1．液體菌種生產(chǎn)工藝流程

搖瓶空滅→搖瓶培養(yǎng)基的制作→滅菌→冷卻→接種→培養(yǎng)→搖床培養(yǎng)→發(fā)酵罐清洗→發(fā)酵罐空滅→發(fā)酵罐培養(yǎng)基的生產(chǎn)→滅菌→冷卻→接種→菌絲培養(yǎng)→接栽培袋→栽培袋培養(yǎng)

2．搖瓶液體菌種的制備

（1）搖瓶空滅

使用1000毫升,、耐126℃高溫的無色或近無色的玻璃抽濾瓶,，在壓力0.15兆帕，溫度121℃條件下滅菌30分鐘,。

（2）搖瓶培養(yǎng)基配方

配方1：去皮馬鈴薯300克,，葡萄糖20克，蛋白胨2克,，磷酸二氫鉀2克,，硫酸鎂1克，消泡劑5毫升,，水1000毫升,，pH自然。

配方2：去皮馬鈴薯200克,，葡萄糖20克,，磷酸二氫鉀3克，硫酸鎂1.5克,，蛋白胨2.5克,，VB11毫克，水1000毫升,，pH自然,。

（3）搖瓶培養(yǎng)基的制備

按培養(yǎng)基配方稱取原料，先將去皮馬鈴薯切成小塊,，加熱至沸騰維持20～30分鐘,，用紗布過濾定容后，將濾液放入鍋中，加入其他原材料小火加熱至溶解蒸煮至溶解,，待培養(yǎng)基冷卻后分裝放入搖瓶,，搖瓶液體種培養(yǎng)基裝量應(yīng)為容器體積的1/4，在搖瓶中放入一粒轉(zhuǎn)子,。將瓶口和膠皮管口用棉塞塞緊,，棉塞外要加蓋4層紗布，滅菌時(shí)紗布外加蓋牛皮紙防潮,。

（4）滅菌,、冷卻與接種

將搖瓶放入高壓滅菌鍋中，在壓力0.15兆帕,，溫度121℃條件下滅菌30分鐘,，滅菌完畢后,，應(yīng)自然降壓,，滅菌時(shí)應(yīng)防止棉塞被冷凝水打濕。待培養(yǎng)基冷卻后接種,，在接種箱或者超凈工作臺(tái)中接種,，接種前先用75%酒精或新潔爾滅溶液進(jìn)行表面擦拭消毒，然后開紫外燈滅菌30分鐘,，在液體培液表面接4塊黃豆大的母種菌種塊,，使菌絲面朝上，菌種塊必須漂浮在液體上,，接種結(jié)束后塞緊棉塞,。

（5）培養(yǎng)

將接種后的搖瓶先放入恒溫箱中在25℃下靜止培養(yǎng)2～3天，待接種塊在培養(yǎng)液上長(zhǎng)到1厘米時(shí)放入搖床培養(yǎng),，溫度26℃,，轉(zhuǎn)速以調(diào)至有一分錢硬幣大小的旋渦為基準(zhǔn)，搖30分鐘,，停10分鐘,，自動(dòng)控制，維持3～4天,。

判斷標(biāo)準(zhǔn)：搖瓶搖動(dòng)后菌絲掛壁,，培養(yǎng)液渾濁度達(dá)90%以上，如有臭味,，則表明有雜菌污染,，不可使用。

3．發(fā)酵罐液體菌種的制備

（1）發(fā)酵罐的清洗

發(fā)酵罐在每次使用后或再次使用之前必須對(duì)其進(jìn)行徹底的清洗才能投料使用,，洗罐主要是除去罐壁的菌球,、菌塊料液及其它污物，操作時(shí)用自來水管沖洗內(nèi)壁，對(duì)于內(nèi)壁粘附的污物可用木棒包上一些軟布擦拭即可,。

（2）發(fā)酵罐的空滅

需要進(jìn)行空滅主要有幾種情況：一是新發(fā)酵罐初次使用時(shí),；二是上一罐感染雜菌時(shí)；三是發(fā)酵罐長(zhǎng)時(shí)間不用時(shí),；四是更換品種時(shí),。以上四種情況都要進(jìn)行空滅，如果是連續(xù)生產(chǎn)或者上一批生產(chǎn)完只需將罐洗干凈就可以進(jìn)入下批生產(chǎn)不需要空滅,。

空滅時(shí)發(fā)酵罐內(nèi)層及夾層加水至視鏡中線,，啟動(dòng)加熱器加熱，首先排完夾層和內(nèi)層的冷空氣,，然后關(guān)閉所有的閥門升溫升壓,，溫度升至100℃，0.05兆帕壓力下,，打開接種口放氣閥,，排放罐內(nèi)冷空氣；在溫度達(dá)到121℃～125℃,，壓力在0.12～0.15兆帕?xí)r維持30～40分鐘,；壓力降至0.05兆帕?xí)r，打開接種閥,，使罐內(nèi)的水通過接種管及接種槍排出,，關(guān)閉接種閥門，將接種槍放在裝有75%酒精的塑料袋（瓶）內(nèi),，使其無菌,，以備接種使用。

