為探討 人外周血單核細(xì)胞、人多能干細(xì)胞(hPSC),、人臍血CD34＋造血干細(xì)胞和人白血病細(xì)胞系THP-1 這四種來(lái)源巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)方案的區(qū)別,，我們通過(guò)監(jiān)測(cè)不同誘導(dǎo)條件下巨噬細(xì)胞表型分子及其功能形態(tài)，確定這四種來(lái)源巨噬細(xì)胞的功能,。

實(shí)驗(yàn)方法：選擇上述四種來(lái)源巨噬細(xì)胞作為研究對(duì)象,，對(duì)其研究?jī)?nèi)容主要包括：①形態(tài)觀察；②采用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)其表型分子進(jìn)行檢測(cè),。

實(shí)驗(yàn)一：人外周血單核細(xì)胞誘導(dǎo)成巨噬細(xì)胞實(shí)驗(yàn)方案

1,、實(shí)驗(yàn)Protocol

注釋：免疫磁珠純化CD14 單核細(xì)胞體外誘導(dǎo)成巨噬細(xì)胞

2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果展示

（1）磁珠分選純度流式鑒定結(jié)果圖

磁珠分選前PBMC中單核細(xì)胞占比10%,，分選后CD14陽(yáng)性率為85.8%,，代表磁珠分選技術(shù)可以獲得高純度的CD14單核細(xì)胞,，如下是結(jié)果圖：

注釋：黑色為同型對(duì)照，紅色的峰代表樣本管

（A：分選前PBMC樣本 B：分選后陰性成分 C：分選后陽(yáng)性成分）

（2）巨噬細(xì)胞形態(tài)特征結(jié)果圖

細(xì)胞培養(yǎng)24h之后,，大部分開(kāi)始貼壁,，細(xì)胞體積仍然比較小，少部分開(kāi)始伸出偽足,；培養(yǎng)到第3天,，細(xì)胞體積增大，偽足開(kāi)始變得明顯,；培養(yǎng)到第6天,，偽足沒(méi)有進(jìn)一步增加或者伸展，細(xì)胞貼壁牢固,，體積開(kāi)始進(jìn)一步增大,，較大的細(xì)胞直徑可達(dá)40-50微米，形狀從不規(guī)則逐漸變成橢圓形,，大部分細(xì)胞呈煎蛋狀,，小部分細(xì)胞呈梭型，培養(yǎng)液中的懸浮細(xì)胞與第三天相比沒(méi)有什么區(qū)別,。

注釋：從左到右依次是培養(yǎng)d1,、d3、d6結(jié)果圖

（3）巨噬細(xì)胞吞噬功能檢測(cè)結(jié)果圖

a：巨噬細(xì)胞培養(yǎng)到第7天,，進(jìn)行吞噬功能檢測(cè),，流式細(xì)胞儀顯示，巨噬細(xì)胞陽(yáng)性率為46%,，在數(shù)量上稍微減少,，根據(jù)細(xì)胞的狀態(tài)和貼壁生長(zhǎng)方式可以判斷基本上是巨噬細(xì)胞；

b：靶細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞共培養(yǎng)兩個(gè)小時(shí)后,，進(jìn)行流式檢測(cè),，見(jiàn)下圖，82%的巨噬細(xì)胞（包含CD14 和CD14-）吞噬了淋巴瘤細(xì)胞,，代表巨噬細(xì)胞有很強(qiáng)的吞噬能力,。 

3、實(shí)驗(yàn)結(jié)論

單核來(lái)源的巨噬細(xì)胞,，通過(guò)應(yīng)用免疫磁珠法分離CD14細(xì)胞,，經(jīng)過(guò)體外的誘導(dǎo)分化培養(yǎng)成巨噬細(xì)胞，可以建立高純度的人外周血來(lái)源的巨噬細(xì)胞培養(yǎng)體系,，為免疫細(xì)胞的后續(xù)研究提供基礎(chǔ),。

實(shí)驗(yàn)二：人多能干細(xì)胞(hPSC)誘導(dǎo)成巨噬細(xì)胞實(shí)驗(yàn)方案

1、實(shí)驗(yàn)Protocol

注釋：hPSC與AGM-S3基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)及定向分化巨噬細(xì)胞

