原文出處：Xian Lin, Aimin Li, Yonghao Li, Rongcheng Luo, Yujiao Zou, Yiyi Liu, Chen Liu, Yingying Xie, Shi Zuo, Zhan Liu, Zhen Liu and Wei-Yi Fang , Silencing MYH9 blocks HBx-induced GSK3β ubiquitination and degradation to inhibit tumor stemness in hepatocellular carcinoma.Signal Transduct Target Ther 2020 02 14;5(1),10.1038/s41392-020-0111-4

研究背景：

肝細胞癌(HCC)是最常見的癌癥之一,，也是癌癥相關(guān)死亡的第二大常見原因。腫瘤干細胞(Cancer stem cells, CSCs)被認為是決定癌癥復發(fā),、轉(zhuǎn)移和治療耐藥性的主要因素,，是改善癌癥預后的主要障礙。治療性耐藥對于肝癌新治療策略的發(fā)展至關(guān)重要,。

非肌球蛋白重鏈IIA (MYH9)參與許多生物學過程,，包括細胞遷移,、粘附,、分裂、極性和形態(tài)發(fā)生,。MYH9在許多癌癥中是一種異常的癌基因,，但在頭頸部鱗狀細胞癌患者中，其表達與良好的預后呈正相關(guān),。此外,，研究人員報道MYH9在胃癌中能夠促進細胞侵襲和轉(zhuǎn)移，在結(jié)直腸癌和胰腺癌中促進細胞生長和轉(zhuǎn)移,，在神經(jīng)母細胞瘤中誘導耐藥,。然而，MYH9在調(diào)節(jié)HCC干細胞中的作用尚未確定,。

在亞洲和撒哈拉以南非洲的大多數(shù)HCC高發(fā)地區(qū),，包括中國，慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染已被證明是一個主要的危險因素,。HBV X蛋白(HBX)在HBV誘導的HCC中起關(guān)鍵作用,，有報道稱HBX可以調(diào)節(jié)許多基因的表達，以及表觀遺傳分子和事件,，導致HCC中各種通路和過程的放松,。Wnt/β-catenin信號通路通常在CSCs中過度激活。HBX被認為是Wnt信號激活的關(guān)鍵元素,，可以增強β-catenin的穩(wěn)定性,，從而促進Wnt/β-catenin信號,。然而，HBX促進Wnt信號通路激活的機制尚未完全闡明,。

在這里,，作者描述了一個MYH9/GSK3β/β-catenin/c-Jun調(diào)控回路，該回路可以增強HCC細胞的干細胞特性,、遷移,、侵襲、生長和索拉非尼耐藥性,。有趣的是,，這種正調(diào)控通路是由HBX調(diào)節(jié)的，它通過TRAF6誘導的泛素化降解GSK3β蛋白,，并進一步促進β-catenin/c-Jun信號的激活,。在本文中，來自細胞系,、異種移植模型和臨床樣本的數(shù)據(jù)全面描述了以MYH9為靶點延緩HCC進展的機制,。因此，靶向MYH9可能是治療HCC的一種替代策略,。

研究結(jié)果：

結(jié)果一：MYH9能夠增強腫瘤的干細胞特性,、轉(zhuǎn)移、增殖和索拉非尼耐藥性

作者檢測了MYH9在HCC細胞中的表達,，并將一個質(zhì)?；騭iRNA引入MYH9到HCC細胞中，結(jié)果顯示,，與相應的對照細胞相比,，MYH9在經(jīng)過MYH9質(zhì)粒或siRNA處理的HCC細胞中的水平發(fā)生了超過兩倍的變化,。沉默MYH9可抑制HCC干細胞,、轉(zhuǎn)移、增殖和索拉非尼耐藥,。然而,，在HCC細胞中，MYH9的上調(diào)發(fā)揮了相反的作用(圖1b-g),。

