編譯：小北,，編輯：夏甘草、江舜堯,。

原創(chuàng)微文,，歡迎轉發(fā)轉載。導讀

宮頸癌是影響撒哈拉以南亞洲女性最常見的癌癥并且在HIV陽性的個體中盛行,。目前為止對這一腫瘤基因組,、轉錄組以及表觀遺傳組學的綜合圖譜尚未進行。研究者對烏干達病人中118個腫瘤進行描述,，其中72例HIV陽性,，在另外89例腫瘤中進行了突變分析。研究者檢測了腫瘤DNA甲基化,、啟動子和增強子相關組蛋白標記,，基因表達以及信號通路異常調節(jié)中HPV分化枝特異的差異。在HPV集成事件中組蛋白修飾的改變與鄰近基因和內源性逆轉錄病毒的上調相關,。

論文ID

原名：Analysis of Ugandan cervical carcinomas identifies human papillomavirus clade–specific epigenome and transcriptome landscapes

譯名：烏干達宮頸癌分析確定人乳頭瘤病毒分支-特異表觀基因組和轉錄組

期刊：Nature genetics

影響因子：27.603

發(fā)表時間：2020年8月

作者：Marco A. Marra

單位：加拿大的 Michael Smith 基因組科學中心

DOI：10.1038/s41588-020-0673-7.

前言

持續(xù)的HPV感染,，以無鞘型還是整合型的形式都是宮頸癌發(fā)展的必要不充分條件。至少70%受影響的個體中檢測到HPV-16和HPV-18,。HPV-16 (分支A9)在鱗狀細胞癌以及腺癌中常見,，而HPV-18（分支A7）與腺癌和生存期低下相關。

預防宮頸癌的策略包括疫苗接種,、HPV篩查以及晚期癌癥癌前治療,。盡管有效，疫苗的應用在HIV盛行的低等或者中等收入的國家仍然很低,。資源限制同樣使篩選,、手術以及放療復雜化，以致于預測到2040年宮頸癌的死亡率增加50%,。

對宮頸癌基因組的研究主要在非亞洲個體中進行,，確定了APOBEC突變的特征，CD274 (PD-L1)以及PDCD1LG2 (PD-L2)拷貝數(shù)的擴增,，影響PI(3)K–MAPK和TGFβR2信號通路的體細胞突變以及染色質修飾基因的突變,。對HPV感染且患有頭頸癌的個體研究將HPV融合與組蛋白修飾以及DNA甲基化的改變相聯(lián)系，提示在宮頸癌中相似的發(fā)現(xiàn),。

作為國際癌癥組織HIV陽性腫瘤分子特征描述項目(HTMCP)的一部分,，研究者對烏干達病人宮頸癌的基因組,、轉錄組以及表觀遺傳圖譜進行描述。研究者確定了不同HPV分支感染個體中宮頸癌表觀遺傳學和轉錄組學之前未描述的差異,，并且說明這些分支與預后相關,。

結果病人樣本和臨床數(shù)據(jù)

研究者研究的212例宮頸癌患者在坎帕拉烏干達癌癥學院接受治療。其中118例構成了研究者的發(fā)現(xiàn)隊列,，89例構成了擴展隊列,。HIV陽性的患者(72/118, 61%)比HIV陰性的患者平均年輕10歲。

HIV陽性和HIV陰性的宮頸癌基因組的改變

對發(fā)現(xiàn)隊列中樣本進行全基因組測序確定了平均每個樣本中22942個體細胞突變（從3033-179513變化）,，包括311個編碼突變（從30到2683變化）（圖1a）,。研究者檢測了APOBEC突變體特征2和13，證實之前的報道并且與對病毒感染的細胞內應答驅動的突變過程一致（圖1a）,。具有高比例APOBEC特征突變的腫瘤（比例≥ 0.4）表現(xiàn)出更多的編碼突變,。15個樣本(13%)從中度到高度同源重組缺失的分值（HRD>30），提示HR損傷信號通路的異常功能（圖1a）在HIV陽性和HIV陰性樣本中對突變體負荷,、突變體特征或者HRD分值之間沒有差異,。

