編譯：小北,，編輯：景行、江舜堯,。

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原名：Single-Cell RNA-Seq Reveals Cellular Hierarchies and Impaired Developmental Trajectories in Pediatric Ependymoma

譯名：單細(xì)胞RNA序列揭示小兒室管膜瘤的細(xì)胞層次結(jié)構(gòu)和受損的發(fā)育軌跡

期刊：Cancer Cell

IF：26.602

發(fā)表時(shí)間：2020年7月

通訊作者：Mariella G. Filbin

通訊作者單位：海德堡大學(xué)醫(yī)院

DOI號(hào)：10.1016/j.ccell.2020.06.004

研究者致力于從不同分子群體和解剖位置的EPN組織中生成單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。研究者利用全長(zhǎng)的單細(xì)胞RNA-seq技術(shù)分析了18個(gè)EPN患者中20個(gè)新鮮的外科手術(shù)腫瘤樣本,、8個(gè)病人源性的細(xì)胞模型以及兩個(gè)病人源性的異種皮移植(PDX)模型（圖1A）,。四個(gè)細(xì)胞模型與新鮮的患者腫瘤匹配（表S1）。此外,，速凍的EPN組織（n = 14）包括在單核RNA-seq(snRNA-seq)分析中（圖1A）,。研究者通過(guò)每個(gè)樣本的DNA甲基化進(jìn)行了分子群體的分析（圖1A）。共計(jì)分析了74,927單個(gè)的腫瘤細(xì)胞/核,，scRNA-seq繪制的5,232細(xì)胞圖譜通過(guò)質(zhì)控,，每個(gè)細(xì)胞檢測(cè)到的中位數(shù)為4,652個(gè)基因。SnRNA-seq獲得了另外2,137/67,420細(xì)胞核(Smart-seq2/10X Genomics),，每個(gè)核檢測(cè)到的中位數(shù)為3,072/3,089個(gè)基因,。

為了區(qū)分癌細(xì)胞和非癌細(xì)胞，研究者根據(jù)scRNAseq/ snRNA-seq的數(shù)據(jù)推斷了全基因組拷貝數(shù)突變（CNAs）（圖1B）并且與非癌對(duì)照組比較了CAN圖譜,。在大多數(shù)樣本(n = 24/28)中檢測(cè)到了大范圍的CNAs并且與DNA-甲基化數(shù)據(jù)源性的進(jìn)行匹配,。CNAs包括獲得特征染色體1q (PF-A, ST-RELA)以及其他典型的EPN-CNAs包括Chr6q缺失(PF-A, PF-B, ST-中線) 、Chr22單染色體性以及Chr5p獲得（PF-A和PF-B）,。接下來(lái)研究者將所有的樣本依據(jù)它們的轉(zhuǎn)錄圖譜進(jìn)行聚類（圖1C）,。一些細(xì)胞集簇缺乏CAN并且對(duì)正常細(xì)胞類型特異的標(biāo)記基因高表達(dá)，包括小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞(n=296, eg, CD14,FCER1G, CSF1R),、T細(xì)胞(n=111, eg, CD3E, CD4, CD8A),、少突膠質(zhì)前體細(xì)胞(OPCs) (n=101, eg, OLIG1,APOD, PDGFRA)、少突膠質(zhì)細(xì)胞(n=149, eg, MBP, PLP1,MOG)以及內(nèi)皮細(xì)胞(n=153,eg, IFITM1, CAV1, TM4SF1),。那些細(xì)胞被認(rèn)為是非癌細(xì)胞并且在下游分析中排除,。

因此，這兩種方法都能將細(xì)胞分為癌細(xì)胞和正常的亞群,。通過(guò)Smart-seq2在所有腫瘤樣本中總共分類了87.8%的細(xì)胞。

圖1 人類EPN單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的分類 ,。(A) 新鮮/冷凍患者樣本(n = 28),、患者來(lái)源細(xì)胞模型(n = 8)以及PDXs (n = 2)的EPN數(shù)據(jù)庫(kù)中臨床和分子細(xì)節(jié)，對(duì)每個(gè)樣本進(jìn)行scRNAseq,，匹配對(duì)(n = 5)用上標(biāo)符號(hào)表示,。(B) 根據(jù)scRNAseq（上）/ snRNA-seq（下）的數(shù)據(jù)中100個(gè)基因的相對(duì)表達(dá)推斷全基因組拷貝數(shù)突（CNAs），每一排對(duì)應(yīng)一種細(xì)胞,，按照腫瘤順序排列并且在每個(gè)腫瘤內(nèi)依據(jù)CAN圖譜進(jìn)行聚類,。(C) 對(duì)scRNA-sq和snRNA-seq來(lái)源的所有細(xì)胞進(jìn)行tSNE分析,，依據(jù)CNAs以及與非癌細(xì)胞群體（T細(xì)胞、少突膠質(zhì)前體細(xì)胞[OPC],、少突膠質(zhì)細(xì)胞,、小膠質(zhì)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞）表達(dá)圖譜的相似性標(biāo)注不同的顏色,。

