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相比前兩代基因編輯工具ZFN系統(tǒng)和TALEN系統(tǒng),，CRISPR/Cas 9技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)比較顯著,。CRISPR-Cas9系統(tǒng)的可用位置更多。理論上基因組中每8個(gè)堿基就能找到一個(gè)可以用CRISPR-Cas9進(jìn)行編輯的位置,，可以說這一技術(shù)能對任一基因進(jìn)行操作，而TALEN和ZFN系統(tǒng)則在數(shù)百甚至上千個(gè)堿基中才能找到一個(gè)可用位點(diǎn),，這大大限制了使用范圍,。此外還可以將Cas9蛋白連接其他功能蛋白，來在特定DNA序列上研究這些蛋白對細(xì)胞的影響,。CRISPR-Cas9系統(tǒng)的使用極為方便,，只需要替換一段核酸序列，幾乎任何實(shí)驗(yàn)室都可以開展工作,。 gRNA是什么,？ 1 CRISPR/Cas9系統(tǒng)的工作原理是 crRNA（ CRISPR-derived RNA ）通過堿基配對與tracrRNA（trans-activating RNA）結(jié)合形成 tracrRNA/crRNA復(fù)合物，此復(fù)合物引導(dǎo)核酸酶Cas9蛋白在與crRNA 配對的序列靶位點(diǎn)剪切雙鏈DNA,。而通過人工設(shè)計(jì)crRNA和tracrRNA這兩種RNA,，可以改造形成具有引導(dǎo)作用的sgRNA（single guide RNA），從而引導(dǎo)Cas9對DNA定點(diǎn)切割,。 CRISPR系統(tǒng)包含兩個(gè)組件,，一個(gè)是sgRNA，另一個(gè)就是Cas 9蛋白,。sgRNA是一個(gè)短的合成RNA,，只有20bp大小，可以與Cas9蛋白結(jié)合,，所以在設(shè)計(jì)sgRNA之前,，應(yīng)在基因組上尋找PAM序列（PAM：Protospacer Adjacent Motif），PAM序列是有固定形式的,，來自于不同菌種屬的Cas,，它的PAM序列形式是不一樣的。目前主流是SpCas 9（Cas 9蛋白來源于S. pyogenes （化膿鏈球菌）II型CRISPR系統(tǒng)）,。所以,，我們的PAM序列為-NGG的形式，“N”可以是A,T,C,G中的任何一個(gè),。Cas 9相當(dāng)于是限制性核酸內(nèi)切酶,，使PAM序列前形成DSB（Double Strand Break）,。所以，sgRNA其實(shí)相當(dāng)于是向?qū)?，告訴Cas 9蛋白在哪進(jìn)行切割,。 為了提高CRISPR/Cas9 的特異性，使用Cas9切口酶和一對sgRNA,，兩個(gè)相近的切口造成DNA雙鏈斷裂,，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生非同源末端連接修復(fù)，造成目的基因的突變,。 利用CRISPR/Cas9進(jìn)行基因的編輯,，首先要構(gòu)建有效的sgRNA。一般地,，基因特異的sgRNA模板序列為位于PAM序列（Protospacer Adjacent Motif）前間區(qū)序列鄰近基序,。這是一種見于crRNA分子的短核苷酸基序，可以被Cas9蛋白特異性識別并切割的 20 個(gè)nt,。而 PAM 序列的特征為 NGG,。 sgRNA的設(shè)計(jì) 2 2.1 sgRNA的設(shè)計(jì)原則 （1）sgRNA的長度：S. pyogenes II型CRISPR系統(tǒng)（SpCas 9）一般為20nt。 （2）sgRNA序列的堿基組成：基因特異的sgRNA 模板序列為位于PAM序列前,，PAM序列的特征為NGG（N可以為任意核苷酸）,，所以選擇3'末端含有GG的sgRNA，這樣可以構(gòu)成PAM序列,。同時(shí),，sgRNA的序列應(yīng)避免以4個(gè)以上的T結(jié)尾，GC%含量最佳為30%-70%（40%-60%）,。 （3）sgRNA的序列與On-target和Off-target的匹配數(shù)都應(yīng)盡可能的高,，一般大于60，認(rèn)為是可用的,。 （4）如果構(gòu)建U6啟動子或T7啟動子驅(qū)動sgRNA的表達(dá)載體,，需要考慮sgRNA的5'堿基為G或GG，來提高其轉(zhuǎn)錄效率,。 （5）全基因的脫靶效應(yīng)分析,，需要考慮脫靶位點(diǎn)的錯(cuò)配堿基數(shù)，最多不超過5個(gè),。 （6）如果想要造成基因移碼突變,，需要盡量靠近基因編碼區(qū)的ATG下游，最好位于第一或第二外顯子上,。
2.2 sgRNA的設(shè)計(jì)步驟 sgRNA通常通過網(wǎng)站在線設(shè)計(jì),，下面介紹介個(gè)常用網(wǎng)站共大家選擇。 網(wǎng)站1：通過網(wǎng)址：https://www./landing/cloud進(jìn)行sgRNA的設(shè)計(jì),，進(jìn)入網(wǎng)址后點(diǎn)擊KNOCK OUT進(jìn)入設(shè)計(jì)頁面,，輸入想要設(shè)計(jì)sgRNA的名稱后,，進(jìn)行sgRNA的選擇。由于內(nèi)含子在基因表達(dá)的過程中,，不會進(jìn)行表達(dá)且會被刪掉,，所以我們在設(shè)計(jì)sgRNA時(shí)一般在靠近啟動子的第一個(gè)CDS區(qū)（也就是外顯子的保守結(jié)構(gòu)域）進(jìn)行sgRNA的選擇。在網(wǎng)站上,，On-Target和Off-target都是有評分的,，一般來說，評分越高,，則sgRNA越好,。On-Target其實(shí)就是sgRNA對目標(biāo)位點(diǎn)識別后與DNA模板進(jìn)行識別切割的的效率，所以準(zhǔn)確性越高,，On-Target的評分越高,。Off-Target也就是脫靶效應(yīng)，由于CRISPR技術(shù)的切割是由sgRNA根據(jù)PAM序列定位識別位點(diǎn),，從而進(jìn)行切割，但是如果sgRNA識別的位點(diǎn)是錯(cuò)誤的,，就產(chǎn)生了錯(cuò)誤切割,，這樣就產(chǎn)生了脫靶效應(yīng)。所以說,，在進(jìn)行sgRNA選擇的時(shí)候,，要盡可能地選擇脫靶效率比較低的，也就是Off-target分值比較高的,。另外,，符合sgRNA的其它設(shè)計(jì)原則就可以了。 網(wǎng)站2：打開網(wǎng)站 http://crispr.,，將基因名稱,，郵箱，第二外顯子序列輸入到對話框,，點(diǎn)擊 Agree and submit,，等待網(wǎng)站設(shè)計(jì)成對的 sgRNA 序列。一般推薦網(wǎng)站設(shè)計(jì),，因?yàn)榫W(wǎng)站可以預(yù)測脫靶位點(diǎn)數(shù),，避免基因脫靶產(chǎn)生。 網(wǎng)站3：http://crispr.dfci./SSC/ 這也是一個(gè)很常用且好用的網(wǎng)站~ END  |
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