在研究隊列12個顯著突變的基因(SMGs) 中PIK3CA是最常見的（圖1a），正如其他研究報道的一樣,。HIV陰性的腫瘤中具有更高比例的PIK3CA突變體,，并且PIK3CA的表達高于1.3倍,。其他SMGs包括FAT1, KMT2D, FBXW7, CASP8, MAPK1, ZNF750之前在宮頸癌中均有報道,。值得注意的是，87%的隊列中在一個染色質修飾基因上至少有一個突變體,。

研究者對擴展隊列中2735個特異基因進行靶向測序,，證實12個SMGs中有11個突變體并且在發(fā)現(xiàn)隊列和擴展隊列之間發(fā)現(xiàn)相似的突變頻率。

對拷貝數(shù)圖譜分析發(fā)現(xiàn)HIV陽性和HIV陰性的樣本中具有大量可比較的拷貝數(shù)突變體,，在1,8,20號染色體3q, 5p,19q上擴增,，在11號染色體3p, 4p, 19p,21p上缺失（圖1b）。研究者發(fā)現(xiàn)HIV陽性的樣本中有6個特異性的擴增和4個特異性的缺失,，而在HIV陰性的樣本中有兩個特異性的擴增（圖1b）,。HIV陽性的樣本具有更多特異的病灶的擴增和缺失（圖1c）。

研究者比較了HIV陰性樣本中的拷貝數(shù)圖譜與TCGA宮頸癌中的樣本,。TCGA樣本表現(xiàn)出更多數(shù)量顯著缺失的區(qū)域,，影響了11條染色體，然而在研究者的隊列中僅21p是缺失的,。通過與TCGA比較,，研究者的HIV陰性隊列在染色體3p, 8p,15q上具有三個顯著擴增的區(qū)域（圖1b）。在TCGA隊列中確定的5個病灶擴增和9個缺失同樣在研究者HIV陰性的隊列中檢測到（圖1c）,。對TCGA或者HIV陰性樣本特異的病灶缺失在數(shù)量上是可比較的,，并且多于病灶擴增,。11q22.1和11q22.2，包含YAP1,，在HIV陽性,、HIV陰性以及TCGA樣本中是擴增的。12個SMGs中有6個受拷貝數(shù)突變的影響,，其中PIK3CA是突變頻率最高的基因,，通過突變體或者拷貝數(shù)改變（圖1a）。

圖1 烏干達宮頸癌突變圖譜

頻發(fā)的非編碼突變體

研究者通過全基因組測序確定了7個高度可信的非編碼“熱點”（圖2a）,，包括最初在黑色素瘤中描述的TERT啟動子中的兩個,，占研究者發(fā)現(xiàn)隊列樣本的11% (13/118)。TERT轉錄本的水平在所有樣本中并未受到異常調節(jié),。在9% (11/118)的樣本中觀察到ADGRG6內含增強子中的兩個熱點,。這些非編碼的突變體，chr6:142706206(G>A)以及chr6:142706209(C>T),，坐落在回文序列預測將形成發(fā)卡環(huán)路,，有利于APOBEC酶的進入（圖2b）。據(jù)報道這些熱點大約在乳腺癌中占3%,，在膀胱癌中占46%,，并且與ADGRG6蛋白表達升高以及血管生成相關。在突變的樣本中研究者并未觀察到ADGRG6 mRNA表達的異常,。在6,8,11號染色體上三個其他的熱點并不與啟動子或者增強子相關,。在HIV陽性和HIV陰性的樣本中所有報道的熱點以及具有突變體的樣本(C>T或者C>G)具有中等APOBEC特征的突變體比例（圖2a）。因為TERT啟動子突變體能夠產生c-ETS轉錄因子新的結合位點,，研究者探究了其他非編碼熱點改變轉錄因子結合位點的潛能（圖2c）,，并且說明七個熱點中有五個，POU和FOX家族結合位點由突變體產生或者破壞,。