2 后顱窩EPN由多個(gè)分化的以及未分化的腫瘤細(xì)胞群體構(gòu)成

為了描述PF-EPN,，研究者利用14個(gè)PF患者的腫瘤作為原發(fā)性群體并且利用另外4個(gè)樣本(WEPN1/Dia, WEPN1/Rec, WEPN20/Dia, WEPN20/Rec)對(duì)腫瘤復(fù)發(fā)進(jìn)行確定和研究（圖1A）。BT1313和BT1334兩個(gè)樣本大多數(shù)包括免疫細(xì)胞因此也排除了非負(fù)矩陣分解分析,。研究者通過(guò)NMF確定了復(fù)發(fā)的轉(zhuǎn)錄程序并且將它們合并為9個(gè)元程序（圖2A）,。此外研究者還利用了基于圖形的聚類分析。兩種方法獲得了高度重合的聚類,，證實(shí)了能夠確定細(xì)胞亞群的基因特征,。研究者檢測(cè)了已知細(xì)胞類型特異性的標(biāo)記物基因的基因特征，并將它們與人類和鼠發(fā)育以及成熟腦細(xì)胞相關(guān)數(shù)據(jù)組整合,，利用GO分析進(jìn)行功能注釋,，發(fā)現(xiàn)有兩個(gè)元程序與細(xì)胞周期基因密切相關(guān)并且最終定義為PF-S時(shí)期(eg, TYMS, PCNA, MCM2/4/5/7)以及PF-G2M時(shí)期(eg, CDC20, CCNB1, PLK1)（表S4）。研究者將這些元程序中分值最高的細(xì)胞解釋為細(xì)胞周期的細(xì)胞群體,，大多數(shù)無(wú)一例外的發(fā)生在PF-A樣本中,。另外兩個(gè)元程序的更接近成熟的細(xì)胞類型：表達(dá)纖毛發(fā)生標(biāo)記物的PF-室管膜樣細(xì)胞（如DNAAF1,DNAI2, RSPH1），并且在鼠相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)中與分化的室管膜細(xì)胞類型具有相同的全轉(zhuǎn)錄組程序（表S4）,。PF-室管膜星形的特征包括星形膠質(zhì)細(xì)胞經(jīng)典的標(biāo)記物基因(eg, AQP4, ALDOC,S100B, GFAP),，并且在人類和小鼠的數(shù)據(jù)庫(kù)中與星形膠質(zhì)細(xì)胞密切相關(guān)。另外三個(gè)元程序代表未成熟的干細(xì)胞樣細(xì)胞,、神經(jīng)元或者神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的前體,。PF-神經(jīng)元干細(xì)胞樣程序(PFNSC-樣)與轉(zhuǎn)錄活性和干性相關(guān)（eg，FOS, LGR5, ZFP36, EGR1, JUN）,，這編程了大量未成熟的細(xì)胞,，可在講來(lái)作為正常細(xì)胞譜圖可用。PF神經(jīng)元前體樣細(xì)胞包括神經(jīng)元相關(guān)的基因(STMN1/2/4, SOX4/11, ELAVL4, L1CAM),，而PF-神經(jīng)膠質(zhì)前體樣程序與神經(jīng)膠質(zhì)的早期相關(guān)(FABP5, BCAN),。還有兩個(gè)元程序被確定為代表不同細(xì)胞代謝/免疫-反應(yīng)狀態(tài)并且包含與糖酵解(PF-代謝, eg., PGK1, GAPDH, PFKP)以及免疫效應(yīng)過(guò)程（PF-免疫反應(yīng)，eg, IFITM3, HLA-C, C4B）密切相關(guān)的基因,。在PF-代謝程序內(nèi),，一些GO富集的條目也提示缺氧反應(yīng)。

為了進(jìn)一步確定元程序的牢固性,，研究者將三個(gè)凍存的PF-A樣本與已經(jīng)分析過(guò)的新鮮樣本進(jìn)行匹配通過(guò)10X Genomics構(gòu)建了snRNA-seq,，并且發(fā)現(xiàn)了相似的基因程序。此外,，元程序在PF-A PDXs和體外細(xì)胞模型中也可部分重復(fù),。然而,，PDX模型最接近新鮮病人組織中原始的細(xì)胞狀態(tài)。

研究者接下來(lái)在所有PF腫瘤中比較了scRNA-seq圖譜（圖2A,、2B）,。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PF-A腫瘤中最具侵襲性的分子群在每個(gè)腫瘤中包含一個(gè)高復(fù)雜性的元程序,，并且富集分化最小的細(xì)胞（p < 0.001）(圖2C ),。有趣的是，增殖的細(xì)胞被限制在三個(gè)未分化的亞群中：PF-NSC-樣, PF-神經(jīng)元-前體-樣以及PF-神經(jīng)膠質(zhì)-前體-樣,。相反,，更陽(yáng)性的分子群組PF-B和PF-SE的樣本都無(wú)一例外的包含增殖能力最小的、表達(dá)PF-室管膜樣以及PF-室管膜星形細(xì)胞樣更加分化的細(xì)胞群體（圖2C）,。

研究者繼續(xù)研究了調(diào)節(jié)這些程序的潛在轉(zhuǎn)錄因子（TFs）,，結(jié)果發(fā)現(xiàn)FOXJ1靶向的基因更傾向于在PF-室管膜樣亞群中表達(dá)（p < 0.001），不是PF-B特異的但是是纖毛原性程序的標(biāo)記物,，并且在PF-A亞群中也觀察到了室管膜的分化（圖2C,、2D）。