隨后作者建立了小鼠模型,，研究MYH9的體內(nèi)致瘤作用。QPCR證實,，與對照腫瘤相比,，MYH9沉默的HCC細胞來源的腫瘤中MYH9的表達減少(圖2a)。隨后,，在作者建立的皮下移植小鼠模型中發(fā)現(xiàn),，與對照組肝癌細胞相比,，注射沉默MYH9的肝癌細胞的小鼠成瘤能力下降(圖2b)。在構(gòu)建的原位肝癌模型中,，與對照細胞相比,，沉默MYH9的Huh7和HCCLM3細胞在裸鼠中顯示出腫瘤生長速度、肝內(nèi)轉(zhuǎn)移和肝外播散速度減慢(圖2c),。與相應對照組的轉(zhuǎn)移灶相比,，接種MYH9沉默的Huh7和HCCLM3細胞的動物的轉(zhuǎn)移灶較少。這些結(jié)果通過熒光和肺轉(zhuǎn)移模型的組織病理學改變得到驗證(圖2d),。與對照組相比,，皮下移植小鼠模型結(jié)果顯示，注射MYH9沉默細胞的動物腫瘤負荷降低,，Ki67和PCNA表達水平降低(圖2e),。此外，作者還觀察到,，與對照組相比,，索拉非尼治療組和MYH9沉默組的HCC小鼠的生存時間延長，聯(lián)合索拉非尼治療和MYH9抑制能夠延遲HCC進展(圖2f),。

圖1

圖2

結(jié)果二：MYH9能夠與GSK3β相互作用,，促進腫瘤干細胞特性、轉(zhuǎn)移,、增殖和索拉非尼耐藥性

為了進一步探討MYH9在HCC中的作用機制,，作者著重研究了與MYH9相互作用的蛋白,。在本研究中,，作者基于DOMINE數(shù)據(jù)集預測MYH9的肌凝蛋白頭部運動結(jié)構(gòu)域、肌凝蛋白N端sh3樣結(jié)構(gòu)域,、RGS結(jié)構(gòu)域和GSK3β的蛋白激酶結(jié)構(gòu)域之間的相互作用,。此外，在MYH9 co-IP復合物中,，作者檢測到了β-catenin破壞復合物的主要成分,，包括GSK3β、APC,、AXIN1和β-catenin,。于是作者還通過免疫熒光檢測了MYH9和β-catenin破壞復合物的共定位(圖3b)。然而,，MYH9敲除對GSK3β mRNA水平?jīng)]有影響(圖3c),。此外,免疫熒光顯示MYH9降低了GSK3β的胞質(zhì)富集，而MYH9對GSK3β,、APC和AXIN1的亞細胞定位無影響(圖3d, e),。提示MYH9在轉(zhuǎn)錄后水平下調(diào)了GSK3β蛋白的表達,。

接下來，作者證實MYH9下調(diào)了GSK3β蛋白水平(補充圖1a),。除了被磷酸化,，GSK3β也可以被泛素化和降解。作者發(fā)現(xiàn)MYH9縮短了GSK3β蛋白的半衰期(補充圖1b),。MYH9敲除抑制了GSK3β泛素化(補充圖1c),。此外，GSK3β基因的敲低消除了MYH9缺失對HCC干細胞,、遷移,、侵襲、增殖和索拉非尼耐藥的抑制作用(補充圖1d-g),。為了驗證GSK3β的抑瘤功能,，作者進行了TOP/FOP熒光素酶報告基因檢測，發(fā)現(xiàn)沉默GSK3β可以拮抗MYH9下調(diào)對Wnt信號通路的抑制作用(補充圖1h),。western blotting結(jié)果顯示,，下調(diào)MYH9可誘導E-cadherin和GSK3β的表達水平，抑制Vimentin,、N-cadherin和Wnt信號轉(zhuǎn)導靶點β-catenin,、c-Jun、c-Myc,、CD44,、Nanog、Oct4,、Sox2,、Slug、CCND1,、ABCB1和ABCG2的表達水平,。在MYH9沉默的HCC細胞中，敲除GSK3β可以恢復MYH9敲除調(diào)控的表達特征的變化(補充圖1i),。這些數(shù)據(jù)表明,，MYH9通過促進GSK3β泛素化和降解，增強了HCC進展和Wnt信號轉(zhuǎn)導,。

圖3

補充圖1

結(jié)果三：HBX與MYH9相互作用,，促進泛素介導的GSK3β降解

以往的研究表明HBX與APC相互作用激活Wnt信號。于是作者進行了co-IP定量蛋白質(zhì)組學研究,，發(fā)現(xiàn)MYH9是一種新型的HBX相關(guān)蛋白(圖4a-c和補充表1),。

隨后作者確定MYH9的表達是由HBX通過β-catenin信號通路在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控的(圖4d)?；贑istrome Data Browser結(jié)合生物信息學工具,，在MYH9轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列中發(fā)現(xiàn)了3個c- jun結(jié)合位點(圖4e, f),。轉(zhuǎn)錄因子c-Jun和MYH9轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列之間的相互作用通過染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP)、電泳遷移率測定(EMSA)和熒光素酶報告基因測定(圖4g-i)進行了驗證,。此外,，ChIP數(shù)據(jù)顯示HBX在HCC細胞中通過c- jun依賴的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)MYH9的表達(圖4j)。

