促進(jìn) COM 聚集和/或附著于上皮細(xì)胞[ 35 – 37 ]. 促進(jìn)晶體粘附的細(xì)胞模型中磷脂層的改變是大分子相互作用的另一個(gè)表現(xiàn)[ 38 ]。天然存在的大分子的這些不同作用已在多個(gè)場(chǎng)合進(jìn)行了審查[ 17 , 39 ],，但有助于該過(guò)程的蛋白質(zhì)數(shù)量使數(shù)據(jù)的進(jìn)一步解釋變得復(fù)雜,。

本綜述將重點(diǎn)關(guān)注探索構(gòu)成結(jié)石的微晶 CaOx 聚集體形成的基本過(guò)程的報(bào)告，包括以前未報(bào)道的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,，這些實(shí)驗(yàn)為理解結(jié)石形成提供了框架,。認(rèn)識(shí)到據(jù)報(bào)道可抑制 COM 結(jié)晶的大多數(shù)天然蛋白質(zhì)都含有高比例的天冬氨酸和谷氨酸殘基（高達(dá) 40%）[ 40 ]，我們已經(jīng)廣泛研究了圖1. 體外研究表明,，具有羧酸鹽官能團(tuán)的聚電解質(zhì)與 COM 表面有很強(qiáng)的相互作用,，并且對(duì)草酸鈣結(jié)晶過(guò)程的影響類似于正常尿液中的尿蛋白[ 41-43 ]。聚陰離子蛋白質(zhì)從溶液中吸附到 COM 晶體表面可以通過(guò)改變晶體習(xí)性,、抑制生長(zhǎng)和引導(dǎo) CaOx 結(jié)晶向 COD 方向來(lái)抑制結(jié)石形成,；一種熱力學(xué)上不太穩(wěn)定的晶體結(jié)構(gòu),，在結(jié)石形成中似乎不太活躍[ 43 , 44 ]. 另一方面，聚陰離子與 COM 表面的相互作用可以通過(guò)促進(jìn) COM 晶體附著到腎臟細(xì)胞表面[ 45-47 ]或通過(guò)自締合（例如聚陰離子聚集）誘導(dǎo) COM 聚集來(lái)促進(jìn)與結(jié)石形成相關(guān)的過(guò)程[ 48 , 49 ]或通過(guò)其他聚合物聚集過(guò)程（例如,，聚陰離子-聚陽(yáng)離子聚集體的形成）[ 49 ],。相反，很少有陽(yáng)離子大分子與 COM 晶體強(qiáng)烈相互作用的例子被報(bào)道[ 50 ],，盡管它們?cè)诰坳庪x子-聚陽(yáng)離子聚集體形成中起關(guān)鍵作用,，從而導(dǎo)致 COM 聚集[ 49 ]。此外,，陽(yáng)離子側(cè)鏈似乎對(duì)晶體生長(zhǎng)加速至關(guān)重要,，正如一些兩親蛋白所觀察到的那樣[ 51 ]?？偟膩?lái)說(shuō),，體外研究表明聚合物-聚合物和聚合物-晶體相互作用對(duì)結(jié)石形成都很重要。

圖,。1

陰離子和陽(yáng)離子聚電解質(zhì)模擬常見(jiàn)尿蛋白的氨基酸殘基,。COM 結(jié)石形成的推定抑制劑富含天冬氨酸和谷氨酸氨基酸，它們相差一個(gè)亞甲基,。聚(丙烯酸) (polyAA) 是一種合成聚合物,，其含有羧酸側(cè)鏈，其位置比在 polyD 和 polyE 中觀察到的更接近聚合物主鏈,。體內(nèi)研究表明,，與精氨酸 (polyR) 和賴氨酸 (polyK) 類似的富含陽(yáng)離子氨基酸的尿蛋白與結(jié)石形成（即組蛋白）無(wú)關(guān)，盡管它們?cè)诮Y(jié)石基質(zhì)中觀察到,。

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2.0 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 材料

使用 HEPES（鈉鹽,，99%，Acros Organics）和來(lái)自 Sigma Aldrich 的以下試劑制備一水合草酸鈣 (COM) 晶體：草酸鈉（Na 2 C 2 O 4,，≥ 99.5%）,、二水合氯化鈣 (CaCl 2 ·2H 2O, ≥ 99 %) 和氯化鈉 (NaCl, ≥ 99 %)。這些研究中使用的聚電解質(zhì)購(gòu)自 Sigma Aldrich（具有不同分子量的多個(gè)不同批次）：聚 AA 偏鈉鹽,、聚 D 鈉鹽,、聚 E 鈉鹽、聚 K 氫溴酸鹽和聚 R 鹽酸鹽,。使用來(lái)自 Sigma Aldrich 的 11-巰基十一烷酸 (95%) 和巰基乙基胍半硫酸鹽對(duì)原子力顯微鏡 (AFM) 研究中使用的懸臂進(jìn)行了改性,。所有試劑均按原樣使用，無(wú)需進(jìn)一步純化,。

2.2 一水草酸鈣結(jié)晶

用于 AFM 分析的 COM 晶體是通過(guò)旨在最大化 (100) 表面的程序合成的,。通過(guò)首先將NaCl溶解在去離子水中，然后在攪拌下加入2mL 10mM CaCl 2在玻璃小瓶中制備20mL組成為1.0 mM CaCl 2 : 1.0 mM Na 2 C 2 O 4 : 150 mM NaCl的溶液,。在加入 2 mL 的 10 mM Na 2 C 2 O 4之前,，將樣品瓶密封并在 60°C 的烘箱中放置一小時(shí)滴加,，然后將樣品放回烘箱中至少 48 小時(shí)，以使 COM 完全結(jié)晶,。用于生成具有大 (010) 和 (12-1) 面的 COM 晶體的詳細(xì)程序在之前的論文中有所報(bào)道[ 52 ],。

通過(guò)混合 10 mM CaCl 2和 Na 2 C 2 O 4儲(chǔ)備溶液合成用于聚集測(cè)定的 COM 晶體“種子”以 1 mL/min 的速率（總體積 = 4 L），然后在室溫下攪拌一周,。通過(guò)重力使晶體沉降,，其中吸出上清液并通過(guò)低速離心回收晶體。晶體用甲醇洗滌兩次并在空氣中于65℃干燥,。使用粉末 X 射線衍射（由 Neil Mandel,，Mandel International Stone and Molecular Analysis Center，Milwaukee,，WI）確認(rèn)一水合物晶體結(jié)構(gòu),。通過(guò)將干燥晶體懸浮在緩沖溶液（10 mM HEPES 和 150 mM NaCl，pH 7.5）中制備 1.5 mg/mL 晶種儲(chǔ)備溶液,，使用前連續(xù)攪拌 3 周,。

2.3 AFM 化學(xué)力顯微鏡測(cè)量

AFM 測(cè)量使用 Asylum Research MFP-3D Stand Alone 儀器（加利福尼亞州圣巴巴拉）進(jìn)行。氮化硅懸臂（Veeco Probes,，NP 模型）用于所有化學(xué)力顯微鏡 (CFM) 測(cè)量,。懸臂彈簧常數(shù)是通過(guò)熱法[ 53 ]測(cè)量的，其產(chǎn)生的值在制造商報(bào)告的值的 ±50% 范圍內(nèi) (0.12 N/m),。使用既定程序[ 52 ]將官能團(tuán)固定在 AFM 尖端上,，其中尖端表面涂有 5 納米鉻層，然后是 30 納米金,。使用 11-巰基十一烷酸 SH(CH 2 ) 10 COO立即將吸頭浸入 1 mM 硫醇溶液（乙醇中） -立即將吸頭浸入 1 mM 硫醇溶液（乙醇中）, 和巰基乙基胍, SH(CH 2 ) 2 NHC(NH 2 ) 2 + , 分別用羧酸根和脒基團(tuán)對(duì) AFM 尖端進(jìn)行功能化。

所有 CFM 測(cè)量均在 0.11 mM 草酸鈣 (CaOx) 溶液中進(jìn)行,。首先對(duì) COM 晶體的 (100) 表面進(jìn)行成像,，以定位合適的區(qū)域進(jìn)行力測(cè)量。通過(guò)輕輕接合尖端并以低掃描速率 (1.0 Hz) 在輕敲模式下成像,，可以最大限度地減少尖端損壞,。以接觸模式測(cè)量解結(jié)合力，偏轉(zhuǎn)設(shè)定點(diǎn)為 20 nm,，回縮速度為 6 μm/sec,。A 5 × 5 μm 2隨機(jī)取樣晶體表面上的區(qū)域，在大約 10 處測(cè)量 10 條力曲線,。25個(gè)不同的地點(diǎn),。液體池經(jīng)常用新鮮的 CaOx 溶液補(bǔ)充，每次液體注入后允許 15 分鐘使激光偏轉(zhuǎn)信號(hào)平衡,。在不同的表面積上重復(fù)上述程序以生成超過(guò) 1200 條單獨(dú)的力拉斷曲線,。將數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為力直方圖,，并使用正態(tài)分布計(jì)算平均力（標(biāo)記為 F CaOx，用于修飾尖端與裸露 COM (100) 表面的相互作用）,。

