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撰文 | 魯伯塤（復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院）

責(zé)編 | 陳曉雪

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清晨醒來,，我不禁又陷入了深深的思考，是什么昨晚又讓我陷入沉睡,，“浪費(fèi)”了6、7個小時的生命,。有人嘆,，“紙衾瓦枕冷如水，輾轉(zhuǎn)無夢睡不成”,；亦有人道：“戀枕嫌多夢,，開簾曙色迷”,；可謂“中人有夢君無夢，樂思幽懷事不同”,。每個人每天都要睡覺,，各人睡覺的長短有不少差異，卻又在一定的范圍之內(nèi),?？刂扑叩摹翱床灰姷氖帧本烤故鞘裁茨兀?/span>

睡眠是一件細(xì)思恐極的事情,。從低等的無脊椎動物到人類都會進(jìn)行睡眠,。試想一下，人類的祖先或者現(xiàn)在的動物,，在睡眠時防御和逃跑能力幾乎喪失,，對突發(fā)的環(huán)境變化的適應(yīng)能力也大大降低，因此極其容易在睡眠中失去生命,。另一方面,，即使沒有上述的危險，睡眠也會造成巨大的代價,。如果有方法能夠延長一個人十年的壽命,，我想大多數(shù)人都會愿意用幾乎一切代價去換取。然而睡眠累計起來即占據(jù)了近三十年的壽命,！ 可以看到,，睡眠是一個大多數(shù)動物都會進(jìn)行，而代價巨大的行為,，所以它也必然是一個至關(guān)重要而又收益極大的行為,。研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，長時間缺乏睡眠會導(dǎo)致神經(jīng)功能下降,，甚至猝死,。近年來發(fā)現(xiàn)睡眠為維持神經(jīng)可塑性所必須，并且可以幫助大腦“洗澡”從而清除其運(yùn)作時產(chǎn)生的“垃圾”【1】,。賓夕法尼亞大學(xué)的Amita Seghal課題組最近還在果蠅模型中發(fā)現(xiàn),，睡眠不足會導(dǎo)致產(chǎn)生的后代數(shù)目嚴(yán)重減少【2】?！安恍⒂腥?，無后為大“。如果Seghal教授的結(jié)論能推廣至其他動物的話,，那么可能可以解釋為什么各種動物都有睡眠行為：產(chǎn)生后代的能力是如此重要,，以至于影響此能力的基因在進(jìn)化中會迅速被淘汰，從而消失在歷史的長河中。因此,，盡管產(chǎn)生睡眠的進(jìn)化原因還并不完全清晰,，睡眠毫無疑問是一種至關(guān)重要乃至可能為動物生存繁衍所必須的行為。

睡眠如此重要,，但我們對它知之甚少,。小時候我就經(jīng)常夢想有一個開關(guān)，把它開了,，人就醒了,，把它關(guān)上，人就睡著了,。長大了,，對科學(xué)有一定了解之后，我知道了有一些控制生物鐘的基因,，它們通過負(fù)反饋控制自身表達(dá)量的變化,，最終控制動物什么時候睡覺。除了控制什么時候睡,，控制睡多長也非常重要,。然而控制睡多長的基因有哪些，它們?nèi)绾喂ぷ?，我們幾乎一無所知,。

如果在50年前，我提出“哪些基因控制睡眠時間”這樣的問題,，大概會被科學(xué)界認(rèn)為是“傻子”（也許比某大國的總統(tǒng)候選人被認(rèn)為“瘋子”或者”騙子“要好一些）,。事實上，20世紀(jì)60年代,，當(dāng)神經(jīng)遺傳學(xué)鼻祖之一Seymour Benzer向加州理工學(xué)院的同事闡述神經(jīng)遺傳學(xué)（neurogenetics）的想法時,，Sydney Brenner（1927-，2002年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎獲得者）和Gunther Stent（1924-2008,，以細(xì)菌新陳代謝研究聞名）等大牛給他的回應(yīng)是：“怎么可能通過遺傳突變體發(fā)現(xiàn)大腦如何工作（How was one going to find out anything about how the brain works by studying mutants）,？”、“他蠢到家了嗎（Was he foolish enough）,？”甚至,，1971年Seymour Benzer發(fā)現(xiàn)第一個控制生物節(jié)律行為的基因per的時候，他的同事Max Delbruck還評論說“我一個字也不相信,！”（I don’t believe a word of it）——雖然Delbruck后來很快成為Benzer最重要的支持者之一,。

