不久前,，《細(xì)胞》雜志（Cell）在線發(fā)表了一篇關(guān)于新冠抗體研發(fā)的重要論文,。科學(xué)家們在大羊駝體內(nèi)找到了多種“納米抗體”,，可在體外實(shí)驗(yàn)中有效中和SARS,、MERS以及新冠病毒的假病毒（pseudoviruses）。這一研究再次引起了業(yè)內(nèi)對納米抗體技術(shù)的關(guān)注,。事實(shí)上,，納米抗體有著巨大的應(yīng)用潛力和前景。Fierce Biotech曾將Ablynx公司的納米抗體技術(shù)平臺,，評為未來十年生物技術(shù)制藥領(lǐng)域最為領(lǐng)先的十大技術(shù)平臺之首,。

什么是納米抗體？簡單來說,，它是一類僅含有天然存在的重鏈,、尺寸比普通抗體要小得多的抗體,。由于結(jié)構(gòu)獨(dú)特，納米抗體成為創(chuàng)造具有多種競爭優(yōu)勢新型生物藥物的理想材料,。實(shí)際上,，將納米抗體開發(fā)成藥的概念已在臨床上得到驗(yàn)證，2018年全球首個(gè)納米抗體Cablivi（caplacizumab）在歐盟獲批上市,。

1989年Raymond Hamers等人對單峰駱駝免疫系統(tǒng)進(jìn)行了開創(chuàng)性的研究,，標(biāo)志著重鏈治療性抗體的發(fā)現(xiàn).7只重鏈抗體和傳統(tǒng)抗體在輕鏈上有所不同，重鏈抗體沒有可變和恒定的輕鏈以及CH1域（下圖A）,。類似的重鏈抗體被發(fā)現(xiàn)在鯊魚等鯉魚中,，然而，這些重鏈抗體被稱為IgNAR抗體,，有5個(gè)恒定的（CH）域,，并且由于在免疫鯊魚方面的困難，工程和開發(fā)具有挑戰(zhàn)性,。傳統(tǒng)的抗體在重鏈和輕鏈上含有6個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)（CDR）,，而重鏈抗體只擁有3個(gè)CDR（下圖B）。盡管只有3個(gè)CDR,，但與傳統(tǒng)的6個(gè)CDR抗體相比,，這些僅重鏈抗體表現(xiàn)出相當(dāng)?shù)目乖Y(jié)合親和力和其他效應(yīng)器功能。

作為癌癥治療的納米抗體

癌癥免疫學(xué)的進(jìn)展為許多新的治療策略鋪平了道路,，包括抗體和納米抗體及其檢測腫瘤細(xì)胞和激活免疫系統(tǒng)效應(yīng)反應(yīng)的能力,。這些突破性的癌癥免疫治療方法包括檢查點(diǎn)抑制的識別和治療性失活、抗原呈遞細(xì)胞（APCs）的激活,、免疫抑制細(xì)胞的阻斷,、免疫抑制分子的中和、嵌合抗原受體T細(xì)胞（CAR T細(xì)胞）和CAR-自然殺傷（NK）細(xì)胞的開發(fā),、細(xì)胞因子調(diào)控等,。

納米抗體和T細(xì)胞在癌癥免疫治療中的應(yīng)用

目前，有三種類型的雙特異性抗體存在,，具有特定的好處,；雙特異性T細(xì)胞酶（BiTE）、雙親和重定向蛋白（DARTs）和串聯(lián)二抗體（TandAbs）.BiTE抗體的開發(fā)是為了將T細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞連接起來,，由兩個(gè)scFv片段組成,，一個(gè)針對T細(xì)胞的抗原/標(biāo)記物，如CD3,，另一個(gè)針對TAA,，再加上一個(gè)肽連接物。Blinatumomab是食品和藥物管理局(FDA)批準(zhǔn)的一種BiTE,，用于治療B細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血病(B-ALL),，對T細(xì)胞的CD3和B細(xì)胞的CD19(在ALL中過度表達(dá))具有特異性,，與甘氨酸-絲氨酸連接體相連。這種抗體表現(xiàn)出良好的療效,，但半衰期較短,，這是blinatumomab以及其他BiTEs的一個(gè)主要問題，需要高治療劑量才能達(dá)到所需的T細(xì)胞活化.DARTs已被開發(fā)為一種al-ternative,，以克服BiTEs的短半衰期并解決快速消除問題,。與BiTEs不同的是，DARTs具有Het-erodimerized Fv片段,，F(xiàn)v1片段上有靶點(diǎn)A的VL和靶點(diǎn)B的VH,，F(xiàn)v2片段上有靶點(diǎn)B的VL和靶點(diǎn)A的VH48（圖2B）。