在聚電解質(zhì)存在的情況下,，通過(guò)將含有 5 μg/mL 聚合物的 0.11 mM CaOx 溶液注入樣品池并允許 1.5 小時(shí)進(jìn)行平衡來(lái)測(cè)量解結(jié)合力。AFM 測(cè)量使用相同的協(xié)議進(jìn)行,。在聚電解質(zhì)（標(biāo)記為 F添加劑）存在的情況下,，改性尖端和 COM (100) 表面之間的解結(jié)合力是根據(jù) 1200 條或更多拉斷曲線的平均值計(jì)算的。

2.4 COM-聚電解質(zhì)聚集測(cè)定

COM 晶體聚集的評(píng)估如前所述[ 49 ],。0.25 mM CaOx 在 HEPES 緩沖液（HB：150 mM NaCl 和 10 mM HEPES,，pH 7.5）中的亞穩(wěn)態(tài)溶液與或不與聚電解質(zhì)一起在 37°C 下孵育 15 分鐘。將COM晶種加入緩沖溶液(HB中的1.5mg/mL晶種)并將漿液混合1小時(shí),。測(cè)量粒度（參見(jiàn)第 2.6 節(jié)）以評(píng)估在不存在和存在聚電解質(zhì)的情況下的聚集水平,。在對(duì)帶相反電荷的聚電解質(zhì)混合物的研究中，首先將聚陽(yáng)離子添加到 COM 漿料中,，然后添加聚陰離子,，在分析之前允許孵育 1 小時(shí)。顆粒直徑的相對(duì)變化 (R D ) 被用作顆粒聚集的評(píng)估,，

2.5 聚電解質(zhì)聚集測(cè)定

在單獨(dú)的 96 孔板（總體積 = 0.2 mL）中制備聚陽(yáng)離子和聚陰離子混合物的系列稀釋液,，其組成為 HB 中的 0.25 mM CaOx（即高鹽）或 10 mM HEPES 中的 0.075 mM CaOx，pH 7.5（即低鹽） . 基于使用 SPEC96 的計(jì)算,，CaOx 濃度代表了兩種不同鹽濃度下的相對(duì)過(guò)飽和度的等效水平,，SPEC96 是由 George Nancollas 開(kāi)發(fā)的物種形成程序（經(jīng)許可使用）。在室溫下進(jìn)行比濁法（λ630,，PowerWave XS,，Biotek）和粒度分析，在加入聚電解質(zhì)后進(jìn)行 15 分鐘的平衡期,。

2.6 粒度分布分析

使用 Accusizer 780 (Particle Sizing Systems, Santa Barbara, CA) 表征添加和不添加聚電解質(zhì)的 COM 晶體漿液,。該儀器配備了一個(gè) 10-mL 進(jìn)樣針筒，每次分析以求和模式 (0.5–500 μm) 測(cè)量重復(fù)的 4-mL 樣品,。通過(guò)將 100–300 μL 等分試樣添加到 15 mL 尺寸緩沖液（0.225 mM CaOx,，HB）中，立即評(píng)估 COM 晶體聚集測(cè)定樣品的粒徑,。

2.7 Zeta 電位測(cè)量

zeta 電位通過(guò) NICOMP 380/ZLS (Particle Sizing Systems, Santa Barbara, CA) 使用動(dòng)態(tài)光散射法測(cè)定電泳遷移率進(jìn)行測(cè)量,。將樣品置于配備鉑電極的塑料比色皿中。在沒(méi)有施加電場(chǎng)的情況下獲取參考功率譜,，然后在恒定電場(chǎng)下第二次獲得樣品光譜,。內(nèi)置軟件用于計(jì)算多普勒頻移（即參考光譜和樣品光譜之間的頻率變化）以獲得電泳遷移率，(2)

其中 U 是電泳遷移率 (μm/sec), Δν 是多普勒頻移, λ o是激光波長(zhǎng), n是溶液折射率, θ 是散射角, E是施加的電場(chǎng) (V/cm ）。zeta 電位 (ζ) 由 Smoluchowski 方程計(jì)算：

通過(guò)將 750 μg COM 晶體漿液放入含有 3 mL 飽和草酸鈣和 NaCl 的比色皿中,，制備用于測(cè)量 zeta 電位的樣品,。將聚電解質(zhì)添加到漿料中，1小時(shí)以吸附到晶體表面,。在二元聚電解質(zhì)混合物的研究中,，首先添加聚陽(yáng)離子并在添加聚陰離子之前平衡 1 小時(shí)（盡管我們觀察到混合順序?qū)?shí)驗(yàn)結(jié)果沒(méi)有可檢測(cè)的影響）。

3.0 結(jié)果與討論

3.1 聚合物-聚合物相互作用

大多數(shù)蛋白質(zhì)分子分散（即溶解）在尿液中,，這是一種復(fù)雜的水溶液,。一般來(lái)說(shuō)，蛋白質(zhì)在溶液中通過(guò)存在親水性（特別是離子性）氨基酸和翻譯后修飾來(lái)穩(wěn)定,。在溶液中,，由于存在大量促進(jìn)折疊（二級(jí)和三級(jí)）結(jié)構(gòu)的疏水氨基酸，這些蛋白質(zhì)可能比完全離子聚合物更緊湊,。對(duì)結(jié)石形成很重要的聚合物-聚合物相互作用是長(zhǎng)距離的（長(zhǎng)度尺度與蛋白質(zhì)的大小相稱或更長(zhǎng)）并且可以促進(jìn)大分子（例如蛋白質(zhì)）的聚集,。雖然某些蛋白質(zhì)能夠形成離散大小的穩(wěn)定聚集體（僅包含幾個(gè)單獨(dú)的蛋白質(zhì)分子），聚集可以在更大的范圍內(nèi)發(fā)生,，導(dǎo)致相分離,。將幾乎等量的高陰離子蛋白質(zhì)與高陽(yáng)離子蛋白質(zhì)混合提供了這種行為的典型例子。[ 54 ]事實(shí)上,，據(jù)報(bào)道這種混合物會(huì)引起 COM 晶體聚集,，盡管當(dāng)時(shí)沒(méi)有發(fā)現(xiàn)聚合物聚集相的存在[ 49 ]。蛋白質(zhì)誘導(dǎo)的 COM 聚集的一個(gè)例子是蛋白質(zhì) Tamm-Horsfall 蛋白質(zhì) THP,，它是一種弱電解質(zhì),，具有通過(guò)疏水力形成大聚集體的傾向。先前的研究表明,，在晶體表面適度的 THP 聚集體吸附條件下,，COM 晶間聚集得到促進(jìn)[ 48 ]，從而為先前文獻(xiàn)中相互矛盾的觀察提供了背景,。事實(shí)上,，這些發(fā)現(xiàn)突出了聚合物-晶體相互作用對(duì)聚合物聚集行為的敏感性。

由于帶相反電荷的聚電解質(zhì)在醫(yī)學(xué),、生物技術(shù),、光子學(xué)和催化等方面的應(yīng)用,，出現(xiàn)了許多與自組裝相關(guān)的實(shí)驗(yàn)和理論研究[ 55 ],。關(guān)于聚合物逐層 (LbL) 組裝[ 56 ]的大量工作已經(jīng)發(fā)表，其中多組分結(jié)構(gòu)是通過(guò)相互作用構(gòu)建的,，包括（但不限于）靜電,、氫鍵、共價(jià)鍵、疏水相互作用,、雜交和/或生物識(shí)別[ 56 – 59 ]. 溶液中帶相反電荷的聚合物的締合導(dǎo)致相分離已被廣泛研究為聚合物鏈長(zhǎng)度以及溶液的 pH 值和離子強(qiáng)度的函數(shù),，包括遠(yuǎn)離生理相關(guān)性的條件[ 54 ]. 先前的研究表明，即使聚合物濃度非常低（< 0.1% 或 < 1μg/ mL）和中等鹽濃度（0.05 至 0.5 M NaCl）,。聚合物縮合通過(guò)類似于 Gower 等人描述的聚合物誘導(dǎo)液相 (PILP) 形成的過(guò)程耗盡了聚陽(yáng)離子和聚陰離子的溶液[ 60 ]. PILP 工藝已在生物礦化系統(tǒng)中得到廣泛研究,。雖然即使在較低濃度下聚陰離子-聚陽(yáng)離子配對(duì)也受到強(qiáng)烈青睞，但在這種條件下檢測(cè)聚集體通常是有問(wèn)題的,。在高（非生理）鹽濃度下,，當(dāng)小離子達(dá)到足以篩選驅(qū)動(dòng)聚合物聚集的長(zhǎng)程離子相互作用的濃度時(shí)，聚合物聚集體會(huì)重新分散（或重新溶解）,。在兩相區(qū)域,，聚合物聚集相的微觀液滴可以聚結(jié)，類似于油水混合物的行為,。在低液滴濃度下,，聚合物聚結(jié)可能需要幾分鐘或更長(zhǎng)時(shí)間,。預(yù)計(jì)隨著聚合物或蛋白質(zhì)鏈變長(zhǎng)，分離相將更容易形成；當(dāng)帶相反電荷的鏈上的相反電荷的數(shù)量幾乎相同時(shí),，聚集體的形成將最大化。在具有不等量的帶相反電荷的蛋白質(zhì)的混合物中仍會(huì)發(fā)生聚集（例如,，據(jù)報(bào)道只有 10% 的次要成分）[ 54 ],。這些聚集體在非化學(xué)計(jì)量的聚陰離子-聚陽(yáng)離子混合物中的存在引起了 COM 成核、聚集和生長(zhǎng)速率的變化[ 61 ],。