此外,，研究者通過(guò)單細(xì)胞調(diào)控網(wǎng)絡(luò)SCENIC集簇分析全面推斷了TF調(diào)控網(wǎng)絡(luò),。在研究者的數(shù)據(jù)組中確定的TF調(diào)節(jié)子有超過(guò)一半高度活化的在之前的報(bào)道中發(fā)現(xiàn)。另外,，SCENIC也提示在PF-室管膜-樣元程序內(nèi)有其他的TF調(diào)節(jié)子,，包括RFX2和TP73，兩個(gè)在纖毛發(fā)生中發(fā)揮重要作用（圖2E）,。PF-NSC-樣細(xì)胞TF的特征包括JUN, FOS, ATF3,這幾個(gè)基因也是亞群中高表達(dá)的基因（圖2E）,。在PF-NSC-樣細(xì)胞中其他具有高活性的TF調(diào)節(jié)子有SRF和JDP2，兩者在抑制分化并且誘導(dǎo)多能性中發(fā)揮重要作用（圖2E）,。PF-神經(jīng)元-前體樣程序也表現(xiàn)出選擇性的TF特征,，包括NEUROG1/2以及ARID3A（圖2E），能夠參與調(diào)節(jié)神經(jīng)發(fā)生并且促進(jìn)致瘤性干性,。最后,，PF-神經(jīng)膠質(zhì)-前體樣細(xì)胞表現(xiàn)出TF的特征，包括OLIG2,，Lastly,與早期神經(jīng)膠質(zhì)命運(yùn)的確定是一致的,，提示這一元程序的前體樣狀態(tài)（圖2E）。

接下來(lái)研究者旨在PF-A樣本中通過(guò)利用RNA原位雜交(RNAISH)確定完整腫瘤組織中元程序的表達(dá),。在PF-A腫瘤切片中，對(duì)顯著基因分析發(fā)現(xiàn)PF-室管膜樣（CD36）和PF-NSC樣（ATF3）標(biāo)記物互斥表達(dá),，并且是在某些程度上細(xì)胞的空間集簇表達(dá)對(duì)應(yīng)的程序（圖2F）,。在研究者匹配的腫瘤對(duì)中確定scRNA-seq的數(shù)據(jù),，研究者通過(guò)RNA-ISH發(fā)現(xiàn)與上述局部復(fù)發(fā)的組織MUV021相比，在轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的PF-A腫瘤組織MUV038中PF-NSC樣特征的細(xì)胞表達(dá)上升而表達(dá)PF-室管膜樣程序的細(xì)胞表達(dá)降低（圖2F）,。

總之,，PF-EPN細(xì)胞的scRNA-seq分析發(fā)現(xiàn)特異的TF調(diào)節(jié)回路驅(qū)動(dòng)了不同腫瘤細(xì)胞亞群。未分化的NSC樣以及早期神經(jīng)元-前體樣腫瘤細(xì)胞類型在侵襲性的PF-A腫瘤中富集,，而分化的室管膜樣細(xì)胞類型主要在診斷良好的PF-B以及PF-SE腫瘤中發(fā)現(xiàn),。

圖2 PF-EPN腫瘤內(nèi)的異質(zhì)性。(A) 2773個(gè)腫瘤細(xì)胞中前30個(gè)基因每個(gè)PF元程序的相對(duì)表達(dá),；(B) 所有新鮮PF腫瘤細(xì)胞中tSNE點(diǎn)圖,，依據(jù)分配的PF元程序標(biāo)注不同的顏色；(C) 每個(gè)樣本中每個(gè)元程序的相對(duì)頻率,，依次展示為PF-A, PF-B以及PF-SE,。MUV021 vs MUV038:PF-室管膜樣細(xì)胞(p = 2.9×10-112)以及PF-NSC樣細(xì)胞(p = 3.1×10-123)；(D) PF-EPN元程序中FOXJ1靶基因表達(dá)的數(shù)值,；SCENIC分析PF-EPN亞群特異的TF平均相對(duì)活性,；（F）與scRNA-seq樣本對(duì)應(yīng)，經(jīng)福爾馬林固定,、石蠟包埋(FFPE)組織切片上PF-NSC-樣（ATF3）標(biāo)記物與PF-室鼓膜樣(CD36)標(biāo)記物的RNA原位雜交,。箭頭和星號(hào)分別代表ATF3或者CD36陽(yáng)性的細(xì)胞，標(biāo)尺為20 mm,。

3 癌癥分化的軌跡具有診斷的效應(yīng)并且可能作為治療的靶向

研究接下來(lái)致力于通過(guò)RNA速度測(cè)定PF-EPN細(xì)胞內(nèi)的分化軌跡,。本研究的PF scRNA-seq的數(shù)據(jù)表明在PF-NSC樣細(xì)胞中出現(xiàn)細(xì)胞等級(jí)并且有三個(gè)主要的軌跡：大多數(shù)細(xì)胞沿著室管膜星形細(xì)胞向室管膜樣細(xì)胞分化（圖3A）。第二個(gè)軸線發(fā)生在向神經(jīng)膠質(zhì)前體樣細(xì)胞,，表達(dá)某些放射狀神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和早期神經(jīng)膠質(zhì)譜系標(biāo)記物的基因,。第三個(gè)是包含PF-神經(jīng)元前體樣細(xì)胞的最小細(xì)胞群體，表達(dá)早期神經(jīng)元命運(yùn)的基因,，但潛在的發(fā)育軌跡與所有的PF腫瘤是一致的,。