與傳統(tǒng)的BiTEs相比,，穩(wěn)定性,、溶解性和性能顯著提高的雙特異性納米抗體也有望呈現(xiàn)出更高的療效。最近,，開發(fā)了一種針對T細(xì)胞CD3和乳腺癌細(xì)胞Her2的雙特異性抗體,。這種治療方法的獨(dú)特性是結(jié)合了對Her2特異性的單域(VHH)和對CD3特異性的scFv-fragment.這種構(gòu)建體能夠很容易地在大腸桿菌中表達(dá)并通過親和層析進(jìn)行純化。

cd T淋巴細(xì)胞

cd T淋巴細(xì)胞存在的數(shù)量不多,，但在抗腫瘤活動(dòng)中起著關(guān)鍵作用,。這種小的T細(xì)胞亞群在免疫反應(yīng)中具有許多獨(dú)特的特性，它們不需要主要組織相容性com- plex（MHC）就能被激活,；受應(yīng)激抗原刺激,。DNAM-1(DNAX附屬分子-1)、CD27等刺激,。

cd T淋巴細(xì)胞有一些子集--調(diào)節(jié)性的cdT和cdT17細(xì)胞促進(jìn)腫瘤生長,，而Vc9Vd2 T細(xì)胞抑制腫瘤生長，并且具有不同的activation分子和途徑,，這使得它們可以被靶向治療,，許多納米抗體已經(jīng)被開發(fā)出來,。

NK細(xì)胞

NK細(xì)胞是先天性淋巴細(xì)胞,，在抗病毒和抗腫瘤免疫反應(yīng)中具有舉足輕重的作用。它們不需要MHC的呈現(xiàn)來激活,，通過許多受體,，如CD94/NKG2A、KIR,、天然細(xì)胞毒性受體NKp46,、NKp30、NKp44,、IgG受體FccRIII和許多其他C型凝集素樣受體,，利用激活和抑制（殺傷和不殺傷）信號已經(jīng)開發(fā)了大量的納米體構(gòu)建物來靶向NK細(xì)胞的FccRIII（CD16）,。在駱駝中生成了兩個(gè)針對FccRIII胞外域的駱駝納米抗體（C21和C28），對FccRIIIb+聚嗎啡有顯著親和力,。

納米抗體-藥物共軛物

將納米抗體等靶向治療與化療/放療等非靶向治療相結(jié)合,，是對以往方法的一種進(jìn)步?？蒲腥藛T將一個(gè)VHH7域(針對MHC類-II)作為治療劑,，同時(shí)也是B細(xì)胞淋巴瘤的想象工具.當(dāng)VHH7域與含硫代梅坦辛衍生物默坦辛(DM1)共軛并作為治療劑使用時(shí)，在A20 B細(xì)胞淋巴瘤的小鼠模型中表現(xiàn)出極好的特異性,、內(nèi)化性和細(xì)胞毒性,，它導(dǎo)致腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的減少(圖2F)。同樣的VHH7域,，當(dāng)與近紅外（NIR）熒光團(tuán)結(jié)合時(shí),，在可視化局部和轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞方面表現(xiàn)出優(yōu)異的診斷性能同樣，作為新的靶向構(gòu)建體,，靶向放射性核素治療與納米抗體的結(jié)合正在獲得巨大的關(guān)注,。

納米體酶結(jié)合物是另一種納米體-酶結(jié)合物為基礎(chǔ)的方法，在消除腫瘤方面表現(xiàn)出了良好的活性,。2004年有科學(xué)家開發(fā)了一種納米體酶結(jié)合物,，cAb-CEA5:bL來靶向腫瘤相關(guān)的CEA114(圖2G)。該納米體與Enterobacter cloacae b-lactamase酶共軛,，該酶可特異性地激活抗腫瘤原藥7-(4 carboxybutanamido cephalosporin mustard),，使其成為活性藥物苯二胺芥。共軛使用llama c2c鉸鏈進(jìn)行,，以提供靈活性和穩(wěn)定性,，并顯示出從系統(tǒng)循環(huán)中快速清除和在腫瘤中的濃度，從而避免脫靶毒性,。

基于納米抗體的CAR T細(xì)胞治療

2018年首次推出基于納米抗體的CAR T細(xì)胞療法,，以VHH域針對MUC-1和CD28和OX40為共刺激分子，在腫瘤異種移植中觀察到該CAR T細(xì)胞對MUC-1+腫瘤細(xì)胞的殺傷作用,，并結(jié)合促炎細(xì)胞因子IL-17和IFN-的產(chǎn)生增加,。