聚電解質(zhì)相行為的一個(gè)代表性例子在圖 2對(duì)于 polyR 和 polyD 的混合物,，這與下面討論的蛋白質(zhì)-晶體相互作用研究有關(guān)。聚合物聚集體的形成（第二相的存在）通過(guò)在較高聚合物濃度下含有幾乎等量的 polyR 和 polyD 的混合物的濁度增加來(lái)檢測(cè),。請(qǐng)注意,，與以前的研究[ 54 ]相似，與低鹽條件相比,，在生理鹽濃度下，兩相區(qū)域擴(kuò)展到更低的聚合物濃度,。中的虛線圖 2表示對(duì)應(yīng)于 1:1 polyD-polyR 混合物的中性 +/- 電荷比（基于單體,，假設(shè)完全電離）,。雖然預(yù)計(jì)聚電解質(zhì)聚集會(huì)發(fā)生在零電荷線附近,，在該線周?chē)a(chǎn)生對(duì)稱的兩相區(qū)域,，但觀察到的兩相區(qū)域明顯轉(zhuǎn)移到富含聚陽(yáng)離子的溶液中,。從等電荷線觀察到的位移的解釋仍然不確定,，盡管它可能反映了與聚陰離子相比聚陽(yáng)離子的電離不完全或前者中的雜質(zhì)含量更高,。為此,，使用離子色譜法通過(guò)測(cè)量反離子濃度（Na +用于 polyD 和 Cl -或 Br -聚R）。這些實(shí)驗(yàn)表明,，基于添加的聚合物重量,， Na +濃度約為 polyD 預(yù)期值的 95%,，但 polyR 樣品中 Cl- 或 Br- 的預(yù)期值僅為預(yù)期值的 80%,；與觀察到的富含聚陽(yáng)離子的條件的偏移一致圖 2.

圖 2

polyR-polyD 混合物在低鹽和 150 mM NaCl 下的相圖。polyR 和 poly D 的分子量分別為 26 和 36 kDa,。虛線表示具有相等數(shù)量的陰離子和陽(yáng)離子（計(jì)算）的組成,。濁點(diǎn)測(cè)定基于使用粒度儀作為檢測(cè)器,。在含有幾乎等量的 polyR 和 polyD 的混合物中,，在較高的聚合物濃度下觀察到濁度增加,，表明聚合物聚集體的形成,；第二，濃縮的聚合物相,，在這些稀溶液中。請(qǐng)注意,，與未添加鹽相比,，在 150 mM NaCl 存在下,，在較低的總聚合物濃度下觀察到兩相區(qū)域。

觀察到的相行為可以基于靜電力和周?chē)娊赓|(zhì)對(duì)聚合物鏈上電荷的篩選來(lái)解釋,。例如,，聚陰離子鏈上的電荷位點(diǎn)相對(duì)于同一聚合物鏈上的其他陰離子位點(diǎn)會(huì)受到靜電排斥力，這有利于鏈的拉伸以增加近端電荷之間的距離，從而減少靜電排斥,。同樣，該鏈會(huì)排斥溶液中的其他陰離子鏈以保持分散,。引入該環(huán)境的陽(yáng)離子聚合物（或蛋白質(zhì)）上的正電荷會(huì)與陰離子聚合物產(chǎn)生靜電吸引力，從而導(dǎo)致離子配對(duì)相互作用,，從而同時(shí)降低聚陰離子上陰離子部分之間的凈排斥力。[ 54 ]添加的鹽屏蔽靜電相互作用,，減少聚合物內(nèi)/聚合物間的吸引力和排斥性相互作用,，盡管在生理鹽濃度下長(zhǎng)程相互作用仍然足夠強(qiáng)，以允許聚合物聚集體形成和相分離,。在鹽濃度為 1M 或更高時(shí),，電解質(zhì)會(huì)屏蔽除極短程電荷相互作用外的所有電荷相互作用，從而消除因長(zhǎng)程相互作用而產(chǎn)生的帶相反電荷的聚合物之間的吸引力放大,，從而導(dǎo)致聚合物聚集體重新溶解,。這些條件超出了正常尿液生理學(xué)的范圍，但靜電篩選的一般概念對(duì)于理解弱電荷聚電解質(zhì)（如 THP）的溶液行為很重要,。

由于帶電基團(tuán)的存在,，聚電解質(zhì)在水溶液中穩(wěn)定。例如,，尿蛋白（即帶弱電的聚電解質(zhì)）主要是陰離子的,。許多蛋白質(zhì)的球狀或三級(jí)結(jié)構(gòu)（即鏈折疊基序）是熵驅(qū)動(dòng)力的結(jié)果（特別是疏水性氨基酸從與水的接觸中去除以最小化自由能）。溶解鹽的存在通常會(huì)降低尿蛋白的溶解度,，因?yàn)檩^弱的遠(yuǎn)程靜電排斥力更容易被壓倒,。這些蛋白質(zhì)的聚結(jié)（聚集）受疏水相互作用和范德華力的支配，但蛋白質(zhì)聚集引起的電荷積累可能達(dá)到一個(gè)臨界極限,，阻止進(jìn)一步添加超出有限大小的蛋白質(zhì),。[ 48 ]在 150 mM NaCl（生理鹽水）中,，其中有限大小的穩(wěn)定聚集體的形成與 THP 濃度無(wú)關(guān)。相反,，相同的蛋白質(zhì)在低鹽濃度下保持分子分散（溶解）,。對(duì)于天然 THP，觀察到相同的行為,，但鹽濃度要高得多,。值得注意的是，天然 THP 保持分子分散在 150 mM NaCl 中,，但通過(guò)在 ca 處聚集而與溶液（和其他溶解的蛋白質(zhì)）相分離,。0.5 M 氯化鈉。如下所述,，天然或脫唾液酸 THP 的聚集體誘導(dǎo) COM 晶體聚集,，而它們的分子分散形式阻止了晶體聚集。對(duì) THP 的許多不一致結(jié)果中的實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行仔細(xì)審查[ 32 , 62– 67 ]表明 THP 聚集體的存在與否可能是這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果中無(wú)法識(shí)別的變量,。

由于 THP 在水中的有限溶解度和聚集相的兩親性質(zhì)以適應(yīng)典型蛋白質(zhì)中的離子和疏水部分,，因此在尿液環(huán)境中觀察到的 THP 蛋白質(zhì)聚集體形成似乎可以推廣到其他蛋白質(zhì)。最直接的例子在圖 3,，其中 1 維十二烷基硫酸鈉 (SDS) 聚丙烯酰胺凝膠電泳數(shù)據(jù)描繪了泳道 2 中的正常尿液大分子,、殘留在上清液中的大分子（泳道 3）和包含在通過(guò)向尿液中添加 polyR 形成的蛋白質(zhì)聚集體中的大分子（車(chē)道 4)。為 THP 和另外兩種常見(jiàn)的尿蛋白,，人血清白蛋白 (HSA) 和骨橋蛋白 (OPN) 指明了洗脫位置,。顯然，大多數(shù)尿蛋白都包含在聚集相中,，盡管只有 OPN 可以被合理地描述為一種強(qiáng)聚陰離子,，它會(huì)主導(dǎo)與 polyR 的相互作用。對(duì)于帶弱電的聚電解質(zhì)（例如,，THP）,，這種趨勢(shì)在 Far Western 印跡中得到了例證,，在 SDS-PAGE 凝膠上,，去唾液酸化的 THP 對(duì)大多數(shù)尿蛋白表現(xiàn)出很強(qiáng)的親和力。然而,，