隨著控制重要神經(jīng)系統(tǒng)功能（例如生物鐘、求偶,、記憶等）的重要基因被發(fā)現(xiàn),，科學(xué)界逐漸承認(rèn)了復(fù)雜的神經(jīng)功能在很大程度上也受基因控制,。

回到睡眠，睡眠的長短又由哪些基因控制呢,？邏輯上我們可以用兩種方法研究這個問題。我們先根據(jù)已有的線索做出猜測,，哪些基因可能會影響睡眠的長短,。然后使這些基因一個個發(fā)生突變，看睡眠長短是不是真的受到影響,。這種從特定的基因出發(fā),，研究其突變后對表型的影響，就叫做反向遺傳學(xué),。因為基因是隱藏在表型背后的根本,，我們從改變表型背后的根本出發(fā)，研究顯現(xiàn)出的表型,，所以是反向,。人和動物大多數(shù)都有幾萬個表達(dá)蛋白的基因，還有非常多“非編碼”的基因,，對于睡眠這樣復(fù)雜而又所知甚少的行為,，從幾萬個候選基因中直接猜到答案，那得祖墳上冒青煙才會這樣幸運(yùn),，所以反向遺傳學(xué)要回答睡眠基因是什么這個問題,，很可能行不通。

那么用正向呢,？如果我們在一大群動物中隨機(jī)引入基因突變,，然后在這些動物中挑選睡眠長短異常的，在這些異常的動物中再尋找是什么突變導(dǎo)致其異常,，不就能知道睡眠長短受什么基因影響了嗎,？這樣從表型出發(fā)尋找對應(yīng)的基因突變的思路，符合人們由表及里的認(rèn)知,，就是所謂正向遺傳學(xué),。

思路有了，那就要建立方法和模型進(jìn)行實驗,。我們拿什么動物來研究睡眠的基因呢,？要落實到人類的睡眠，最理想的當(dāng)然是直接拿人來研究,。但是人作為研究對象有缺點(diǎn),。首先，無法人為地在人群中主動引入隨機(jī)突變,。盡管人群存在各種基因突變,，但是突變程度有限,，睡眠長期太短或者太長的人很可能已經(jīng)被淘汰，而科學(xué)家又不能利用藥物或輻射去誘發(fā)更多的突變,，因為誘發(fā)突變結(jié)果的不可測,，沒有人會愿意接受自己被誘發(fā)基因突變。其次,，用人做實驗的成本很高,。要組織大量的空間及儀器進(jìn)行觀察記錄，還要找足夠的人配合研究,，最后還要做全基因組測序找突變……當(dāng)然人群的數(shù)據(jù)還是有用的,，比如有些睡眠極少的家族，對我們尋找睡眠基因就非常有幫助,。

除了人之外,，正向遺傳學(xué)研究最常用的模式動物之一是果蠅，果蠅可以理解為喜歡吃水果的一種蠅,。學(xué)過中學(xué)生物課的人都知道,，摩爾根利用果蠅發(fā)現(xiàn)了染色體遺傳理論。前文提到的Seymour Benzer也是用果蠅做實驗的大家,。果蠅在基因操作上有著成熟的系統(tǒng),，特別適合做正向遺傳學(xué)。此外,，果蠅繁殖快,，容易短時間內(nèi)得到足夠的數(shù)量，適合用于研究表型,。