研究者接下來(lái)評(píng)估了131例存活的PF-EPN中整體RNA表達(dá)矩陣中轉(zhuǎn)錄特征的診斷效應(yīng)。通過(guò)高或低水平的PF-室管膜樣特征的分離發(fā)現(xiàn)高表達(dá)這一程序的腫瘤是PF-B或者預(yù)后良好的PF-A亞群（圖3B）,。為了支撐這一發(fā)現(xiàn),，PF-室管膜樣特征更顯著的在整體存活期(OS)、無(wú)進(jìn)展存活期(PFS)病人以及PF-A病人中分離（圖3C）,。這一結(jié)果由多元COX回歸分析證實(shí)在OS和PFS中PF-室管膜樣特征可作為獨(dú)立的診斷因子,。此外，低表達(dá)PF-室管膜樣特征的PF-A案例中死亡率7.3倍升高,?？紤]到PF-神經(jīng)元前體樣特征，PF-B腫瘤集簇全部在“低”表達(dá)的矩陣,，而PFA腫瘤被分離在“高”和“低”集簇中,。在PFN神經(jīng)元前體樣程序中高表達(dá)的EPNs具有更差的OS,，甚至只包括PF-A的病人（圖3D、3E）,。相反,，所有剩余的程序，除了矩陣分為“高”和“低”表達(dá)的群體,，與病人的結(jié)果并不相關(guān),。此外，研究者發(fā)現(xiàn)在室管膜分化和更高年齡的EPN病人之間存在正相關(guān),，而PF-神經(jīng)元-前體特異的/PF-NSC特異的標(biāo)記物和年齡之間負(fù)相關(guān),。

研究進(jìn)一步檢測(cè)了1q獲得的腫瘤樣本是否在未分化的程序中富集，觀察到分化的PF-A室管膜樣細(xì)胞數(shù)量更少而干細(xì)胞樣PF-神經(jīng)膠質(zhì)前體樣細(xì)胞的數(shù)量升高,。分析的結(jié)果受小的樣品體積(n = 7)以及病人間高的異質(zhì)性限制,。

由于在EPN參與中腫瘤復(fù)發(fā)代表主要的臨床問(wèn)題，研究者在診斷/早期復(fù)發(fā)與晚期復(fù)發(fā)樣本中研究了三個(gè)匹配的PF-A對(duì),。研究者發(fā)現(xiàn)診斷時(shí)主要分化的PF-室管膜樣以及PF-A室管膜樣細(xì)胞向復(fù)發(fā)時(shí)未分化的PF-NSC樣,、PF-神經(jīng)膠質(zhì)前體樣細(xì)胞以及增殖細(xì)胞的轉(zhuǎn)變。

為了改進(jìn)未來(lái)治療的方法,，本研究探究了靶向潛在的信號(hào)通路以及確定表達(dá)特征的特異生物標(biāo)記物,。整合了細(xì)胞群體特異的基因與藥物基因相互作用數(shù)據(jù)庫(kù)（(DGIdb），將藥物干預(yù)可行的靶基因優(yōu)先排列,。對(duì)于PFN-神經(jīng)元前體樣亞群,，這些分析提示包括表觀調(diào)節(jié)因子HDAC2, DNMT3A, BRD3；信號(hào)通路相關(guān)的基因PIK3R3, MAP4K4, and MAPK6,；微管相關(guān)的基因TUBA1A, TUBB, TUBB2A, TUBB2B, TUBB3,；以及活化素受體基因ACVR2A、ACVR2B具有藥物脆弱點(diǎn)（圖3F）,。PF-神經(jīng)元前體樣細(xì)胞也表達(dá)ABCC5,，在血腦屏障中能夠轉(zhuǎn)運(yùn)一些抗癌藥劑的一種ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體。PF-神經(jīng)元前體樣程序中DGIdb譜系顯著富集的GO條目功能網(wǎng)絡(luò)圖譜發(fā)現(xiàn)激酶活性相關(guān)的機(jī)制以及神經(jīng)元發(fā)育過(guò)程中L1CAM調(diào)節(jié)的信號(hào)通路富集（圖3G）,。作為功能確定的第一條準(zhǔn)則,，研究者在表達(dá)這一基因的兩個(gè)PF-A細(xì)胞模型中通過(guò)帕比司他抑制HDAC2，確實(shí)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞存活率顯著降低,，并且次生球?qū)拥男纬墒艿揭种啤?/span>

成功的PF-NSC-樣程序包括Wnt信號(hào)通路調(diào)節(jié)因子LGR5,、抗凋亡基因MCL1以及腫瘤干性相關(guān)的基因作為潛在的藥物脆弱點(diǎn)（圖3H）。PF-NSC樣亞群的功能網(wǎng)絡(luò)圖譜支撐了這些結(jié)果并且同樣富集的信號(hào)通路聚集在LGR5信號(hào)通路,、FOS/FOSB/JUN/JUNB調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄因子活性,、MCL1-依賴的抗凋亡活性以及細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)，在這一亞群中也反映了一個(gè)高比例的增殖活化細(xì)胞（圖3G）。的確,，LGR5在PF-NSC樣細(xì)胞中顯著上調(diào)（圖3I）,，并且在siRNA調(diào)節(jié)的LGR5敲除實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蛟贚GR5表達(dá)病人譜系的PF-A模型VBT96中顯著抑制細(xì)胞球的形成（圖3J）,。