圖 3

銀染 SDS-PAGE 分析揭示了正常尿液大分子的條帶（泳道 2）,、通過(guò)向尿蛋白混合物中添加 polyR 誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)聚集體（泳道 4）以及用 polyR 分離蛋白質(zhì)聚集體后保留在溶液中的蛋白質(zhì)部分（車(chē)道 3）。大多數(shù)蛋白質(zhì)出現(xiàn)在聚集相中,，其中許多蛋白質(zhì)在聚集相和上清液中都存在,，少數(shù)蛋白質(zhì)在上清液中富集。分子量標(biāo)記顯示在泳道 1 中,。

3.2 蛋白質(zhì)-晶體相互作用

分子量效應(yīng)

蛋白質(zhì)的聚合性質(zhì)是蛋白質(zhì)與 CaOx 晶體表面相互作用的重要考慮因素,，因?yàn)榫垭娊赓|(zhì)中離子側(cè)鏈的數(shù)量強(qiáng)烈影響它們與晶體表面的相互作用,，進(jìn)而影響它們作為晶體生長(zhǎng)抑制劑的功效。我們使用一系列分子量的 polyD 探索了 CaOx 晶體生長(zhǎng)速率抑制的分子量依賴性,，它經(jīng)常用作陰離子尿蛋白（如 OPN）的模型聚合物,。如圖所示圖 4，當(dāng)將含有 60 個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)與獨(dú)立作用的氨基酸單體進(jìn)行比較時(shí),，實(shí)現(xiàn)對(duì)結(jié)晶過(guò)程的等效抑制所需的 polyD 濃度降低了約 10,000 倍,。在比較 COM 晶種的聚集抑制時(shí)觀察到類似的行為（圖 4, 鉆石) 或直接結(jié)晶到 COD 而不是熱力學(xué)更穩(wěn)定的 COM 相的能力 (圖 4, 圓圈), 兩者都與顯著的 COM 生長(zhǎng)速率抑制相關(guān) (>90%) [ 61 , 68 ]。

圖 4

聚合物分子量對(duì)抑制 COM 聚集或 COD 形成的影響在此聚合物濃度 (conc) 與polyD聚合度 ( n , 鏈長(zhǎng)) 的對(duì)數(shù)圖中說(shuō)明,。菱形顯示在聚集測(cè)定中達(dá)到 R D = 0.9所需的每個(gè)分子量的聚 D 濃度,。圓圈顯示實(shí)現(xiàn) 50% COD 形成所需的每個(gè)分子量的 polyD 濃度，作為 COM 生長(zhǎng)速率抑制的量度,。

在 CaOx 生長(zhǎng)抑制中 polyD 和 polyAA 的臨界分子量可以定義為在測(cè)試一系列分子量時(shí)需要聚陰離子的最小質(zhì)量濃度（單體單元的數(shù)量）以達(dá)到相同的抑制水平的分子量,。如圖所示圖 5，在對(duì)各種分子量的 polyAA（正方形）和 polyD（菱形）進(jìn)行自發(fā)成核試驗(yàn)中獲得 50% COD 所需的聚合物濃度揭示了每種聚合物的臨界分子量（polyAA 約為 5 kDa,，polyD 約為 15 kDa） . 值得注意的是,，polyAA 似乎是更有效的 CaOx 結(jié)晶抑制劑，因?yàn)樾枰倭亢透痰逆湶拍苓_(dá)到相同的抑制水平,。觀察到 polyAA 抑制 CaCO 3形成的類似特征,，已對(duì)其防止水管中的 CaCO 3結(jié)垢進(jìn)行了檢查[ 69 ]. 這些研，足夠大的聚合物,，可以有效地阻擋整個(gè)生長(zhǎng)部位,。更大的聚合物沒(méi)有提供比臨界尺寸聚合物更大的益處，因?yàn)橹辽僖粋€(gè)鏈必須結(jié)合以阻斷生長(zhǎng)位點(diǎn),，并且超出阻斷活性生長(zhǎng)位點(diǎn)所需量的額外單體會(huì)增加質(zhì)量濃度而不增加抑制性能,。

圖 5

在自發(fā)成核實(shí)驗(yàn)中誘導(dǎo) COD 形成所需的聚合物濃度與分子量的關(guān)系。菱形顯示 polyD 分子量系列的數(shù)據(jù),。正方形顯示聚AA 分子量系列的數(shù)據(jù),。最小質(zhì)量濃度記錄在 ca。polyAA 和 ca 為 5 kDa,。polyD 為 15 kDa,，表明這些分子量的抑制劑效果最大。

聚合物化學(xué)結(jié)構(gòu)效應(yīng)

定義 CaOx 晶體的晶面是檢查 CaOx 晶體相互作用的重要第一步,，因?yàn)楸砻骐x子的排列和取向在 COM 和 COD 晶體的不同面之間不同（圖 6）,。例如，我們已經(jīng)觀察到不同晶面的優(yōu)選聚合物相互作用[ 30 ],。在先前的化學(xué)力顯微鏡 (CFM) 研究中,，我們測(cè)量了具有特定 CaOx 晶體表面的化學(xué)功能化原子力顯微鏡 (AFM) 尖端的解結(jié)合力。鍍金 AFM 尖端分別用 11-巰基十一烷酸或巰基乙基胍修飾以模擬天冬氨酸/谷氨酸（羧酸,，-COO -）或精氨酸（脒,，-C(NH 2 ) 2 +）側(cè)鏈,。COM（100）面（大六邊形表面）表現(xiàn)出最強(qiáng)的脫附力，而 COD（101）面（大三角形表面）表現(xiàn)出最弱的脫附力[30 ],。解結(jié)合力與每個(gè)面的表面離子（Ca +2或 Ox -2）密度相關(guān),，COM 晶體在結(jié)石中比 COD 更常見(jiàn)的臨床觀察[ 44 , 70 , 71 ]與以下事實(shí)一致：COM 晶體上最大的面最有粘性，而 COD 上最大的面對(duì)常見(jiàn)的蛋白質(zhì)官能團(tuán)的粘性最小[ 72 ],。

圖 6

COM（上）和 COD（下）晶體主要面的米勒指數(shù)在相鄰顯微照片的示意圖中顯示,，以及它們的空間群和晶胞尺寸。

類似地,，可以通過(guò)比較陰離子聚合物或尿蛋白對(duì) CaOx 晶體表面的影響來(lái)觀察它們對(duì) CFM 測(cè)量每個(gè)表面的非結(jié)合力的影響,。如圖所示圖 7[ 73 ]，三種陰離子聚電解質(zhì)通常會(huì)降低 COM 晶體三個(gè)主表面中每一個(gè)的羧酸官能化尖端的解結(jié)合力（除了聚 E 對(duì) (100) 面的解結(jié)合力的影響可以忽略不計(jì)）,。這些數(shù)據(jù)表明,，聚陰離子通常與 COM 面強(qiáng)烈結(jié)合，干擾尖端晶體結(jié)合,，盡管 polyE 與 (100) 表面的較弱相互作用表明這種相互作用具有一定的化學(xué)特異性,。同樣，使用脒修飾尖端的 CFM 測(cè)量產(chǎn)生了類似的結(jié)果（參見(jiàn)圖 8),，盡管在這種情況下,，與 polyD 和 polyE 相比，polyAA 在降低 COM (100) 處的解結(jié)合力方面表現(xiàn)出降低的效果,。

圖 7

在 150 mM NaCl 溶液中羧酸功能化 AFM 尖端和各種 COM 晶面之間的解結(jié)合力的化學(xué)力顯微鏡測(cè)量,。在 5 μg/mL 的多肽濃度下，使用和不使用各種多肽添加劑進(jìn)行測(cè)量,。（經(jīng)參考文獻(xiàn)73許可轉(zhuǎn)載）

圖 8

在含有各種聚電解質(zhì)的溶液中使用脒和羧酸官能化 AFM 尖端在 COM (100) 表面測(cè)量相對(duì)解結(jié)合力,。相對(duì)解結(jié)合力計(jì)算為在聚電解質(zhì) F添加劑存在下測(cè)得的力與在沒(méi)有添加劑 F CaOx的情況下在裸 COM (100) 表面上測(cè)得的力之比

在聚合物添加劑存在下生長(zhǎng)的 COM 表面的原位AFM 測(cè)量揭示了三個(gè)突出的 COM 表面的各向異性生長(zhǎng)速率的明顯差異：(100)、(010) 和 (12-1) 面[ 50 ],。值得注意的是,，polyE 減少了沿 [010] 方向的生長(zhǎng)（即類似于尿蛋白的影響，例如 OPN [ 74 , 75 ]）,，而 polyD 和 polyAA 抑制了沿 [100] 方向的 COM 生長(zhǎng),。PolyAA 是兩個(gè)面上所有測(cè)量方向上最有效的分層生長(zhǎng)抑制劑,。PolyE 在 (100) 面上表現(xiàn)出較弱的生長(zhǎng)抑制,，但在 (010) 面上比 polyD 更有效，這與 CFM 測(cè)量結(jié)果一致。50 ]。