圖2 頻發(fā)的非編碼突變

HPV類型的分布

全基因組測序檢測了17種HPV類型以及在研究者的隊列中相關的分支,。高危HPV-16 (分支A9), HPV-18以及HPV-45 (分支A7)是最廣泛的類型（圖3a），并且分支A7在研究者的隊列中比TCGA隊列特別是鱗細胞癌中更加普遍（圖3b）,。與之前的報道不同的是,，在HIV陽性和HIV陰性中并未發(fā)現(xiàn)HPV類型的差異。

表達量,、甲基化圖譜以及HPV分支

研究者通過對突變表達最高的基因(n = 1,000)以及突變甲基化最高的探針(n = 8,000; 850k EPIC)分別進行無差別的聚類繪制表達和DNA甲基化圖譜,，并且與基因的特征相關聯(lián)。研究者確定了三個基因表達集簇,，在腺癌(q = 4.1 × 10?8; 集簇1),、無角化的SCCs（集簇3）以及角化的SCCs（q = 0.015;集簇2）中富集，與之前的報道相似,。此外,，集簇1在分支A7 HPV樣本中富集(q = 1.3 × 10?9),，集簇3在PIK3CA突變的樣本中富集(q = 3.1 × 10?5)。兩個DNA甲基化集簇（圖3c）證實了從分支A7 HPV鱗狀或者非鱗狀癌癥(集簇2; q = 1.7 × 10?13)中分離分支A9 HPV的SCCs（集簇1）,。集簇2在晚期腫瘤樣本中富集(q = 0.020),。

研究者通過甲基化差異分析比較了分支A7感染的樣本與分支A9感染的樣本，確定了107685個差異的甲基化探針(DMPs),，包括分支A9 HPV腫瘤中46,639 DMPs以及分支A7 HPV腫瘤中61,646 DMPs (FDR < 0.05),。DMPs基因特征以及鄰近CPG島的分布因分支不同。在游離或者支架CpGs上的DMPs分支A7是最常見的,，并且大都在內含子區(qū)域,。在CPG島上的DMPs最常見的是分支A9，并且這些大部分坐落在轉錄調節(jié)區(qū)域,。

在分支間DMP分布的差異是明確的,，研究者在解釋了組織差異后檢測了721個差異表達的基因，在每個分支中基因上調的比例大約相同(A7, n = 363; A9, n = 358),。功能富集分析（圖3d）發(fā)現(xiàn)本體的富集與分支A9 HPV的角化以及上皮分化相關,。在這些樣本中表達升高的基因包括角蛋白家族基因以及AMTN, LCE3D,BCL2L10。緊密調節(jié)的角化分化信號通路在HPV感染中被利用,，產生活化的病毒以及宮頸上皮細胞中不受控制的細胞生長,。分支A7 HPV樣本中PROM1, TGFB2, PXDN以及FN1的表達升高并且差異表達的基因在細胞外基質組織、細胞粘著和侵襲相關的信號通路中富集,，這與侵襲性腫瘤等級與分支A7相關是一致的（圖3c）,。

為了將啟動子區(qū)域DNA甲基化的效應與基因表達改變相聯(lián)系，研究者確定了甲基化差異的區(qū)域,，由附近的探針顯示出一致的甲基化變化定義,，并且這些區(qū)域與基因表達相關,。與分支A9 HPV中CPG島DMPs的數(shù)量更高一致,，研究者在這些樣本中確定了558個甲基化的DMRs，在分支A7 HPV樣本中有53個甲基化的DMRs,。在A7 HPV樣本中26個上調的基因與A9 HPV樣本中甲基化的DMR相關,，而在A9分支 HPV樣本中只有8個上調的基因與A7 HPV樣本中的1個甲基化DMR相關。因此在分支間差異基因的表達可能是由于甲基化的差異導致的,。