因此,，研究者發(fā)現(xiàn)PF-EPN中單細(xì)胞等級(jí)反映了生理上停滯的分化軌跡，從NSC樣腫瘤細(xì)胞群體到神經(jīng)元前體樣,、未成熟神經(jīng)膠質(zhì)樣以及更加分化的室管膜樣種系,。這些轉(zhuǎn)錄狀態(tài)可作為已建立分子組中穩(wěn)健的風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)因子并且提示未來(lái)治療策略中是第一個(gè)亞群特異性并且靶向分子腫瘤依賴。

圖3 PF-EPN中腫瘤細(xì)胞分化軌跡以及它們的診斷和治療相關(guān)性,。（A）PF元程序RNA速度推算,，每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)細(xì)胞，依據(jù)對(duì)應(yīng)的元程序?qū)⒓?xì)胞標(biāo)記不同的顏色,，箭頭代表所推測(cè)細(xì)胞命運(yùn)的速度,；（B）（C）依據(jù)整體mRNA表達(dá)數(shù)據(jù)，PF-室管膜樣元程序中前30個(gè)基因的表達(dá)水平對(duì)PF和PF-A EPN的整體生存期進(jìn)行分類,；（D）（E）依據(jù)整體mRNA表達(dá)數(shù)據(jù),，PF-神經(jīng)元前體樣元程序中前30個(gè)基因的表達(dá)水平對(duì)PF和PF-A EPN腫瘤的整體生存期進(jìn)行分類。log-rank檢驗(yàn)證實(shí)顯著性水平,；（F）餅圖展示通過(guò)整合PF-神經(jīng)元前體樣元程序的顯著基因與DGIdb分析,，得到的靶向治療候選基因；（G）PF-神經(jīng)元前體樣以及PF-NSC樣元程序中DGIdb富集分析得到的GO條目,；（H）餅圖展示通過(guò)整合PF-NSC樣元程序的顯著基因與DGIdb分析,，得到的靶向治療候選基因；（I）在PF-EPN元程序中Log-LGR5的轉(zhuǎn)化表達(dá),；（J）使用siLGR5或非靶向siRNA (siScr)轉(zhuǎn)染PF-EPN細(xì)胞模型VBT96 48 h和72 h后相對(duì)球形面積,。

4 ST-EPN是由多樣的且分子組特異的細(xì)胞類型組成

研究者分析了8個(gè)ST-EPN樣本，包括ST-RELA (n=5),、ST-YAP1 (n=1)以及兩個(gè)隨后復(fù)發(fā)的手術(shù)樣本,，通過(guò)甲基化圖譜劃分ST-EPN病人(BT1030, CPDM0785)為PFA（圖1A），也將這些樣本作為ST中線,?？傊芯空咴谒蠳MF和基于圖表聚類定義的所有病人中檢測(cè)了10個(gè)元程序（圖4A-4C）,。兩個(gè)元程序與細(xì)胞周期基因密切相關(guān)并且最終定義為ST-S期(eg, KIAA0101, MCM2-7,PCNA)和ST-G2M期(NUSAP1, CDC20, CDK1),。那些循環(huán)中的細(xì)胞全部無(wú)一例外的發(fā)生在STRELA腫瘤中。更重要的是,，一個(gè)更加分化的元程序ST-室管膜樣被纖毛發(fā)生的標(biāo)記物描述(eg, SPAG6, LRRC48, DNAAF1),，在相關(guān)的數(shù)據(jù)庫(kù)中代表成熟的室管膜細(xì)胞并且與PF-室管膜樣細(xì)胞表現(xiàn)出很高的轉(zhuǎn)錄重疊。有趣的是，匹配的ST-中線對(duì)在后者(CPDM0785)的分化亞群中降低（圖4C）,。STRELA能夠表達(dá)另外兩個(gè)代表未分化前體細(xì)胞的元程序,，然而ST-YAP1腫瘤細(xì)胞不能。在ST-RELA中未分化的程序能夠與人類和小鼠相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)中放射狀膠質(zhì)細(xì)胞高度匹配,。這一元程序只限制在PF-EPNs中與PF-NSC樣細(xì)胞重合,，并且最終定義為ST-放射狀神經(jīng)膠質(zhì)樣細(xì)胞。在ST-EPN中第二個(gè)未分化的程序在ST-神經(jīng)元前體樣中表達(dá)確定早期神經(jīng)元命運(yùn)的基因(STMN2/4, ELAVL4, NEUROD1),。另外兩個(gè)程序在ST-RELA腫瘤中存在但是在STYAP1腫瘤中不存在,，并且表達(dá)干擾素信號(hào)重要的基因(ST-干擾素響應(yīng), eg, ISG15, IFI6/27/30, IFIT1/3)，或者與糖酵解以及缺氧密切相關(guān)(ST-代謝, eg, LDHA, ENO2, PGK1),。另一個(gè)程序僅在ST-RELA腫瘤MUV043中發(fā)現(xiàn),，與結(jié)締組織發(fā)展和細(xì)胞外間質(zhì)組織相關(guān)(eg, DLK1, PCP4, ACPT)（圖4C）。ST-中線以及ST-YAP1腫瘤都特異的表達(dá)各自的元程序,，分別被命名為ST-中線以及ST-YAP1,。類似于PF腫瘤，通過(guò)10 X Genomics匹配的病人組織的snRNA-seq總結(jié)了通過(guò)scSmart-seq2在新鮮病人組織中確定的表達(dá)圖譜,。此外,，ST-RELA PDX和神經(jīng)球狀細(xì)胞模型源的元程序與黏連的ST-RELA細(xì)胞培養(yǎng)相比更能代表病人的轉(zhuǎn)錄程序。