分子水平上化學(xué)官能團(tuán)與晶體表面相互作用的差異與報(bào)告的體結(jié)晶特性差異相關(guān),，例如自發(fā)成核 CaOx 晶體的相和形態(tài)。雖然 polyD 和 polyAA 促進(jìn) COD 結(jié)晶，但 polyE 在較高（生理相關(guān)）濃度下誘導(dǎo) COM 的啞鈴聚集體。[ 50 , 68 ]帶有羧酸殘基的聚陰離子強(qiáng)烈抑制 COM 生長(zhǎng)，抑制效果按 polyAA > polyD > polyE 的順序降低[ 61 ]. 雖然這些聚合物在防止 COM 晶種在接近平衡條件下聚集方面表現(xiàn)出大致相同的效果,，所有這些都促進(jìn)了分解[ 49 , 61 ],，但它們?cè)谶^(guò)飽和介質(zhì)中的效果不同,。PolyD 阻止了在恒定成分生長(zhǎng)試驗(yàn)中通常在過(guò)飽和（生長(zhǎng)）條件下觀察到的 COM 聚集，這被定義為與生長(zhǎng)相關(guān)的聚集,，而 polyE 促進(jìn)了這一過(guò)程[ 61 ]. PolyAA 未在該系統(tǒng)中進(jìn)行測(cè)試,，因?yàn)樗鼤?huì)干擾鈣敏感電極在恒定成分測(cè)定中的功能,。總之,，這些觀察表明聚陰離子通常與 COM 結(jié)合并抑制生長(zhǎng)和聚集過(guò)程，但 polyD,、polyE 和 polyAA 側(cè)基之間化學(xué)結(jié)構(gòu)的微小差異與面選擇性和本體結(jié)晶過(guò)程的差異有關(guān),。這些差異在本文所述的聚電解質(zhì)混合物研究中具有重要的影響。

誠(chéng)然，與模型聚電解質(zhì)相比,，天然蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)更復(fù)雜,，因?yàn)榍罢甙S多不同的氨基酸（例如，D 和 E 殘基的組合）,、額外的陰離子位點(diǎn)（例如,，磷酸化和糖基化），以及更復(fù)雜的二級(jí)/三級(jí)結(jié)構(gòu). 雖然對(duì)天然陰離子尿蛋白的實(shí)驗(yàn)傾向于支持聚陰離子對(duì) COM 結(jié)晶過(guò)程的抑制作用[ 76 ],，但已經(jīng)報(bào)道了一些意料之外的結(jié)果,。例如，在存在 OPN 的情況下,，在 (100) 表面測(cè)得的解結(jié)合力大于對(duì)照[ 52 ],，但 (010) 表面上的優(yōu)先結(jié)合與生長(zhǎng)小丘形成的動(dòng)力學(xué)抑制有關(guān)[77 ]。由于 OPN 主要包含 D 殘基（25% 與 15% E 殘基相比）,，因此可以預(yù)期 OPN 結(jié)合會(huì)降低 (100) 表面的解結(jié)合力,。同樣，它對(duì) (010) 表面的結(jié)合偏好令人驚訝,。幾項(xiàng)體內(nèi)研究已將 OPN 與促進(jìn)結(jié)石形成聯(lián)系起來(lái),，主要是通過(guò)其同時(shí)結(jié)合 CaOx 晶體和細(xì)胞表面的能力[ 45 ]. 顯然，其他化學(xué)結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)必須在天然蛋白質(zhì)與 COM 晶體和石頭的相互作用中發(fā)揮作用,。其他天然蛋白質(zhì),，如血清白蛋白和 THP，與 CaOx 晶體的相互作用要弱得多,，但只要它們作為分子分散的物質(zhì)留在溶液中,，它們?nèi)匀粫?huì)抑制晶體生長(zhǎng)和聚集。相反,，蛋白質(zhì)可以作為晶體生長(zhǎng)促進(jìn)劑,。最近的一份報(bào)告[ 17 ]描述了從石基質(zhì)中提取并通過(guò)離子交換色譜和分子篩純化的蛋白質(zhì)促進(jìn) COM 生長(zhǎng)，盡管 SDS-PAGE 分析表明其中一些分離物含有一種以上的蛋白質(zhì),。Farmanesh 等人的另一份報(bào)告,。描述了兩種蛋白質(zhì)（溶菌酶和乳鐵蛋白）以及含有陰離子和陽(yáng)離子殘基的溶菌酶肽片段的類似生長(zhǎng)促進(jìn)作用[ 51 ]。

還必須考慮非離子氨基酸的作用,。事實(shí)上,，大多數(shù)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)都以非離子氨基酸為主，它們通常對(duì)結(jié)晶沒(méi)有明顯影響,。檢查天然蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)片段的實(shí)驗(yàn)表明,，通過(guò)增加片段中陰離子側(cè)鏈的數(shù)量來(lái)增強(qiáng)抑制特性，通常是通過(guò)調(diào)整翻譯后修飾,，如磷酸化[ 78-81 ],。對(duì)于含有不同數(shù)量/序列的天冬氨酸殘基的模型肽，已經(jīng)報(bào)道了類似的工作，隨著酸含量的增加對(duì) COM 生長(zhǎng)的抑制作用增強(qiáng)[ 82 ]. 除了稀釋強(qiáng)相互作用的陰離子基團(tuán)的影響或帶電基團(tuán)沿一級(jí)序列的空間分離之外,，非離子氨基酸顯然對(duì)蛋白質(zhì)-晶體相互作用幾乎沒(méi)有影響,，盡管一份出版物顯示了氫鍵，非離子氨基酸與其他非離子氨基酸相比,，絲氨酸可以增強(qiáng)表面相互作用[ 83 ],。此外，基于方解石（碳酸鈣）中的數(shù)據(jù),，已經(jīng)建議晶體表面的疏水相互作用在加速生長(zhǎng)中發(fā)揮重要作用[ 84 ]. 雖然對(duì)數(shù)百種尿蛋白混合物的復(fù)雜性進(jìn)行建模超出了我們目前對(duì)蛋白質(zhì)-晶體相互作用的理解水平,，但大量研究表明,，來(lái)自正常個(gè)體的蛋白質(zhì)混合物會(huì)抑制 COM 晶體的生長(zhǎng)和聚集,，這與凈陰離子特征一致蛋白質(zhì)混合物[ 85 ]。在我們的實(shí)驗(yàn)中,，使用 polyD 作為仿生聚陰離子可以最好地模擬各種體積結(jié)晶研究中尿蛋白混合物的行為,。

先前的研究表明，聚陽(yáng)離子,，例如 polyR 和 polyK,，在體積測(cè)量中是 COM 晶體生長(zhǎng)的無(wú)效抑制劑。這有點(diǎn)令人驚訝,，因?yàn)?CFM 測(cè)量顯示脒鎓和羧酸功能化 AFM 尖端與 CaOx 晶體表面的粘合相互作用強(qiáng)度相似[ 52 ],。在接近平衡的條件下，與聚陰離子相比,，這些聚陽(yáng)離子較弱地分解 COM 晶種,，它們對(duì)生長(zhǎng)、聚集或相選擇性的影響很小或沒(méi)有影響[ 61 ],，盡管在附近存在陽(yáng)離子殘基的蛋白質(zhì)和肽的促進(jìn)作用較弱,。已報(bào)道陰離子殘留物[ 51 ]. 此外，在自發(fā)成核實(shí)驗(yàn)中沒(méi)有觀察到這些陽(yáng)離子聚合物對(duì) COM 形態(tài)的明顯影響,。有趣的是,，溶液中 polyR 的存在不影響 COM（100）表面的羧酸功能化尖端的解結(jié)合力（參見(jiàn)圖 7)，表明聚陽(yáng)離子和 COM 表面之間的相互作用比羧酸基團(tuán)表現(xiàn)出的相互作用弱,。這些觀察結(jié)果與使用脒官能化尖端進(jìn)行的 CFM 測(cè)量一致（圖 8),，其中聚陰離子降低了解結(jié)合力，而聚陽(yáng)離子沒(méi)有效果,。在取決于聚合物側(cè)基的化學(xué)結(jié)構(gòu)的解結(jié)合力測(cè)量中觀察到差異,。值得注意的是，polyD 和 polyE 在解結(jié)合力方面表現(xiàn)出相似的降低,，而 polyAA 對(duì)脒官能化尖端的影響不太明顯,。相比之下，羧酸功能化的尖端數(shù)據(jù)顯示 polyAA 和 polyD 在降低非結(jié)合力方面同樣有效，而 polyE 無(wú)效,。