圖3 HPV分支特異的分子特征和診斷

HPV病毒基因表達影響宿主基因表達

HPV病毒基因調節(jié)上皮細胞的分化并且促進腫瘤發(fā)生,，為了探究病毒基因表達對腫瘤基因表達的影響，研究者對病毒E1, E2, E6以及E7的轉錄本進行無差別的聚類,，所有HPV類型在GenBank中進行相關注釋,，研究者確定了三個集簇。集簇1在分支A9 HPV腫瘤中富集(q = 0.0029),，具有較高的E2和較低的E6表達,，提示顯著的HPV外泌體轉錄,。集簇2，在分支A7 HPV腫瘤中富集(q = 0.0029),，具有較低的E2和較高的E1表達,。集簇3包含兩種分支的HPV腫瘤并且E1和E2的表達水平都很低。由于缺乏E2表達,，研究者推斷集簇2和3反映了病毒的表達起源于HPV的整合形式,。E6和E7的表達分布是雙向的并且研究者利用差異表達分析將其應用于將樣本分離為高表達的和低表達的腫瘤。研究者在高表達和低表達E6的腫瘤間確定了107個差異表達的基因,，并且在高表達和低表達E7的腫瘤間確定了60個差異表達的基因,。高表達E6組中的基因與分支A7富集的信號通路重合，而低表達E7組中的基因與分支A9富集的信號通路重合,。因此,，分支富集的腫瘤基因表達圖譜可能受HPV基因表達的影響。

HPV分支與預后相關

與研究者的觀察一致分支A7 HPV腫瘤的表達圖譜提示一個更加侵襲性的表型（圖3c,、d）,，這些腫瘤也在臨床上提示更加具有侵襲性，與A9感染的病人相比A7感染的病人預后更差,。這一觀察在研究者隊列的其他協(xié)變量研究后仍然是真實的,，包括HIV的狀態(tài)（圖3f）。階段以及組織學,。盡管可用于分析的病人數(shù)量很小,，HPV分支對整個生存期的影響與疾病階段相似(HR = 2.10, P = 0.19)，后者已經成為一個診斷的因素,。相似的結果在之前也有報道,。

與HPV分支相關的組蛋白圖譜

受DNA甲基化結果（圖3c）以及染色質修飾基因上體細胞突變的刺激，研究者探究了組蛋白修飾是否也表現(xiàn)出分支特異性的差異,。通過ChIP-seq實驗,，研究者對52個樣本中轉錄活化的四個組蛋白修飾標記物(H3K4me1, H3K4me3, H3K27ac,H3K36me3)以及轉錄抑制相關的兩個標記物(H3K9me3，H3K27me3)進行圖譜繪制,。對這些標記物進行聚類分析確定了代表啟動子和增強子相關標記物H3K4me1, H3K4me3,，H3K27ac的聚類方法。因此研究者利用這三個活化的標記物再次進行了分析確定了四個集簇（圖4a）,。集簇1在分支A9 HPV腫瘤中富集(q = 4.9 × 10?5),，而集簇2包括相同數(shù)量分支A7 HPV和分支A9 HPV腫瘤。剩余的分支A7 HPV腫瘤在集簇3和4中發(fā)現(xiàn),，并且在非SCC腫瘤中富集,。沒有集簇在染色質修飾復合體的基因編碼成員體細胞突變中富集，而集簇4在SEC, NuRD, HDAC，ISWI復合體成員中沒有突變（圖4a）,。

觀察到HPV分支特異性的差異,，研究者評估了分支是否與調節(jié)區(qū)域組蛋白標記物不同的豐度相關，包括活化的啟動子(H3K27ac,，H3K4me3)以及增強子(H3K4me1),。研究者在組織學差異校正后確定了分支間15,245個H3K4me1峰值、9,902個H3K27ac峰值以及7,736個H3K4me3峰值（圖4b）,。

分支A7感染的樣本具有三倍多的H3K4me1富集的區(qū)域(11,530個分支A7 vs 3,715個A9分支),，以及大約兩倍數(shù)目的H3K27ac富集的區(qū)域(6,405個分支A7 vs 3,497個分支A9)，提示增強子的富集,。相反,，在分支A9 HPV腫瘤中幾乎兩倍數(shù)目的H3K4me3差異峰值(4,997個分支A9 vs 2,739個分支A7)，以及1/4的與H3K27ac富集的區(qū)域重合,，提示分支A9 HPV在腫瘤啟動子區(qū)域的富集（圖4b）,。