為了確定C11orf95-RELA融合基因的潛在下游靶基因,，研究者首先在所有EPN亞群中獲得了“野生型RelA”和“C11orf95-RelA融合”的靶基因的結(jié)合體,。這些基因在所有ST-RELA亞群中表達(dá)并且在ST-代謝、ST-干擾素響應(yīng)以及STRELA-突變程序中中度富集,。通過(guò)C11orf95-RELA融合體特異活化的基因具有相似的表達(dá)圖譜,。

第二，研究者進(jìn)行了SCENIC分析獲得了更加廣泛的RELA靶基因列表,，以檢測(cè)亞群間的TF活性,。這提示ST-RELA腫瘤中在所有七個(gè)程序中RELA TF的活性很高，而YAP1-和ST-中線特異的程序中RELA信號(hào)通路的活性很低,。此外,，SCENIC分析提示ST-室管膜樣、ST-中線,、ST-YAP1,、ST-RELA-突變體以及ST-神經(jīng)元前體樣亞群中TF特征不同（圖4D），后者與PF-神經(jīng)元前體樣細(xì)胞表達(dá)NEUROG1,。相反,，ST-室管膜樣細(xì)胞由TF網(wǎng)絡(luò)(RFX8, SRY,CAT, PAX8, GATA1)描述，與PF-室管膜樣中不同（圖2E）,，也反映了TF活性的區(qū)域特異性,?？傊@些數(shù)據(jù)提示在ST-RELA所有亞群中RELA靶向基因表達(dá)的首要作用,，但提示轉(zhuǎn)錄多樣性導(dǎo)致多樣細(xì)胞狀態(tài)是不依賴于C11orf95-RELA活性的,。

總之，ST-EPN的scRNA-seq說(shuō)明STRELA腫瘤是高度增殖的,、未分化的放射狀神經(jīng)膠質(zhì)樣或者有限分化程序的神經(jīng)元前體樣細(xì)胞（圖4C）,。ST-中線以及ST-YAP1 EPN組甚至表現(xiàn)出更低的轉(zhuǎn)錄復(fù)雜性，并且未分化的以及增殖的細(xì)胞比例相對(duì)更少,，這些分子ST-EPN亞群反映出更輕的病程,。

5 ST-EPN元程序預(yù)測(cè)病人的生存期并且能夠作為治療的靶向

研究者再次利用RNA速度評(píng)估了ST-RELA腫瘤內(nèi)潛在的分化軌跡，在ST-EPN中發(fā)現(xiàn)腫瘤內(nèi)和腫瘤間具有高度的異質(zhì)性,。如上圖描述的,，ST-RELA腫瘤內(nèi)大部分細(xì)胞很少分化為前體樣細(xì)胞，包括放射狀神經(jīng)膠質(zhì)樣和神經(jīng)元前體樣細(xì)胞,，而很少的細(xì)胞表達(dá)分化的程序（如ST-室管膜樣）,。結(jié)果，RNA速度在未分化的群體中沒(méi)有一個(gè)清晰的發(fā)育層次,。

研究者接下來(lái)聚集了大量的 RNA-seq 患者群體(n=30)為高表達(dá)和低表達(dá)的群組,，探究了ST-EPN元程序在危險(xiǎn)層級(jí)中的重要性。盡管分化的ST-室管膜樣特征僅在研究者ST-EPN scRNAseq群體的一小部分出現(xiàn),，研究者在整體表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)的一些腫瘤中發(fā)現(xiàn)這一轉(zhuǎn)錄程序的分值很高,。與PF-EPN類似，依據(jù)高vs低的ST室管膜樣特征的分離說(shuō)明高表達(dá)這一程序的腫瘤顯著表現(xiàn)較好的預(yù)測(cè)（圖5A）,。研究者也分別在ST-RELA腫瘤中證實(shí)（圖5B）,。

為了確定ST-RELA中藥物的脆弱點(diǎn)，研究者將DGIdb與特異性的基因整合,，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了可作為靶向的基因CCND2, HDAC2, EFNA5（ST-神經(jīng)元前體樣）（圖5C）,；FGFR3, IGF2, WNT7B（ST-放射狀神經(jīng)膠質(zhì)樣）（圖5D）；RPS6KB2,、EGFL7（ST-RELA突變體）（圖5E）,。DGIdb功能網(wǎng)絡(luò)的成功繪制提示ST-放射狀-神經(jīng)膠質(zhì)樣細(xì)胞與激酶活性相關(guān)的過(guò)程相關(guān)，而ST-神經(jīng)元-前體樣基因在調(diào)節(jié)軸突導(dǎo)向的信號(hào)電路中發(fā)揮重要作用（圖5F）,。ST-RELA突變體程序包括主要的多藥外排轉(zhuǎn)運(yùn)體ABCB1的機(jī)制（圖5F）,。