為了研究HBX對myh9誘導的GSK3β蛋白下調(diào)的影響,，作者采用了環(huán)己酰亞胺追逐法,。發(fā)現(xiàn)MYH9加速了GSK3β的降解，并促進了β-catenin的穩(wěn)定,，但對β-catenin破壞復合物的其他成分沒有影響(圖5a),。此外，HBX通過MYH9介導的GSK3β降解影響GSK3β的穩(wěn)定性;然而,，HBX對MYH9的穩(wěn)定性沒有影響(圖5b),。Co-IP表明HBX的上調(diào)促進了GSK3β的降解，MYH9的耗盡改善了HBX對GSK3β泛素化和降解的影響,。Co-IP進一步暗示MYH9或HBX的消耗觸發(fā)了泛素和GSK3β的解離,，加速了由TRAF6和GSK3β組成的泛素連接酶復合物的解離，并促進了GSK3β對β-catenin的捕獲,。然而,，MYH9或HBX的上調(diào)產(chǎn)生了相反的結(jié)果(圖5c)。GSK3β的K183被認為是泛素化位點,，外源性co-IP進一步提示GSK3β K183R的突變促進泛素和GSK3β的分解,，阻礙TRAF6和GSK3β的相互作用(圖5d)。此外,，泛素上調(diào)也會損害HCCLM3細胞中GSK3β的表達(圖5e),。

圖4

圖5

補充表1

結(jié)果四：MYH9誘導泛素的表達

有趣的是，基于Cistrome Data Browser結(jié)合生物信息學軟件分析發(fā)現(xiàn)泛素可能受到轉(zhuǎn)錄因子c-Jun的轉(zhuǎn)錄調(diào)控(補充圖 2a),。此外,，c-Jun介導了MYH9對泛素表達的刺激作用(補充圖2b),。通過ChIP,、EMSA和熒光素酶報告基因檢測轉(zhuǎn)錄因子c-Jun和泛素轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列之間的相互作用(補充圖2c-e)。此外,，作者還驗證了MYH9可以調(diào)控肝癌細胞中依賴c- jun的泛素轉(zhuǎn)錄(補充圖2f),。

補充圖2

結(jié)果五：HBX通過MYH9介導Wnt/β-catenin/c-Jun信號通路刺激腫瘤干細胞特性、轉(zhuǎn)移,、增殖和索拉非尼耐藥

為了進一步研究MYH9和HBX在Wnt信號轉(zhuǎn)導中的作用,，作者通過TOP/FOP熒光素酶報告基因檢測了同路活性，發(fā)現(xiàn)MYH9敲低可改善HBX對Wnt信號轉(zhuǎn)導的促進作用(補充圖3a),。此外,，MYH9通過激活Wnt信號和調(diào)節(jié)HBX對HCC細胞干細胞,、遷移、侵襲,、生長和索拉非尼耐藥的致瘤作用發(fā)揮其致瘤特性(補充圖3b-i和補充圖4),。MYH9控制HBX對MYH9和泛素蛋白水平的刺激作用以及HBX對GSK3β總蛋白水平的抑制作用(補充圖3j)。

隨后作者進一步確定HBX和MYH9對β-catenin核易位的影響,。免疫熒光和細胞分離實驗表明MYH9調(diào)節(jié)HBX對β-catenin核易位的促進作用;然而,，HBX對MYH9的亞細胞定位沒有影響(圖3k, l)。此外,，在Huh7和HCCLM3細胞中,，MYH9可以調(diào)節(jié)HBX對MYH9和泛素c- jun依賴性轉(zhuǎn)錄的增強作用(補充圖3m)。這些結(jié)果表明,，MYH9在HCC中HBX介導的Wnt和c-Jun信號的激活中是必不可少的,。