在研究者的研究隊列中有兩個最常見的染色質修飾基因突變，KMT2C和KMT2D,，在增強子區(qū)域沉積H3K4me1,。研究者因此探究了KMT2C和KMT2D功能缺失突變對H3K4me1標記區(qū)域數(shù)量上的影響。研究者觀察了KMT2C或者KMT2D功能缺失突變的15個樣本,，待發(fā)增強子區(qū)域的數(shù)目低于染色質修飾基因沒有突變體的腫瘤或者在其他染色質修飾基因上有突變,，而在活化增強子區(qū)域(由H3K4me1和H3K27ac標記)的數(shù)目沒有差別（圖4c）。盡管在HPV分支間不同的峰富集（圖4b）,，KMT2C和KMT2D突變體對待發(fā)增強子的影響并不是分支特異的,。

為了將染色質標記物圖譜與差異表達聯(lián)系，研究者繪制了鄰近基因區(qū)域差異的H3K27ac和H3K4me3的峰值圖,。在差異H3K27ac和H3K4me3峰富集的分支A7 HPV樣本中確定了769個區(qū)域,，其中18個靠近基因TSS的區(qū)域在分支A7 HPV樣本中上調，包括侵襲和細胞外基質基因SRCRB4D,、PXDN以及CXCL2（圖4d）,。研究者也在分支A9 HPV樣本中差異的H3K27ac和H3K4me3峰中確定了1271個區(qū)域，其中25個靠近基因TSS的區(qū)域上調（圖4d）,，包括TMPRSS11A, WNT2B,，MEI1,。研究者同樣在H3K4me1標記的差異區(qū)域和最靠近基因的表達之間觀察到了分支特異性的相關性（圖4e）,。在圖4f中展示了分支之間組蛋白修飾和基因表達差異之間的關系，例如PXDN 和TMPRSS11A,。

研究者的結果提示DNA甲基化（圖3c）和H3K27ac, H3K4me3,，H3K4me1的表觀修飾圖譜以HPV分支特異性的方式改變。

圖4 HPV分支特異的組蛋白標記物圖譜

在HPV整合位點改變的RNA和組蛋白圖譜

研究者研究了118例腫瘤的109例中1010個特異的HPV整合位點的基因組。在樣本中鄰近整合位點分組確定了257個整合事件,。分支A7整合事件包含更多的整合位點,。

在這些事件中155 (60%)在一個或者更多基因的10kb之內。如之前的報道一樣,，在16個基因中KLF12, TP63, RAD51B,，MYC在多個樣本中最靠近整合位點（圖5a）?？拷鲜录幕蛴?1例的表達顯著更高,。此外包含更多整合位點的事件與表達的倍數(shù)升高相關（圖5b）。分支A7整合事件比分支A9事件對表達具有更廣泛的影響（圖5c）,，可能是分支中每個事件整合位點的數(shù)目導致的,。在靠近整合事件的多個樣本中確定了16個基因（圖5a），其中8個在整合的樣本中顯著上調,，包括促癌基因ERBB2和TP63,。

為了探究在HPV整合事件中基因表達改變可能的表觀遺傳學機制，研究者檢測了整合事件中組蛋白標記物富集的倍數(shù),。H3K27ac, H3K4me3,H3K4me1,，H3K36me3組蛋白標記富集倍數(shù)的改變與基因表達改變正相關（圖5d）。在研究者無差別的聚類分析中,，研究者注意到經典的與轉錄相關的H3K36me3升高與整合事件中局部轉錄的異常調節(jié)相關,。KLF12的3’端區(qū)域提供了一個直觀的例證。說明了一個HPV整合事件中改變的組蛋白修飾和基因表達升高存在聯(lián)系,。