利用果蠅研究睡眠其實在十幾年前還是很有爭議的事情,。筆者2004年還在賓夕法尼亞大學(xué)讀書的時候，就知道那年有一位大牛實驗室發(fā)現(xiàn)了控制果蠅睡眠的腦區(qū),，投稿給Nature,，結(jié)果沒送審就直接被小編（editor）拒稿了，理由是該領(lǐng)域沒有足夠的證據(jù)表明果蠅會睡眠,。大牛很生氣,，直接打電話給編輯進(jìn)行了長達(dá)一個多小時的“子非蠅，焉知蠅不睡” vs “子非蠅,，焉知蠅會睡”的辯論（辯論是有的,，內(nèi)容純屬杜撰）。最后的結(jié)果是editor（編輯）把文章送審,，而且過了一個多月就發(fā)表了,。后來，隨著證據(jù)越來越多,，果蠅會睡覺這個結(jié)論現(xiàn)在已經(jīng)沒有什么爭議了,。只是,，拿果蠅做睡眠長短的篩選研究還是有局限的。由于果蠅很小而數(shù)量多,，篩選時基本上只能根據(jù)其運(yùn)動來判斷睡眠（比如,，果蠅連續(xù)5分鐘以上不動則被判斷為處于睡眠狀態(tài)）。但是我們知道,，人經(jīng)常會假寐,，甚至還會葛優(yōu)躺，清醒的時候持續(xù)5分鐘以上不動也是很有可能的,。而縮小到果蠅的尺度，它們五分鐘不動,，卻可能沒有睡覺,，只是假寐或者葛優(yōu)躺等，但是由于果蠅很小,，看不出來這些情形的區(qū)別,。

盡管有以上的局限，果蠅還是研究睡眠很好的系統(tǒng),，并且為”睡眠遺傳學(xué)“做出了重要的貢獻(xiàn),，比如，第一個睡眠基因shaker就是果蠅中篩選發(fā)現(xiàn)的【3】,。

小鼠也是做遺傳學(xué)常用的模式動物,。與果蠅相比，小鼠研究睡眠有一大優(yōu)勢：除了觀察行為,，我們還可以通過測量小鼠的腦電圖來判斷其是否睡眠,。這樣測量睡眠的方式更直接，得到的數(shù)據(jù)更“干凈”,，并可以區(qū)分假寐,、葛優(yōu)躺和真睡，甚至還可以區(qū)分做夢與不做夢（腦電圖紀(jì)錄到的REM睡眠在人類與做夢相關(guān),，小鼠有REM睡眠,，故而有推測也許也與做夢有關(guān)——如果小鼠有夢的話）。我們今天將要討論的文章“Forward-genetics analysis of sleep in randomly mutagenized mice（隨機(jī)突變的小鼠的睡眠的正向遺傳學(xué)分析）”就是利用小鼠通過正向遺傳學(xué)篩選發(fā)現(xiàn)的新的控制睡眠長短的基因,。這個由日本著名學(xué)者,、筑波大學(xué)國際整合睡眠醫(yī)學(xué)研究所所長、醫(yī)學(xué)醫(yī)療系教授柳沢正史（Masashi Yanagisawa）帶領(lǐng)完成的重要研究剛剛在線發(fā)表于Nature【4】,。

論文實驗部分的第一段就讓我震驚了：研究者用化學(xué)誘變劑ENU在很多雄性小鼠中誘發(fā)了隨機(jī)的基因突變,，然后與野生型雌性小鼠雜交,，并測量了雜交所產(chǎn)生的超過8000只子一代小鼠（F1）的睡眠表型,。總計上萬只小鼠的工作量,，光養(yǎng)小鼠就要幾百萬（人民幣）,！所以我的小實驗室萬萬不敢想這樣的實驗的。而且即使我有錢,，也不一定做的起來,，因為學(xué)生可能會跟我說：“我不想養(yǎng)這么多小鼠，我要畢業(yè),！” 事實上,，根據(jù)文章第一作者Funato2013年給我的郵件，他們在3年半以前就已經(jīng)完成了篩選,，而到最近不久才發(fā)表文章……我只能感慨一句,，真的很佩服這些日本學(xué)者！

他們檢測小鼠睡眠的方法就是前面提到過的測腦電圖,。具體來說,，他們根據(jù)清醒，非眼快動睡眠（NREMS,，可以理解為睡著且沒有做夢）,，以及眼快動睡眠（REMS，可以理解為睡著而且做夢）時腦電波的波形特征的不同,，測量了每只小鼠在一天24小時內(nèi)各種狀態(tài)的時間,，并通過大量的測量，找到了睡眠不正常的小鼠,。通過這些信息,，可以找到睡眠不正常的小鼠家系（pedigree），并且利用這些家系中產(chǎn)生睡眠不正常子代的父親（父本）的精子做人工授精,，進(jìn)一步驗證其基因突變是造成睡眠異常的原因,。