聚電解質(zhì)存在下的 Zeta 電位 (ζ) 測(cè)量 (表格1) 揭示了這些“模型蛋白”與 COM 表面結(jié)合并影響表面電荷,。在不存在聚電解質(zhì)（對(duì)照樣品）的情況下，COM 晶體在低鹽（0.15 mM CaCl 2和 Na 2 Ox）和高鹽（0.2 mM CaCl 2和 Na 2Ox 與 150 mM NaCl) 緩沖液,。在 5 μg/mL 濃度的聚陰離子存在下,，COM 晶體保持負(fù)電荷，但 ζ 的大小隨著 poly AA > poly D > control > poly E 而減小,，這與酸基團(tuán)電荷密度降低的趨勢(shì)相似每個(gè)聚電解質(zhì)中的每個(gè)單體,。高鹽條件（模擬生理鹽水）似乎使每個(gè)聚陰離子的表面負(fù)性更強(qiáng)，盡管電荷差異接近觀察到的 ±2 mV 測(cè)量誤差,。相反,，濃度為 5 μg/mL 的聚陽(yáng)離子 polyR 和 polyK 將凈電荷轉(zhuǎn)變?yōu)檎姾桑哂邢嗨频牧考?jí),，并且對(duì)添加的鹽濃度幾乎沒(méi)有依賴性,。顯然，

表格1

COM 晶體在均聚物溶液中的 Zeta 電位,。

在單獨(dú)的窗口中打開(kāi)

總的來(lái)說(shuō),，我們的觀察表明聚陰離子 (i) 在 COM 表面表現(xiàn)出非常強(qiáng)的結(jié)合相互作用，(ii) 將有效表面電荷修改為取決于單個(gè)吸附物的值,，以及 (iii) 通常在結(jié)晶的各個(gè)方面作為抑制劑起作用,。聚陰離子晶體相互作用的差異，特別是 polyD 和 polyE 之間的差異,，表明對(duì)吸附物的化學(xué)結(jié)構(gòu)敏感的細(xì)微差別,。另一方面，聚陽(yáng)離子與 COM 表面的相互作用較弱,，對(duì)結(jié)晶的影響要小得多,，盡管它們與 COM 結(jié)合到足以改變表面電荷的水平。經(jīng)典膠體化學(xué)認(rèn)為,，聚陽(yáng)離子與帶負(fù)電的顆粒（例如 COM 晶體）在懸浮液中的混合物應(yīng)誘導(dǎo)聚集[ 86 ]. 由于晶體聚集體是結(jié)石形成的重要組成部分,，因此更仔細(xì)地研究了表面電荷與聚集體之間的聯(lián)系。

polyR 對(duì) COM 表面電荷影響的系統(tǒng)研究表明,，隨著 polyR 濃度的增加,，ζ 增加，并且在約 1.43 ng polyR/μg COM 時(shí)實(shí)現(xiàn)了有效的 COM 電荷中和（ζ = 0 mV）,。圖 9A）,。隨著 COM 表面上的聚陽(yáng)離子覆蓋率進(jìn)一步增加，ζ 繼續(xù)快速上升到 ζ = +13 mV 的表觀飽和值（見(jiàn)表格1）,。在 ζ = 0 mV 區(qū)域仔細(xì)探索了作為 polyR 濃度函數(shù)的散裝 COM 聚集行為,。在 ζ = 0 mV 時(shí)表面電荷穩(wěn)定性的喪失應(yīng)該允許結(jié)合到晶體表面的聚合物鏈橋接相鄰的顆粒,，從而形成具有接近中性表面電荷的凝膠或聚集體，但這些聚集體應(yīng)該在較低或較高的聚合物濃度下消散帶電粒子會(huì)相互靜電排斥并穩(wěn)定溶液中的粒子懸浮液,。然而,，在 polyR 和 COM 晶體的混合物中沒(méi)有觀察到聚集（圖 9B）。顯然,，聚陽(yáng)離子以足夠的強(qiáng)度與 COM 表面結(jié)合以隨晶體遷移（在所謂的圍繞晶體表面的雙層內(nèi)）并將有效表面電荷從負(fù)電荷變?yōu)檎姾?。然而，聚?yáng)離子的這種結(jié)合不足以形成橋接相互作用或保護(hù)表面免受向晶格中添加更多鈣和草酸鹽離子或其他大分子（或化學(xué)修飾的 AFM 尖端）的粘附相互作用,。相反,，聚陰離子顯然與 COM 強(qiáng)烈結(jié)合并形成橋接相互作用，但它們明顯抑制聚集,。后一種結(jié)果可能僅僅是 COM 粒子電荷穩(wěn)定的結(jié)果,，但橋接相互作用也可能受到與晶體尺寸 (μm) 相比相對(duì)較短的聚合物鏈長(zhǎng) (nm) 的限制，[ 87 - 92 ],。

圖 9

(A) COM 晶體在 150 mM NaCl 中的 Zeta 電位作為 polyR 與 COM 晶體質(zhì)量比的函數(shù),，表示為 (ng polyR/μg COM)。近似 S 型依賴性顯示從 1ng/μg 的無(wú)影響 (ζ= -14 mV) 到 2 ng/μg 的接近飽和極限 (ζ= 12mV) 的急劇轉(zhuǎn)變,。(B) 來(lái)自聚合測(cè)定的 R D作為 polyR 與 COM 晶體質(zhì)量比的函數(shù)。在零表面電荷區(qū)域中測(cè)試了多個(gè)樣品,，發(fā)現(xiàn)沒(méi)有證據(jù)表明添加聚陽(yáng)離子 polyR 會(huì)誘導(dǎo) COM 晶體聚集,。虛線表示 R D對(duì)照（未添加 polyR）實(shí)驗(yàn)的值。觀察到的與對(duì)照的偏差在此測(cè)量的不確定性范圍內(nèi),，表明電荷中和不足以觸發(fā) COM 粒子聚集,。

蛋白質(zhì)聚集的影響

THP 的研究提供了蛋白質(zhì)聚集體-COM 晶體相互作用的清晰畫(huà)面，因?yàn)?THP 聚集體顆粒在比典型實(shí)驗(yàn)更長(zhǎng)的時(shí)間尺度（例如,，幾個(gè)小時(shí)）內(nèi)保持穩(wěn)定的尺寸,。使用 THP 聚集體與 COM 晶體質(zhì)量的不同比率獲得的數(shù)據(jù)產(chǎn)生了 COM 聚集體形成的變化，可以通過(guò)簡(jiǎn)單的吸附模型來(lái)描述,。這些計(jì)算表明,，COM 聚集在蛋白質(zhì)聚集體的低表面覆蓋率（約 30%）下最大化，因此結(jié)合到一個(gè)晶體表面的蛋白質(zhì)聚集體可以找到并結(jié)合到相鄰晶體上的暴露表面,，形成一個(gè)橋,，如圖所示圖 10. 在較高的表面覆蓋率下，相對(duì)晶體表面上吸附的 THP 聚集體的存在會(huì)阻礙晶體聚集,，因?yàn)榈鞍踪|(zhì)聚集體不容易相互粘連[ 48 ]. 天然 THP 分子也可以在較高鹽濃度（天然蛋白質(zhì)形成聚集體）下誘導(dǎo) COM 聚集這一事實(shí)證實(shí)了蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用在 COM 聚集中的關(guān)鍵作用,。沒(méi)有在生長(zhǎng)條件下用脫唾液酸化的 THP 進(jìn)行類似的研究，盡管我們預(yù)計(jì),，與相同濃度的分子分散蛋白質(zhì)相比,，THP 聚集體對(duì)生長(zhǎng)過(guò)程的抑制效果較差,，因?yàn)橛坞x蛋白質(zhì)顆粒的數(shù)量減少了。解決方案,。大多數(shù)尿液蛋白的相行為的相似性是通過(guò)在遠(yuǎn)西方印跡中去唾液酸化的 THP 和其他尿液蛋白之間的強(qiáng)相互作用暗示的[ 48 ]. 許多早期研究沒(méi)有考慮 THP 聚集體形成的可能性,，這并不奇怪地顯示出 THP 晶體相互作用的不同行為，正如該主題的先前評(píng)論中所總結(jié)的那樣[ 1 , 39 , 93 ],。