對靠近整合事件組蛋白修飾的倍數(shù)進行無差別的聚類確定了組蛋白標記富集變化的三個集簇（圖5f）,。集簇3包含H3K27ac, H3K36me3, H3K4me3，H3K4me1覆蓋率升高的12個事件,。其中7個事件抑制的修飾H3K9me3和H3K27me3顯著富集,。集簇2與集簇3相比包含所有活化組蛋白修飾富集更低的49個事件，而集簇1包含的事件在所有活化的組蛋白修飾中并沒有富集,。每個事件上HPV整合位點的平均數(shù)目在三個集簇中顯著不同,，而集簇3具有最高的數(shù)目。與研究者的觀察一致,，更高數(shù)目的HPV整合事件與鄰近基因的表達升高相關（圖5b）,，盡管集簇3與表達升高最大的基因相關（圖5h）。與沒有抑制標記富集的事件相比,，富集活化和抑制修飾的事件損傷了鄰近基因的上調（圖5h）,。

可利用ChIP數(shù)據(jù)的樣本中32例(32/99)整合事件并不在蛋白編碼基因的10kb之內，但是與鄰近組蛋白修飾圖譜的改變相關（集簇2和3）,。研究者因此探究了這些事件中受影響的其他基因組特征,，確定了靠近114/257事件(44%)內源腺病毒的序列(ERVs),。ERVs在人類基因組中表觀沉默，并且它們的再次活化與抗病毒信號通路的產生相關,，例如dsRNA應答信號通路,。研究者對鄰近整合事件ERVs的表達進行分析，并且在整合的樣本中發(fā)現(xiàn)表達水平顯著更高,，并且與HPV插入數(shù)目正相關（圖5i）,。和基因一樣，鄰近整合事件中ERVs的上調與組蛋白修飾的改變相關,。

圖5 HPV整合改變了局部組蛋白修飾和表達

為了探究腫瘤微環(huán)境并且確定ERV表達的升高與免疫細胞升高是否相關,，研究者利用RNA-seq對免疫細胞表達的分值進行推斷。在整合事件中ERVs上調的樣本具有更高的T細胞分值,。但是由于這些樣本中腫瘤內含物低于估計值,，并且研究樣本中腫瘤內含物和整體的免疫分值之間的緊密關聯(lián)，研究者并不能評估ERV上調和免疫豐度之間的關聯(lián),。研究者也檢測了參與ERV識別信號通路中基因的表達,，包括類型I干擾素信號通路(GO:0060337)以及dsRNA識別的信號通路(GO:0043330)，但是研究者并未發(fā)現(xiàn)ERV整合事件中基因的表達升高或者通過點突變,、這些基因的缺失或者甲基化導致的免疫逃逸,。

由于HIV感染靶向CD4+ T細胞，研究者比較了HIV陽性和HIV陰性患者的CD4+T細胞分值,。在HIV陽性樣本中整體的CD4+T細胞分值低于HIV陰性的樣本,，特別是小囊的輔助型T細胞的分值，與HIV感染主要影響這些細胞一致,。免疫分值僅在HIV陽性的樣本中發(fā)現(xiàn)更高的是嗜中性白細胞,，其在生殖道粘膜環(huán)境中的作用尚不清楚。

這些結果提示在腫瘤基因組中HPV整合位點與局部組蛋白修飾的改變相關,，組蛋白修飾的改變與基因和ERVs的表達改變相關,，包括已知的促癌基因ERBB2，可能促進腫瘤的進展,。

結論

研究者對烏干達病人宮頸癌的基因組,、轉錄組以及表觀遺傳圖譜進行描述。研究者確定了不同HPV分支感染個體中宮頸癌表觀遺傳學和轉錄組學之前未描述的差異,，并且說明這些分支與預后相關,。組蛋白修飾的改變與基因和ERVs的表達改變相關，包括已知的促癌基因ERBB2,，可能促進腫瘤的進展,。

更多推薦

1  高分綜述 | Trends in Biotechnology: 單細胞分辨率下利用空間轉錄組揭示器官分子結構（國人佳作）2 重磅綜述 | Cell：非編碼RNAs在腫瘤學中的作用（IF=36.216）