正如功能確定實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的，研究者發(fā)現(xiàn)對(duì)ST-放射狀神經(jīng)膠質(zhì)樣程序標(biāo)記物FGFR3的瞬時(shí)、siRNA介導(dǎo)的KD（圖5D）顯著損害具有細(xì)胞球形成能力的FGFR3表達(dá)的VBT242細(xì)胞（圖5H）,。利用FGFR抑制劑多維替尼能夠有效抑制VBT242細(xì)胞的存活,。同樣臨床上支撐的ALK抑制劑也能抑制IGF2/IGF1R軸線，ST放射狀神經(jīng)膠質(zhì)樣細(xì)胞的另一標(biāo)記物,，有效降低這一模型中的細(xì)胞存活,。此外，利用帕博西尼（靶向CDK4/6-CCND2分子）和賽立替尼（靶向IGF2/IGF1R軸線）抑制劑同時(shí)靶向ST-神經(jīng)元前體樣以及ST-放射狀神經(jīng)膠質(zhì)樣程序?qū)е耉BT242細(xì)胞的存活顯著降低（圖5I）,，盡管帕博西尼可單獨(dú)作為主要抑制細(xì)胞增殖效應(yīng)的藥劑,。

總之，研究者的結(jié)果提示未分化的ST-RELA放射狀神經(jīng)膠質(zhì)樣腫瘤細(xì)胞向分化的增殖失活細(xì)胞的有限轉(zhuǎn)變可能構(gòu)成了EPN群組侵襲性的基礎(chǔ),。此外,，某種界定的轉(zhuǎn)錄圖譜具有診斷的價(jià)值，甚至能夠在前期臨床試驗(yàn)后定義分子脆弱性,。

圖5 ST-EPN亞群中存活和潛在的脆弱點(diǎn)

圖5 ST-EPN亞群中存活和潛在的脆弱點(diǎn),。（A-B）依據(jù)整體RNA表達(dá)數(shù)據(jù)，ST-室鼓膜樣元程序中前30個(gè)基因的表達(dá)水平對(duì)ST和ST-RELA腫瘤的整體生存期進(jìn)行分類,。log-rank檢驗(yàn)證實(shí)顯著性水平,；(C–E)餅圖展示通過(guò)整合ST-神經(jīng)元前體樣、ST-放射狀膠質(zhì)細(xì)胞以及ST-RELA變異的元程序與DGIdb分析,，得到的靶向治療候選基因,；(F) 在ST神經(jīng)元前體樣、ST放射狀膠質(zhì)瘤以及ST-RELA變異的元程序中DGIdb富集分析得到的GO條目,；(G) 在ST-EPN元程序中Log- FGFR3的轉(zhuǎn)化表達(dá),；(H) 使用siFGFR3或非靶向siRNA (siScr)轉(zhuǎn)染ST-EPN細(xì)胞模型VBT242 48 h和72 h后相對(duì)球形面積；(I) CellTiter-Glo實(shí)驗(yàn)證實(shí)帕博西尼和賽立替尼抑制劑聯(lián)合處理72h后VBT242細(xì)胞的存活,。

6 黏液乳頭型EPN是由室管膜樣細(xì)胞和代表PFNSC樣群體的未分化細(xì)胞構(gòu)成的

通過(guò)對(duì)顱內(nèi)EPN的分析,，研究者通過(guò)scRNA-seq分析了脊髓粘液乳頭狀EPN(SP-MPE)的樣本并且檢測(cè)了腫瘤細(xì)胞內(nèi)四組亞群（圖1A、6A,、6B）,。SP-室管膜樣細(xì)胞在參考數(shù)據(jù)組中與分化的室管膜細(xì)胞匹配，并且代表PF-室管膜樣以及ST-室管膜樣程序,。有趣的是,，未分化的SP-前體樣群體具有PENSC樣細(xì)胞的一些標(biāo)記物基因，提示這些腫瘤的起源是類似的細(xì)胞,。第三個(gè)命名為SP-免疫反應(yīng)的元程序有在免疫學(xué)過(guò)程中重要的基因(eg, HLA-DRA/DPA1/DRB1/DMA, CD74, CD14, B2M),，但是并未與發(fā)育的或者成熟的腦細(xì)胞可信的匹配。大多數(shù)SP-MPE腫瘤BT1678表達(dá)這一SP-免疫反應(yīng)程序,，SP-MPE腫瘤MUV068表現(xiàn)出高度的元程序多樣性,，并且表達(dá)未分化的SP-前體樣以及相當(dāng)分化的SP-室管膜樣特征,。第三個(gè)特征并未在BT1678中發(fā)現(xiàn)，成為SP-突變型（圖6C）,。

研究者進(jìn)一步確定改了之前報(bào)道的轉(zhuǎn)錄因子HOXB13的高表達(dá)特異的發(fā)生在SP-MPE中（圖6D）并且不依賴年齡（圖6E）,。研究接下來(lái)在MUV068的SP-MPE組織切片中進(jìn)行了RNA-ISH并且在所有腫瘤細(xì)胞中證實(shí)該標(biāo)記物的表達(dá)，而只有一個(gè)小亞群的細(xì)胞對(duì)于SP-前體樣標(biāo)記物JUNB以散點(diǎn)的方式呈陽(yáng)性染色（圖6F）,。重要的是,，在發(fā)育小鼠胚胎中對(duì)HOXB13表達(dá)的空間分析發(fā)現(xiàn)其表達(dá)局限于大部分脊髓尾部，SP-MPE的主要定位位置（圖6G）,。