明確了突變與睡眠異常的原因之后，就要在基因圖譜上找到具體是哪個突變導(dǎo)致的,，這個定位的過程叫做mapping,。研究者采用了比較巧妙的方法，他們誘變的父本都具有一樣的遺傳背景（B6J）,，而雜交用的母本則有另一個遺傳背景（B6N）,。這兩個遺傳背景的睡眠沒有什么差別，但是兩者的基因組在特定的不同位置具有特定的核苷酸,，這些位置被稱為單核苷酸多態(tài)性（SNP）,。這些SNP會在子代中按遺傳學(xué)規(guī)律分布，成為了基因組圖譜上的“地標(biāo)“,。而比較睡眠異常的子代與正常的子代中SNP分布的不同,，就可以找到推斷導(dǎo)致睡眠異常的基因的大致位置,。再結(jié)合全基因組測序，就可以明確是哪個具體位置的突變導(dǎo)致了睡眠異常,。用上述方法,，柳澤找到了兩個睡眠異常的家系 “嗜睡”（Sleepy）和“無夢”（Dreamless），分別對應(yīng)了兩個關(guān)鍵的睡眠基因,，Sik3和Nalcn,。

顧名思義，“嗜睡（Sleepy）”意為睡得很長,，這一家系的小鼠每天只有524分鐘（8.7個小時）是清醒的,，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于正常小鼠的清醒時間（約13個小時）。進(jìn)一步分析數(shù)據(jù)可以發(fā)現(xiàn),，嗜睡家系（Sleep）小鼠非快速眼動睡眠（NREMS）時間增加,，也就是多睡了，但并沒有多做夢,。睡得多可能有三個原因，一個是被喚醒的能力差了,，比如用鬧鐘都叫不醒,；一個是生物鐘亂了，導(dǎo)致感受的時間和真實的時間不一樣,；最后一個是喜歡睡,，睡到自然醒的時間很長，但是被喚醒的的能力不變,。

為了驗證以上三個原因,，研究人員做了換籠子、喂咖啡因等喚醒實驗,，也檢測了嗜睡小鼠的生物鐘,，發(fā)現(xiàn)嗜睡小鼠被喚醒的能力沒有減弱，生物鐘也正常,。因此,，突變使得小鼠喜歡睡，睡到自然醒的時間變長最有可能解釋小鼠嗜睡的現(xiàn)象,。進(jìn)一步的實驗和分析發(fā)現(xiàn),，這些小鼠清醒時的腦電波的慢波活動（slow-wave activity）也遠(yuǎn)多于正常小鼠，表示它們清醒的時候其實也經(jīng)常犯困,。此外,，強(qiáng)制它們幾個小時不睡覺之后，它們補(bǔ)覺時間遠(yuǎn)比正常小鼠多,?？傊?，它們真的就是愛睡覺啊，Sleepy（嗜睡）這個名字真的名副其實,。

那么,，嗜睡對應(yīng)的基因是什么呢？通過定位,，發(fā)現(xiàn)嗜睡家系小鼠在一個叫Sik3的激酶基因的一個內(nèi)含子中的突變,，是導(dǎo)致表型的原因。內(nèi)含子本身并不參與編碼蛋白,，但是Sik3的這個突變在內(nèi)含子中剪切體識別的位點(diǎn),，導(dǎo)致Sik3的mRNA剪切錯誤，少了一段（exon13,，即第13個外顯子）,，最終導(dǎo)致Sik3蛋白缺失了一段。為了驗證Sik3蛋白缺失了這一段是導(dǎo)致小鼠嗜睡的主要原因,，研究者們利用基因編輯的手段在正常小鼠中制造了Sik3基因第13個外顯子的缺失,，結(jié)果發(fā)現(xiàn)表型和嗜睡小鼠一樣，從而證明了他們的假設(shè),。

?Sik3 mRNA在前腦神經(jīng)元中被廣泛表達(dá),。來源：Funato H, Miyoshi C, Fujiyama T, et al. Nature . 2016