這個(gè)NanoCAR系統(tǒng)被進(jìn)一步增強(qiáng)了一個(gè)自殺基因系統(tǒng)，以避免對健康細(xì)胞造成不必要的損害,，并控制不必要的復(fù)制,。在這個(gè)系統(tǒng)中，一個(gè)使用了同二聚體調(diào)控的caspase 8,，該caspase 8被合成配體AP20187激活,，以誘導(dǎo)apo-ptosis。

除了腫瘤微環(huán)境外，治療實(shí)體瘤的一個(gè)重大挑戰(zhàn)是腫瘤特異性靶點(diǎn)識別,。為了解決這個(gè)問題,，麻省理工學(xué)院和哈佛大學(xué)的研究人員開發(fā)了基于納米體的CAR T細(xì)胞，其靶向是一般的腫瘤微環(huán)境,，特別是存在于多種腫瘤類型上的PD-L1和EIIIB.這些納米CAR T細(xì)胞療法在許多腫瘤中表現(xiàn)出了很好的識別和結(jié)合活性,，當(dāng)激活時(shí)還能分泌IL-2和IL-12,，這增加了腫瘤的炎癥,。

基于雙特異性納米體的Car T細(xì)胞療法也已經(jīng)被開發(fā)出來,，因?yàn)橐揽繂我豢乖M(jìn)行腫瘤識別通常是不夠的，并導(dǎo)致抗原陰性腫瘤的治療失敗,。2018年科學(xué)家開發(fā)了兩種針對CD20和HER2的NanoCAR,；抗原結(jié)合域由兩個(gè)VHH串聯(lián)域組成，針對腫瘤細(xì)胞上兩種不同的抗原,，這種NanoCar方法通過克服腫瘤上抗原丟失的問題,，在消除腫瘤方面表現(xiàn)出了良好的潛力。此外,，還開發(fā)了一種基于納米體的抗EGFR+腫瘤的UniCAR,。與傳統(tǒng)CAR不同的是，這種UniCAR的活性可以通過重組靶向模塊表位進(jìn)行調(diào)控并靶向腫瘤特異性抗原,，從而消除了細(xì)胞因子綜合征和CAR T細(xì)胞過度外顯等不必要的風(fēng)險(xiǎn),。這種基于納米抗體的UniCAR顯示出可控的、實(shí)質(zhì)性的腫瘤細(xì)胞溶解和良好的生物分布,，并具有較長的半衰期,。一些在臨床前開發(fā)中的納米抗體列在下表中。

結(jié)論

納米抗體具有良好的動(dòng)態(tài)特性,、契約大小,、熱穩(wěn)定性、穿透能力（甚至可以穿過BBB）,、高溶解度和低免疫原性,，使其成為非常有前景的治療分子。易操作和低成本的生產(chǎn)進(jìn)一步增加了它們作為治療藥物的前景,。它們通過激活效應(yīng)細(xì)胞和抑制免疫抑制的幾種動(dòng)態(tài)策略,，被用于治療多種疾病，特別是癌癥,。缺少VL-VH域的雙特異性納米抗體表現(xiàn)出令人印象深刻的穩(wěn)定性,，聚合度極低,。許多裸露的拮抗性納米體構(gòu)建體通過阻斷離子通道,、生長因子受體，顯示出對腫瘤發(fā)生途徑的成功滅活,。它們的微小尺寸顯示了納米抗體和納米抗體-藥物共軛物的可重復(fù)標(biāo)記的組織滲透和生物分布,，這為對抗實(shí)體瘤打開了大門,，增強(qiáng)了療效。納米抗體在光熱治療和光動(dòng)力治療中的應(yīng)用具有良好的抗腫瘤反應(yīng),。合成生物學(xué)的進(jìn)展導(dǎo)致了益生菌的發(fā)展,，益生菌能夠在腫瘤微環(huán)境中合成治療性的抗腫瘤納米抗體，以避免與conven- tional檢查點(diǎn)抑制劑的毒性挑戰(zhàn),。以納米抗體為可變域的CAR T和CAR NK細(xì)胞,，開發(fā)出了具有優(yōu)異抗腫瘤活性和腫瘤特異性的雙特異性CAR T和CAR NK細(xì)胞。它們的潛力吸引了許多制藥公司的興趣,，目前納米抗體已成為許多藥物管線中的主要產(chǎn)品,。最近FDA批準(zhǔn)了CABLIVI納米體用于治療血栓性血小板減少性紫癜，進(jìn)一步高光了它們在市場上的出現(xiàn),，它們無疑將繼續(xù)革新治療方案,。