（3）發(fā)酵罐培養(yǎng)基配方

700升發(fā)酵罐推薦配方為：豆粕粉10千克,，葡萄糖700克,，白砂糖7千克，硫酸鎂700克,，消泡劑50毫升,。

（4）發(fā)酵罐培養(yǎng)基的生產(chǎn)

按照發(fā)酵罐培養(yǎng)基配方稱取原料，培養(yǎng)基熬制同搖瓶培養(yǎng)基的方法,，熬好后放入發(fā)酵罐中,，再加入熱的消泡劑，打開氣泵攪拌,，加水至視鏡中線定溶,。

（5）滅菌、冷卻與接種

開啟加熱器對(duì)發(fā)酵罐夾層及內(nèi)層加熱,，當(dāng)溫度達(dá)到0.05兆帕?xí)r打開接種口放冷氣至接種口蒸汽變直時(shí)關(guān)閉接種口,，待培養(yǎng)液溫度升至95℃時(shí)，打開氣泵對(duì)發(fā)酵罐進(jìn)行攪拌5分鐘，氣泵停止通氣,，當(dāng)壓力達(dá)到0.12～0.15兆帕?xí)r,，溫度為121℃開始記時(shí)，滅菌40分鐘,。

培養(yǎng)基滅菌結(jié)束后迅速通水降溫,，降溫過程中發(fā)酵罐要適當(dāng)通氣，一方面攪拌降溫,；另一方面加壓,，使發(fā)酵罐維持正壓，盡快使發(fā)酵罐溫度降至30℃以下,。

將搖瓶接種管和發(fā)酵罐接種口用75%酒精消毒,，用95%酒精的火焰圈套在接口上，輕微打開呼吸器閥門,，使發(fā)酵罐壓力為0,，點(diǎn)燃火焰圈，將搖瓶接種管放在火焰上方,，用滅菌消毒過的鑷子去掉接種管上的牛皮紙和棉塞,，將膠管插入接種口,，打開接種口閥門,，將搖瓶菌種注入發(fā)酵罐中，關(guān)閉接種閥門,，然后拔出接種膠管,，去掉火焰圈，打開氣泵,。

（6）培養(yǎng)

通氣后調(diào)節(jié)呼吸器,，使內(nèi)罐壓力穩(wěn)定在0.01～0.03兆帕，當(dāng)培養(yǎng)72小時(shí)后即可看出小米粒狀的菌絲球,，呼吸器排出的培養(yǎng)料香味隨著培養(yǎng)周期的延長(zhǎng)越來越淡,，到培養(yǎng)后期取而代之的是一種淡淡的菌液的清香味，菌絲球濃度和菌液粘度逐漸增加,，玉木耳液體菌種培養(yǎng)周期為7～8天,，培養(yǎng)好的液體取樣后放置5分鐘基本不分層，且菌球大小均勻,，顆粒分明,，菌球周邊菌絲明顯。最好在發(fā)酵培養(yǎng)第四天對(duì)液體進(jìn)行取樣回接平板,，培養(yǎng)三天后觀察其狀態(tài),，挑出不能接菌的污染罐。

（7）接種

接種前應(yīng)認(rèn)真檢查選擇優(yōu)質(zhì)菌種：方法為發(fā)酵結(jié)束停進(jìn)氣后靜止觀察，菌球下沉,，上清液澄清透明,，表面無或有少量泡沫，菌球表面菌絲呈發(fā)散狀,，說明菌種正常,；若上清液渾濁，菌球表面光滑說明菌種不正常,。

液體菌種培養(yǎng)好以后,，將接種膠管和接種槍提前滅菌，接種房間也應(yīng)提前消毒,，若在離子風(fēng)機(jī)的保護(hù)下接種效果更佳,；接種時(shí)先放掉一部分菌種，盡量減少感染機(jī)會(huì),，用接種槍把料面用液體菌種封住,，一般每袋接種量25～30毫升即可。

4．栽培袋培養(yǎng)

將接好菌種的栽培袋放在發(fā)菌架上,，要求菌袋不能被劃破,，放在架子上時(shí)不能將菌袋刮到培養(yǎng)架橫梁上，防止出現(xiàn)微孔而污染,。具體擺放應(yīng)根據(jù)不同的培養(yǎng)條件而定,，可以立放，也可以臥放,，條件允許的話可以采用單層立放為最好,。培養(yǎng)25天左右，菌袋基本能夠長(zhǎng)滿菌絲,，長(zhǎng)滿袋后還需要后熟6～7天,。