總之,，SP-MPE簡(jiǎn)要概括了發(fā)育過(guò)程中在空間上受限于脊髓尾部，并且病人具有相同的轉(zhuǎn)錄程序而與年齡無(wú)關(guān),。

7 元程序?qū)Ρ冉沂玖薊PN的特異性以及泛神經(jīng)膠質(zhì)瘤的共有特征

接下來(lái)研究者評(píng)估了所有EPN組中轉(zhuǎn)錄程序的相似處和差異，研究者對(duì)Smart-seq2數(shù)據(jù)庫(kù)中所有4401個(gè)腫瘤細(xì)胞中腫瘤組特異的元程序(n = 23)進(jìn)行評(píng)分,，元程序表達(dá)分值之間的配對(duì)關(guān)聯(lián)發(fā)現(xiàn)元程序的五個(gè)集簇與所有EPN組高度相關(guān)并且相似（圖7A）,；細(xì)胞周期相關(guān)的程序（S和G2M期）在PF和ST樣本中也表現(xiàn)出高度的相似性。同樣,，在ST,、PF以及SP腫瘤中確定的室管膜樣程序也表現(xiàn)出配對(duì)的相關(guān)性（平均r = 0.92），提示在所有解剖位置室管膜樣細(xì)胞的分化程序,。在未分化的細(xì)胞群體,，在PF-和SP-EPN(r = 0.92)中確定了相似的前體樣群體，但是與ST-RELA或者STYAP腫瘤中干細(xì)胞樣群體不同,。重要的是,，在PF-A和ST-RELA樣本中發(fā)現(xiàn)的兩個(gè)神經(jīng)元-前體樣群體高度相關(guān)(r = 0.89)，提示在兩個(gè)次優(yōu)的EPN組中相關(guān)神經(jīng)元樣腫瘤細(xì)胞的軌跡,。在PF-A和ST-RELA中的代謝群體也高度相關(guān)(r=0.72),，提示在糖酵解和缺氧相關(guān)過(guò)程(LDHA, PGK1,HK2, PGAM1)中有活化的亞群存在?？傊?，研究者發(fā)現(xiàn)在PF-EPN和ST-EPN中未成熟的腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出有限的轉(zhuǎn)錄重疊,，說(shuō)明一個(gè)時(shí)空特異性的EPN干細(xì)胞生態(tài)位，盡管它們能夠提高相似分化的室管膜樣腫瘤細(xì)胞,。

由于之前報(bào)道的在小鼠模型中EPN促癌基因在晚期神經(jīng)膠質(zhì)樣腫瘤生成過(guò)程中的角色,，研究者進(jìn)一步利用人類腫瘤衍生的scRNA-seq數(shù)據(jù)將EPN的發(fā)育層次與其他晚期神經(jīng)膠質(zhì)進(jìn)行比較。研究者首先將所有EPN元程序與之前在彌漫性內(nèi)源性腦橋膠質(zhì)瘤(DIPG)和神經(jīng)膠質(zhì)瘤（GBM）等其他晚期神經(jīng)膠質(zhì)元程序相關(guān)聯(lián)（圖7B）,。研究者同樣在Smart-seq2數(shù)據(jù)庫(kù)中對(duì)這些元程序進(jìn)行了評(píng)分并且分析了不同腫瘤樣本中元程序的成對(duì)關(guān)聯(lián)（圖7B）,。有趣的是，研究者發(fā)現(xiàn)在EPN中神經(jīng)元前體樣程序與GBM中神經(jīng)元前體樣細(xì)胞程序之間高度相似,，提示在這些腫瘤類型中類似的異常神經(jīng)元譜系基因表達(dá)（圖7C,、7D）。此外,，在PF-EPN和ST-EPN中兩個(gè)代謝的程序與GBM中Mes-2程序高度相關(guān)（圖7E,、7F），提示缺氧相關(guān)的應(yīng)答可作為這兩種腫瘤的共有特征,。相反,，在PF-EPN中發(fā)現(xiàn)的未成熟的PF-NSC樣特征與GBM中NPC1（圖7G、7H）或者NPC2（圖7I,、7J）或者DIPG中的任意程序都具有很小的重合,，說(shuō)明了不同細(xì)胞的起源。此外,，在EPN中發(fā)現(xiàn)的室管膜樣程序并不代表GBM中任意成熟的程序,，說(shuō)明這一程序可作為EPN特異的轉(zhuǎn)錄特征。相反,，在EPN中發(fā)現(xiàn)的中間物語(yǔ)PF-A室管膜樣程序與DIPG和GBM中的兩個(gè)星形膠質(zhì)細(xì)胞樣程序高度相關(guān),。

總之，這些數(shù)據(jù)說(shuō)明在所有分子群以及與其他晚期神經(jīng)膠質(zhì)相比較EPN特征,，轉(zhuǎn)錄程序部分相同,，同時(shí)也提示在人類CNS發(fā)育過(guò)程中不同細(xì)胞的起源或者不同時(shí)空時(shí)間點(diǎn)將會(huì)導(dǎo)致晚期神經(jīng)膠質(zhì)的不同層次。

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