2,、實(shí)驗(yàn)結(jié)果展示

（1）細(xì)胞形態(tài)結(jié)果圖

收集與AGM-S3基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)3 d(共培養(yǎng)早期)與14 d的hPSC,，分別以細(xì)胞密度為5×105 /mL重懸于巨噬細(xì)胞定向分化培養(yǎng)液(IMDM中包含10% FBS,、20 ng/mL SCF、20 ng/mL IL-6,、10 ng/mL IL-3,、5 ng/mL FLT3L、5 ng/mL TPO,、50 ng/mL M-CSF)中,，懸浮培養(yǎng)7 d。隨后,，更換培養(yǎng)基為IMDM(包含10% FBS,、50 ng/mL M-CSF)，繼續(xù)懸浮培養(yǎng)7 d,，收集懸浮細(xì)胞備用,。在倒置相差顯微鏡下觀察hPSC與AGM-S3基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)及定向分化過(guò)程中細(xì)胞形態(tài)變化。結(jié)果圖如下：

注釋：hPSC與AGM-S3基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)過(guò)程中細(xì)胞形態(tài)圖

(圖1A：AGM-S3基質(zhì)細(xì)胞形態(tài),。圖1B：hPSC形態(tài),。圖1C：采用維持培養(yǎng)基，hPSC與AGM-S3基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)至d3時(shí),，hPSC克隆逐漸增大,。圖1D：更換為造血分化培養(yǎng)液后，hPSC與AGM-S3基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)至d3時(shí),，hPSC克隆邊緣鋪出面積增大,。圖1E：更換為造血分化培養(yǎng)液后，hPSC與AGM-S3基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)至d6時(shí),，hPSC克隆邊緣鋪出部分出現(xiàn)血管樣結(jié)構(gòu),。圖1F：更換為造血分化培養(yǎng)液后，hPSC與AGM-S3基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)至d12時(shí),，hPSC克隆邊緣血管樣結(jié)構(gòu)溝壑中出現(xiàn)鵝卵石樣細(xì)胞,。圖1G：更換為造血分化培養(yǎng)液后，hPSC與AGM-S3基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)至d14時(shí),，hPSC克隆邊緣出現(xiàn)大量鵝卵石樣細(xì)胞,。圖1H：高倍鏡下鵝卵石樣細(xì)胞形態(tài))。

（2）流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果

通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)更換為造血分化培養(yǎng)液后,，hPSC與AGM-S3基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)d10(圖2A)、d12(圖2B),、d14(圖2C),、d16(圖2D)總細(xì)胞表面分子變化結(jié)果顯示，共培養(yǎng)d10,、d12,、d16,、d14時(shí)，CD34＋ CD45＋造血干,、祖細(xì)胞比例分別為1.1%,、8.6%、19.5%及36.8%

注釋：hPSC與AGM-S3基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)后流式細(xì)胞儀檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)三：人臍血CD34＋細(xì)胞誘導(dǎo)成巨噬細(xì)胞實(shí)驗(yàn)方案

1,、實(shí)驗(yàn)Protocol

注釋：免疫磁珠純化CD34 造血干細(xì)胞體外誘導(dǎo)成巨噬細(xì)胞,；

2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果展示

（1）磁珠分選純度流式鑒定結(jié)果圖

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示,，人臍血單個(gè)核細(xì)胞經(jīng)CD34＋磁珠分選試劑盒分選前,，CD34＋造血干/祖細(xì)胞約占人臍血單個(gè)核細(xì)胞的4.0%；分選后,，CD34＋細(xì)胞比例達(dá)87.9%,；

注釋：人臍血單個(gè)核細(xì)胞經(jīng)CD34＋磁珠分選前、后結(jié)果圖

(圖4A：分選前檢測(cè)結(jié)果,；圖4B：分選后檢測(cè)結(jié)果)

（2）巨噬細(xì)胞形態(tài)結(jié)果圖

分選后CD34＋造血干/祖細(xì)胞經(jīng)14 d二步法定向分化后,，總細(xì)胞呈懸浮培養(yǎng)狀態(tài)(圖5A)；總細(xì)胞經(jīng)MGG復(fù)合染色后,，普通光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)結(jié)果顯示,，巨噬細(xì)胞占總細(xì)胞的百分率約為50.0%(圖5B)，經(jīng)貼壁,、純化后,，巨噬細(xì)胞占總細(xì)胞的百分率達(dá)91.0%(圖5C)。由此成功獲得人臍血CD34＋造血干/祖細(xì)胞來(lái)源巨噬細(xì)胞,。

注釋：人臍血CD34＋造血干/祖細(xì)胞來(lái)源巨噬細(xì)胞形態(tài)

(圖5A：倒置相差顯微鏡下懸浮培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞形態(tài),；圖5B：普通光學(xué)顯微鏡下懸浮細(xì)胞MGG復(fù)合染色結(jié)果；圖5C：普通光學(xué)顯微鏡下貼壁,、純化細(xì)胞MGG復(fù)合染色結(jié)果)