為什么Sik3缺失了這一小段幾十個氨基酸就影響到睡眠呢？研究者們發(fā)現(xiàn),，這一段的序列高度保守,，也就是從線蟲到人，這一段的蛋白序列幾乎一樣,，而且都包含了一個被PKA磷酸化的RRAS位點(diǎn)（其中的絲氨酸S會被PKA磷酸化）,。因此，作者們猜測,，這個磷酸化位點(diǎn)的缺失可能導(dǎo)致了Sleepy的表型,。他們繼而在果蠅中，在不改變內(nèi)源野生型Sik3的情況下,，誘導(dǎo)表達(dá)磷酸化位點(diǎn)突變?yōu)楸彼岬腟ik3（S563A,，即無法再被PKA磷酸化），導(dǎo)致果蠅很快變得嗜睡,。這不僅證明了PKA磷酸化位點(diǎn)的重要,，而且也預(yù)示著這個Sik3突變很可能是一個功能獲得型突變（gain of function）。一個蛋白突變導(dǎo)致表型有兩種可能：一種是突變導(dǎo)致蛋白功能喪失,，另一種則是突變使得蛋白與野生型不一樣,，獲得了新的功能。在這個實驗里，野生型Sik3并沒有被影響,，所以表型應(yīng)該是Sik3_S563A表達(dá)的蛋白具有的新的功能引起的,。然而，我們也不能排除Sik3_S563A抑制了野生型Sik3的功能從而導(dǎo)致這種表型的可能,。

?產(chǎn)生嗜睡基因突變的小鼠（紫色）清醒時間低于攜帶Sik3野生型基因的小鼠,。來源：Funato H, Miyoshi C, Fujiyama T, et al. Nature . 2016

為了進(jìn)一步驗證Sik3突變是否為功能獲得型突變，研究者們檢測了Sik3功能缺失或敲除的果蠅和線蟲,，發(fā)現(xiàn)它們的睡眠時間變短了,，而非變長，與嗜睡小鼠相反,。這證明了Sik3功能喪失并不會導(dǎo)致嗜睡的發(fā)生,，反而會導(dǎo)致睡得少。因此,，嗜睡小鼠的突變不是功能喪失型突變,，而是是功能獲得型突變（這里為什么不做敲除小鼠了呢？也許是Sik3敲除了會致死,，也許是日本人也忍不了想趕快投文章了吧……）,。

綜上，作者們發(fā)現(xiàn)的第一個控制睡眠長短（但非做夢長短）的Sik3基因,，它表達(dá)的蛋白如果不能被PKA磷酸化會導(dǎo)致嗜睡,。未來也許可以由此開發(fā)PKA的激動劑抑制睡眠，阻斷劑用于增長睡眠呢,！

日本人發(fā)現(xiàn)的另一個睡眠基因Nalcn與筆者很有淵源。事實上,，Nalcn這個名字是我和我的博士生導(dǎo)師Dejian Ren教授命名的,。我和我的導(dǎo)師都是中國人，所以基因名字里有中國的代號CN,。實際上,，這個名字代表Na leak channel nonselective。我們發(fā)現(xiàn)Nalcn表達(dá)的離子通道蛋白在神經(jīng)處于靜息狀態(tài)時,，傳導(dǎo)了一個很小的背景鈉離子漏電流,。盡管這個電流很小，但流入的陽離子也足以使得神經(jīng)元的跨膜電位發(fā)生幾毫伏的變化,，更接近神經(jīng)元進(jìn)入興奮狀態(tài)的閾值,，從而增加其發(fā)放動作電位的幾率，也就增加了神經(jīng)的興奮性,。因此,，這個基因的缺失，會導(dǎo)致神經(jīng)興奮性降低、呼吸等節(jié)律行為喪失,、小鼠出生24小時內(nèi)死亡等嚴(yán)重后果,。與大多數(shù)離子通道不同，Nalcn表達(dá)的離子通道的電導(dǎo)不受電壓影響,，但是會受神經(jīng)肽和細(xì)胞外鈣離子濃度等調(diào)控,，因此可能參與多項生理及病理過程。近年來的研究也發(fā)現(xiàn)這個基因的突變的確是導(dǎo)致多種神經(jīng)興奮性疾病的原因,。