為了確保GSK3β和HBX在Wnt信號中的功能，作者進行了TOP/FOP熒光素酶報告基因檢測,，發(fā)現(xiàn)沉默GSK3β可以拮抗HBX下調(diào)對Wnt信號的抑制作用(補充圖5a),。然而，HBX對GSK3β mRNA水平?jīng)]有影響(補充圖5b),。此外,，GSK3β基因的下調(diào)消除了HBX缺失對HCC干細胞、遷移,、侵襲,、生長和索拉非尼耐藥的抑制作用(補充圖5c-f)。Western blotting結(jié)果顯示,，HBX敲低可誘導E- cadherin和GSK3β的表達水平,，抑制Vimentin、N-cadherin和Wnt信號靶點β-catenin,、c-Jun,、c-Myc、CD44,、Nanog,、Oct4、Sox2,、Slug,、CCND1、ABCB1和ABCG2的表達水平,。此外,，HBX沉默的HCC細胞中GSK3β的下調(diào)恢復了HBX下調(diào)所影響的表達模式(補充圖5g)。這些數(shù)據(jù)表明，HBX通過促進GSK3β泛素化和降解增強Wnt信號,?？偟膩碚f，HBX通過促進MYH9介導的GSK3β泛素化來增強Wnt信號,，并促進HCC進展,。

補充圖3

補充圖4

補充圖5

結(jié)果六：MYH9、GSK3β和β-catenin水平與HCC臨床病理特征的相關(guān)性

基于TCGA數(shù)據(jù)庫和生物信息學分析,，與癌旁組織(N)相比,，MYH9、β-catenin和泛素在HCC組織(T)中的表達水平上調(diào)(補充圖6a),。然而,，與HBV陰性的HCC樣本相比，HBV陽性的HCC樣本MYH9表達水平上調(diào)(補充圖6b),。此外,，通過基因組富集分析(GSEA)顯示MYH9參與Wnt/β-catenin信號通路、細胞周期進展和局灶性粘連的調(diào)節(jié)(補充圖6c),。此外,，MYH9表達與Sox2、Oct4,、Epcam,、CD44、CD133,、β-catenin,、N-ca、Vimentin,、Slug,、CCND1、ABCB1和泛素表達呈正相關(guān),，而c-Jun表達與MYH9和泛素表達呈正相關(guān)(補充圖6d),。根據(jù)MYH9表達的最佳截斷值，將HCC患者分為兩組,，基于TCGA數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn),，MYH9表達水平與患者不良預后呈正相關(guān)(附錄圖6e)。

然后對93個HCC組織和87個癌旁非癌組織進行免疫組化(IHC),。結(jié)果與之前的研究結(jié)果一致,，與癌旁組織相比，MYH9和β-catenin表達水平升高(P < 0.001和P = 0.007),，而GSK3β在HCC組織中的表達水平降低(P < 0.001)(圖6a)。此外，MYH9表達水平與GSK3β表達水平呈負相關(guān),，與HBX表達水平呈正相關(guān)(P = 0.012, Kappa = 0.254)和β-catenin核易位(P = 0.003, Kappa = 0.309)(圖6b和補充表2,3),。

此外，生存分析表明,，MYH9表達水平與患者不良預后呈正相關(guān)(高MYH9組的中位生存期為19個月,，而低MYH9組的中位生存期為49個月)(log-rank檢驗，P = 0.0292)(圖6c),。單因素和多因素分析表明,，MYH9表達是HCC患者總生存的獨立指標(圖6d)。

圖6

補充表2

補充表3

研究結(jié)論：

1.MYH9是一個有效的腫瘤干細胞啟動子,，能夠促進肝細胞癌的發(fā)病,。

2.靶向MYH9顯著提高了肝細胞癌小鼠的存活率，并促進了體內(nèi)肝細胞癌細胞對索拉非尼的敏感性,。

3.MYH9能夠與GSK3β相互作用,，通過泛素介導的降解降低GSK3β蛋白的表達，從而使β-catenin破壞復合物失調(diào),，誘導肝癌中下游的腫瘤干細胞表型,、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化和c-Jun信號轉(zhuǎn)導。C-Jun在轉(zhuǎn)錄過程中刺激MYH9的表達,，形成MYH9/GSK3β/β-catenin/ C-Jun反饋回路,。

4.HBV X蛋白(HBX)能夠與MYH9相互作用，并通過調(diào)節(jié)GSK3β/β-catenin/c-Jun信號通路誘導MYH9的表達,。以MYH9為靶點,，阻斷hbx誘導的GSK3β泛素化，激活β-catenin破壞復合物,，抑制腫瘤干性和EMT,。

5.在HCC患者中，抑制MYH9可以作為一種有效消除CSC特性的替代方法,，以抑制腫瘤遷移,、侵襲、生長和索拉非尼耐藥,。這表明MYH9在HCC中是一個重要的治療靶點,。

校對：郝士銘