實(shí)驗(yàn)四：人白血病細(xì)胞系THP-1 誘導(dǎo)成巨噬細(xì)胞實(shí)驗(yàn)方案

1,、實(shí)驗(yàn)Protocol

注釋：THP-1 細(xì)胞系誘導(dǎo)分化成巨噬細(xì)胞

2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果展示

（1）細(xì)胞形態(tài)及染色結(jié)果

THP-1細(xì)胞經(jīng)佛波酯誘導(dǎo)處理后,，從懸浮狀態(tài)(圖6A)變?yōu)橘N壁狀態(tài)(圖6B),，此時(shí)獲得的THP-1來(lái)源巨噬細(xì)胞處于M0型巨噬細(xì)胞，其具有單核巨噬細(xì)胞特性,。普通光學(xué)顯微鏡下觀察上述貼壁細(xì)胞的MGG復(fù)合染色結(jié)果顯示(圖6C),，細(xì)胞均為單核細(xì)胞，相比hPSC與AGM-S3基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)來(lái)源與人臍血CD34＋造血干/祖細(xì)胞來(lái)源巨噬細(xì)胞,，具有較大的細(xì)胞核,，并且細(xì)胞核位于細(xì)胞中央，形態(tài)幼稚。

注釋：(圖6A：倒置相差顯微鏡下THP-1細(xì)胞形態(tài),；圖6B：佛波酯刺激后,，倒置相差顯微鏡下單核巨噬細(xì)胞形態(tài)；圖6C：普通光學(xué)顯微鏡下單核巨噬細(xì)胞MGG復(fù)合染色結(jié)果)

（2）流式鑒定結(jié)果：分別對(duì)實(shí)驗(yàn)二/三/四樣本進(jìn)行流式鑒定

a：收集hPSC與AGM-S3基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)來(lái)源巨噬細(xì)胞,、人臍血CD34＋造血干/祖細(xì)胞來(lái)源巨噬細(xì)胞,，由于巨噬細(xì)胞比其他髓系細(xì)胞更容易貼壁，通過(guò)貼壁培養(yǎng),、純化巨噬細(xì)胞,。將純化后2種來(lái)源巨噬細(xì)胞與THP-1分化后巨噬細(xì)胞收集，采用兔血清封閉,，孵育流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)抗體,，包括CD45-PE抗體、HLA-Ⅱ-FITC抗體,、CD36-FITC抗體,、CD11b-APC抗體、CD14-PE抗體,、CD64-APC抗體,、CD11c-APC抗體、CD68-PE抗體,、CD86-APC抗體,、CD206-APC抗體。通過(guò)FACScanton Ⅱ流式檢測(cè)儀檢測(cè)3種來(lái)源巨噬細(xì)胞表型分子表達(dá)情況,，采用Flowjo10軟件分析數(shù)據(jù),。

結(jié)果證明：均表達(dá)髓系細(xì)胞相關(guān)表型分子CD45、HLA-Ⅱ,、CD36與CD11b(圖7A),。另外，THP-1來(lái)源巨噬細(xì)胞還表達(dá)巨噬細(xì)胞相關(guān)分子CD64與CD11c,，而hPSC與AGM-S3基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)來(lái)源巨噬細(xì)胞與人臍血CD34＋造血干/祖細(xì)胞來(lái)源巨噬細(xì)胞,，均高表達(dá)巨噬細(xì)胞相關(guān)表型分子CD14、CD64,、CD11c,、CD68、CD86,、CD206(圖7B),。

b：3種來(lái)源巨噬細(xì)胞表型分子CD14、CD64,、CD68的流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示,，THP-1來(lái)源巨噬細(xì)胞缺失部分巨噬細(xì)胞相關(guān)表型分子表達(dá),，不能完全模擬體內(nèi)巨噬細(xì)胞表型分子表達(dá)情況。

注釋：不同來(lái)源巨噬細(xì)胞表型分子CD14,、CD64、CD86通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果(圖8A～C：hPSC　與AGM-S3共培養(yǎng)來(lái)源巨噬細(xì)胞表型分子CD14,、CD64,、CD86表達(dá)情況；圖8D～F：人臍血CD34＋細(xì)胞來(lái)源巨噬細(xì)胞表型分子CD14,、CD64,、CD86直方圖表達(dá)情況；圖8H～I(xiàn)：THP-1　細(xì)胞來(lái)源巨噬細(xì)胞表型分子CD14,、CD64,、CD86表達(dá)情況)。

綜上,，四種方法均可實(shí)現(xiàn)體外誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞,，通過(guò)不同來(lái)源巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)分化方法的建立，或許可為探索早期自然免疫細(xì)胞的功能提供參考,。

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