Nalcn在睡眠中起作用,，某種程度上可以說是意料之中。睡眠時細(xì)胞外鈣離子濃度會周期性變化,，我曾經(jīng)猜測Nalcn可能感受此變化由此控制神經(jīng)的周期性興奮從而控制睡眠時間,。而美國科學(xué)家Ravi Allada等人在2015年則根據(jù)我已發(fā)表的工作及他們的數(shù)據(jù)提出了Nalcn參與生物鐘節(jié)律（Circadian）的“自行車”模型（Bicycle model）【5】。白天活躍時,，Nalcn結(jié)合蛋白NFL-1的活性增強(qiáng),，導(dǎo)致Nalcn蛋白分子到達(dá)細(xì)胞膜（上膜）的數(shù)目增加，從而增加神經(jīng)興奮性,，動物處于活動期,。晚上休息時，NFL-1的活性減弱,，導(dǎo)致Nalcn上膜減少,，從而降低神經(jīng)興奮性，動物進(jìn)入休息睡眠期,。

在日本科學(xué)家的這篇文章中,，作者們發(fā)現(xiàn)了Nalcn的突變引起的一個非常有趣的表型：無夢（dreamless）。無夢的小鼠,，清醒和不做夢的睡眠總時間相比正常小鼠只有很輕微的增加,，而做夢（即眼快動睡眠，REMS）的總時間則減少了近一半（因為REMS的基數(shù)?。?/span>,。進(jìn)一步的分析發(fā)現(xiàn)，做夢減少的原因是做夢的時間碎片化了,，從夢境中醒來變得非常頻繁,。換句話說，夢境變得非常不穩(wěn)定（有沒有想起《盜夢空間》,？）,。

進(jìn)一步的遺傳學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，無夢這個突變實際上是Nalcn的一個點(diǎn)突變,，導(dǎo)致其Nalcn蛋白的315號氨基酸由天冬酰胺變成了賴氨酸（N315K）,。通過電生理的記錄發(fā)現(xiàn)，突變后的Nalcn通道所介導(dǎo)的電流與野生型電流的性質(zhì)完全一樣，但是電導(dǎo)要大很多,。這樣的直接結(jié)果是神經(jīng)的興奮性增加,，小鼠也就更容易從夢境中醒來。與之一致,，突變小鼠控制做夢的 deep mesencephalic nucleus（DpMe）神經(jīng)元的興奮性大大增加,，從而可能導(dǎo)致了小鼠夢境的不穩(wěn)定，做夢也就減少,。這很明顯也是一個功能獲得型突變,，因為突變使得Nalcn電導(dǎo)增加，而非減少或喪失,。這與我們之前的結(jié)果一致：增加Nalcn電導(dǎo)會增加神經(jīng)興奮性,，最終導(dǎo)致dreamless（無夢）。而這里作者們沒有做功能喪失型突變實驗的理由就很充分了——我和博士生導(dǎo)師很多年前就發(fā)現(xiàn)了,，功能喪失了會死啊……

通過正向遺傳學(xué)的方法和上萬只小鼠的腦電圖測量,，柳澤和同事們找到了影響睡眠時間和做夢時間的兩個關(guān)鍵基因，不僅意味著我們對睡眠的認(rèn)識逐漸到達(dá)了分子水平,，也意味著我們也許以后能找到控制睡眠長短甚至做夢長短的方法或藥物,，甚至訂制夢境也并非癡人說夢……

這項研究也帶來很多新的問題：為什么Sik3的磷酸化能控制睡眠長短？為什么又要通過PKA控制這一點(diǎn),？為什么Nalcn突變影響神經(jīng)興奮性卻只影響做夢時間,？等等。關(guān)于最后一個問題,，筆者其實有一些想法,，歡迎有興趣的科學(xué)家們一起討論。

最后,，最重要的是,，當(dāng)你睡懶覺，而父母喊你早起時,，你可以翻出Nature這篇文章告訴他們：睡懶覺是遺傳的啦！

?北京大學(xué)教授饒毅今年2月參加筑波大學(xué)柳沢正史組織的學(xué)術(shù)會議時紀(jì)錄其研究,，柳沢正史當(dāng)時公布已經(jīng)拿到基因,，但未公布基因是什么。

感謝丁澦,、馮欣然,、崔笑添以及饒毅教授的意見。

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