圖 10

圖示說(shuō)明了提議的去唾液酸化 THP-COM 聚合的覆蓋依賴性,。出于說(shuō)明目的，COM“種子”表面被描述為單晶,，具有 COM 晶體的特征拉長(zhǎng)六邊形形態(tài)（參見(jiàn)圖 6）,。吸附很可能發(fā)生在 (100) 表面上，該表面占單晶的最大表面積,，并且可能是 COM 晶種的主要表面積,。這里說(shuō)明了兩種情況，用于在 (A) 部分覆蓋 (50%) 和 (B) 完全覆蓋 (100%) 時(shí)將聚集體吸附到 COM,。前者通過(guò)晶體 - 蛋白質(zhì) - 晶體橋接相互作用促進(jìn) COM 聚集,，而在某些閾值覆蓋率（此處顯示為完全被聚集體覆蓋的表面）時(shí)，相對(duì)晶體表面上的蛋白質(zhì)聚集體之間的排斥抵消了由任何剩余的晶體 - 蛋白質(zhì) - 引起的有吸引力的相互作用水晶橋,。（經(jīng)參考文獻(xiàn)47許可轉(zhuǎn)載）

雖然我們最初使用 polyD 和 polyR [ 49 ]的近等摩爾混合物報(bào)告了 COM 聚集,，但隨后的實(shí)驗(yàn)描述了在更廣泛的混合比、聚離子組成和聚離子濃度范圍內(nèi)的相行為（圖 11）,。在接近等摩爾濃度的帶相反電荷的聚電解質(zhì)中,，在 polyR-polyD 混合物存在下 COM 晶體的相對(duì)粒徑 (R D ) 隨著聚合物濃度的增加而增加，在聚合物相界附近達(dá)到統(tǒng)計(jì)顯著性,，由陰影區(qū)域表示在圖 11A. 每種聚電解質(zhì)組分的數(shù)據(jù)分別顯示這些聚離子在不存在帶相反電荷的聚合物的情況下引起解聚（即 R D < 1.1）,。這種現(xiàn)象對(duì)于 polyD 更為明顯，在低 polyD 濃度下觀察到的 R D顯著降低,，隨著 polyD 濃度的增加（測(cè)試高達(dá) 12 μg/mL）達(dá)到 0.8（在 1.5 μg/mL 時(shí)）的極限值,。在含有 polyR 的溶液中，R D在低濃度時(shí)與對(duì)照無(wú)法區(qū)分,，并且在 polyR 濃度高于 2 μg/mL 時(shí)達(dá)到 0.9 的極限值,。

圖 11

在不同聚合物濃度和電荷比下，含有 polyR 和 polyD 的溶液中的 COM 聚集,。(A) 在 polyR (26 kDa) 和 polyD (36 kDa) 的二元和均聚物溶液中 COM 種子的相對(duì)直徑隨聚合物濃度的變化而變化,。混合聚合物的濃度是指 polyR 濃度,，其中添加 polyD 以保持 1:1 的單體比例,。(B) 左軸：COM 晶體與 polyR(+)/polyD(-) 混合物在組成為 0.25 mM CaO x的溶液中的相對(duì)直徑 (R D , Eq. 1 ):150 mM NaCl:10 mM HEPES，pH 7.5,。將不同數(shù)量的 polyR (15 – 270 nM) 添加到含有 49 nM polyD 的種子 COM 溶液中,。右軸：COM 聚電解質(zhì)顆粒的 zeta 電位,。實(shí)線是插值，R D = 1.1處的水平虛線是指在沒(méi)有聚電解質(zhì)的情況下獲得的對(duì)照測(cè)量值,。

COM 聚集的誘導(dǎo)顯然取決于導(dǎo)致相分離的帶相反電荷的聚合物的聚集,，因?yàn)閮煞N聚合物都不會(huì)單獨(dú)產(chǎn)生這種影響。THP 聚集體的實(shí)驗(yàn)表明,，COM 聚集的程度取決于蛋白質(zhì)聚集體表面積與 COM 表面積的比率,。由于 polyR-polyD 聚集體最初形成為非常小的顆粒（亞微米尺寸），逐漸聚結(jié)形成離散相,，因此聚合物聚集體與 COM 晶體表面積的比率隨反應(yīng)時(shí)間而變化,。因此，晶體聚集的程度受到這種聚結(jié)過(guò)程的時(shí)間性質(zhì)的影響,，這是一種尚未完全表征的動(dòng)力學(xué)成分,。定量復(fù)制這些結(jié)果將取決于精確匹配的混合條件，

R D隨 polyR 和 polyD 比例的變化如圖所示圖 11B. 用恒定的 polyD 濃度和不同量的 polyR 制備溶液,，以實(shí)現(xiàn)從 0.5（富含聚陰離子）到 3.0（富含聚陽(yáng)離子）的電荷比,。最大 COM 聚集體尺寸 (R D = 2.2) 出現(xiàn)在 COM 電荷中性附近 (polyR/polyD = 1.0)，盡管它略微轉(zhuǎn)移到富含聚陽(yáng)離子的條件下（即表面正電荷）,。這些觀察結(jié)果與其他帶相反電荷的聚電解質(zhì)的觀察結(jié)果類似,，例如 DNA-聚陽(yáng)離子聚電解質(zhì)間復(fù)合物 (IPEC)，它們?cè)诘饶柦M成下表現(xiàn)出更高的聚集體形成速率[ 94 ]. 令人驚訝的是,，這些混合物中 COM 晶體的 ζ 轉(zhuǎn)變遵循預(yù)期的從負(fù)電荷到正電荷的 S 形轉(zhuǎn)變,，在富含聚陰離子的條件下跨越 0 mV，因此 COM 聚集顯然不是由表面電荷穩(wěn)定性的喪失介導(dǎo)的,。在聚離子電荷比高于或低于最大值時(shí)，R D迅速下降到控制值（R D = 1.1）,，盡管我們注意到任何一種聚合物獨(dú)立作用都會(huì)導(dǎo)致 R D低于控制值,。因此，即使在聚陰離子或聚陽(yáng)離子過(guò)剩的情況下,，polyR-polyD 聚集體似乎也會(huì)誘導(dǎo)晶體聚集,。

使用其他方便獲得的聚陰離子和聚陽(yáng)離子探索了聚陰離子/聚陽(yáng)離子混合物對(duì) COM 表面電荷和聚集的影響。COM 晶體的 zeta 電位是在含有不同比例的聚陽(yáng)離子和聚陰離子對(duì)的溶液中測(cè)量的（圖 12）,。這些二元混合物都表現(xiàn)出相似的趨勢(shì),，其中 ζ 的范圍從富含聚陰離子的溶液中的約 -10 mV 到富含聚陽(yáng)離子的溶液中的 +10 mV。COM 電荷中和發(fā)生在 0.7 和 0.9 之間的聚電解質(zhì)電荷比,，這表明對(duì)于所有這些組合,，在富含聚陰離子的混合物中發(fā)生凈零電荷。使用這些聚陽(yáng)離子-聚陰離子混合物中的每一種在兩相區(qū)域內(nèi)的等摩爾條件下進(jìn)行 COM 聚集測(cè)定,。結(jié)果顯示在表 2揭示了聚陽(yáng)離子的選擇對(duì)COM聚集促進(jìn)的影響很小,，而聚陰離子的選擇有顯著的影響,。當(dāng) polyD 或 polyAA 與 polyK 或 polyR 結(jié)合時(shí)，觀察到促進(jìn) COM 聚集,，而所有含有 polyE 的混合物都會(huì)導(dǎo)致 COM 解聚（R D< 1.1),。在 CFM 研究中觀察到的 (100) 表面缺乏 polyE 相互作用可能與該結(jié)果相關(guān)。(100) 面通常是 COM 上最大的面,，晶體之間的橋接相互作用必須包括聚合物與每個(gè)晶體的結(jié)合,；似乎是由聚陰離子組分驅(qū)動(dòng)的過(guò)程。因此,，與 (100) 不牢固結(jié)合的 polyE 不能成為聚集所需的橋接相互作用的一部分,，即使 polyE 會(huì)與聚陽(yáng)離子形成聚合物聚集體。相反,，polyAA 和 polyD 在誘導(dǎo) COM 聚集方面同樣有效,，并且都表現(xiàn)出在 (100) 表面的強(qiáng)相互作用，以及阻礙向晶體中添加 CaOx 生長(zhǎng)單元（生長(zhǎng)抑制）,。

圖 12

COM 晶體在含有聚電解質(zhì)混合物的溶液中的 Zeta 電位,。聚陽(yáng)離子（polyR、polyK）和聚陰離子（polyAA,、polyD,、polyE）以不同的電荷比組合。在沒(méi)有聚電解質(zhì)（虛線,；對(duì)照）的情況下,，COM 表面的 zeta 電位為 -14 mV。COM-聚電解質(zhì)復(fù)合物的零電荷點(diǎn)出現(xiàn)在聚陽(yáng)離子與聚陰離子電解質(zhì)的電荷比低于 1 時(shí),，這表明聚陰離子的存在增強(qiáng)了聚陽(yáng)離子在 COM 晶體表面的吸附,。

表 2 COM 聚集在帶相反電荷的聚電解質(zhì)的 1:1 混合物中。

? 0.25 mM CaOx：150 mM NaCl：10 mM HEPES，pH 7

在這些混合聚電解質(zhì)的研究中,，富聚陽(yáng)離子溶液中 COM 晶體的正 ζ 值似乎高于單獨(dú)使用任一聚陽(yáng)離子觀察到的值,，這表明與聚陰離子的協(xié)同作用促進(jìn)了聚陽(yáng)離子與 COM 表面的締合。CFM 測(cè)量是在含有不同比例 polyD 和 polyR 的溶液中進(jìn)行的,，總聚電解質(zhì)濃度為 5 μg/mL (圖 13),，以更好地表征這種效果。CFM 測(cè)量中的解結(jié)合力是在含有 1:2,、1:1 和 2:1 質(zhì)量比的聚陽(yáng)離子和聚陰離子混合物的溶液中獲得的,，對(duì)應(yīng)于 33、50 和 67 wt% 的 polyR,。將結(jié)果與 polyD 和 polyR 的均聚物溶液（分別為 0 和 100 wt% polyR,；另見(jiàn)圖 8）,。隨著 polyD 含量的降低，羧酸改性的 AFM 尖端的解結(jié)合力單調(diào)增加,，這表明增加 polyR 分?jǐn)?shù)有效地降低了 polyD 的表面覆蓋率,。在 polyR/polyD 混合物存在的情況下，脒修飾的 AFM 尖端與 COM (100) 表面的結(jié)合似乎比在 polyD 單獨(dú)存在的情況下更弱,；然而,，在單獨(dú)存在 polyR 的情況下，解結(jié)合力與未修飾的 COM 表面沒(méi)有什么不同,。這種模式表明 polyD 促進(jìn)了 polyR 在晶體表面或晶體表面附近的結(jié)合,，可能是通過(guò) polyD 表面相互作用，這樣它就可以干擾脒修飾尖端的結(jié)合,。一旦 polyD 被去除（即 100% polyR 溶液），

圖 13

在含有各種 polyR 和 polyD 混合物的溶液中,，用脒鎓 (-C(NH 2 ) + ) 和羧酸 (-COO - ) 部分修飾的 AFM 尖端與COM (100) 表面之間的相對(duì)分離力。在每個(gè)實(shí)驗(yàn)中,，在總聚電解質(zhì)濃度為 5 μg/mL (polyR + polyD) 的 0.11 mM CaOx 溶液中進(jìn)行測(cè)量,。

類似系列混合物的本體溶液測(cè)量數(shù)據(jù)先前已發(fā)表[ 61 ]并表明在 COM 晶體聚集促進(jìn)方面,，富含 polyD 的混合物與對(duì)照（未添加聚電解質(zhì)）幾乎相同。然而,，這個(gè)結(jié)果仍然與觀察到解聚的 polyD 完全不同,。另一方面，該混合物和單獨(dú)的 polyD 之間的 COM 生長(zhǎng)速率抑制測(cè)量值相似,，表明存在的聚合物聚集體在晶體聚集過(guò)程中比在生長(zhǎng)中更強(qiáng)烈地參與。另一方面,，等摩爾（電荷中性）和富含 polyR 的混合物明顯阻止了與生長(zhǎng)相關(guān)的聚集，并將主要的生長(zhǎng)機(jī)制轉(zhuǎn)變?yōu)楹愣ńM成實(shí)驗(yàn)中的二次成核[ 61 ],，以及促進(jìn) COM 晶種在飽和 CaOx 溶液中的聚集[ 49 ],。與對(duì)照相比,，富含聚 R 的條件似乎也增加了晶體生長(zhǎng)速率，這可能類似于通過(guò)含有陰離子和陽(yáng)離子側(cè)鏈的選定天然蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)加速生長(zhǎng)的報(bào)道,。

4.0 結(jié)論

總之,，聚陰離子（例如,，polyD、polyAA 和 poly E）,、天然尿蛋白（例如,，THP 和 OPN）以及從正常尿液中分離的大分子混合物，與晶體表面緊密結(jié)合,，通常抑制 COM 成核,、生長(zhǎng)、和聚合,。非結(jié)合力的 CFM 測(cè)量表明,，聚陰離子可以阻止用脒（陽(yáng)離子）和羧酸（陰離子）末端基團(tuán)化學(xué)修飾的 AFM 尖端的粘附，這表明這些吸附的聚合物掩蓋了晶體表面,。界面和塊狀晶體分析揭示了聚電解質(zhì)-COM 相互作用的明顯差異,，這是由于聚陰離子化學(xué)結(jié)構(gòu)（polyD 與 polyE）的差異強(qiáng)烈影響了選定 COM 面的相互作用，但也表現(xiàn)為可觀察到的塊狀結(jié)晶差異,，特別是在聚合行為中,。相反，聚陽(yáng)離子被吸引到 COM 晶體表面,，可能是通過(guò)不足以導(dǎo)致強(qiáng)結(jié)合的靜電吸引力,，因此對(duì)本體結(jié)晶過(guò)程或 CFM 解結(jié)合力測(cè)量幾乎沒(méi)有影響。當(dāng)聚陽(yáng)離子與聚陰離子結(jié)合時(shí),，形成的聚陽(yáng)離子-聚陰離子聚集體可以與聚陰離子-晶體相互作用競(jìng)爭(zhēng),，在某些情況下會(huì)促進(jìn)晶體聚集，而在其他情況下會(huì)促進(jìn)成核和生長(zhǎng),。聚合物聚集體的效果在很大程度上取決于聚陰離子組分的結(jié)合特性,，例如由 polyD 與 polyE 形成的聚合物聚集體之間的 COM 聚集行為的差異。

為本研究選擇的模型聚電解質(zhì)包含模擬人腎結(jié)石有機(jī)基質(zhì)中尿液成分部分的官能團(tuán),，結(jié)晶測(cè)定中有限的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)已證明與天然蛋白質(zhì)相似的行為,。尿液大分子的混合物可能過(guò)于復(fù)雜，無(wú)法用單一模型聚電解質(zhì)來(lái)近似,；然而,，鑒于所有蛋白質(zhì)都含有相同的氨基酸，因此具有不同比例的相同離子側(cè)鏈,，這種混合物的復(fù)雜性與單個(gè)成分的主導(dǎo)作用相矛盾,。此處報(bào)告或討論的實(shí)驗(yàn)說(shuō)明了一系列行為，這些行為表明基于將混合物的平均特性視為關(guān)鍵參數(shù)的結(jié)石形成途徑,。尤其,，這些實(shí)驗(yàn)說(shuō)明了聚合物聚集體可能在 CaOx 晶體生長(zhǎng)抑制和促進(jìn)晶體聚集中發(fā)揮的重要作用，這似乎不依賴于獨(dú)特的蛋白質(zhì)確認(rèn)（二級(jí)或三級(jí)結(jié)構(gòu)）。顯然需要進(jìn)行更詳細(xì)的研究來(lái)開(kāi)發(fā)聚電解質(zhì)與 COM 表面結(jié)合的分子水平知識(shí),；然而,，蛋白質(zhì)聚集的特征,，可能同時(shí)涉及許多不同的蛋白質(zhì)，應(yīng)該在尿蛋白和結(jié)石基質(zhì)的研究中尋找,，并可能進(jìn)一步深入了解控制結(jié)石形成的關(guān)鍵過(guò)程,。這似乎不依賴于獨(dú)特的蛋白質(zhì)確認(rèn)（二級(jí)或三級(jí)結(jié)構(gòu)）,。顯然需要進(jìn)行更詳細(xì)的研究來(lái)開(kāi)發(fā)聚電解質(zhì)與 COM 表面結(jié)合的分子水平知識(shí)；然而,，蛋白質(zhì)聚集的特征，可能同時(shí)涉及許多不同的蛋白質(zhì),，應(yīng)該在尿蛋白和結(jié)石基質(zhì)的研究中尋找,，并可能進(jìn)一步深入了解控制結(jié)石形成的關(guān)鍵過(guò)程。這似乎不依賴于獨(dú)特的蛋白質(zhì)確認(rèn)（二級(jí)或三級(jí)結(jié)構(gòu)）,。顯然需要進(jìn)行更詳細(xì)的研究來(lái)開(kāi)發(fā)聚電解質(zhì)與 COM 表面結(jié)合的分子水平知識(shí)；然而,，蛋白質(zhì)聚集的特征,，可能同時(shí)涉及許多不同的蛋白質(zhì)，應(yīng)該在尿蛋白和結(jié)石基質(zhì)的研究中尋找,，并可能進(jìn)一步深入了解控制結(jié)石形成的關(guān)鍵過(guò)程。