【原】科研 | Front Plant Sci：借助轉(zhuǎn)錄組研究海棠中調(diào)控原花青素合成的兩個(gè)乙烯應(yīng)答因子（國(guó)人作品）

轉(zhuǎn)錄組 2021-04-20

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編譯：Yong-qin，編輯：十九,、江舜堯,。

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導(dǎo)讀

黃酮類化合物是植物體內(nèi)重要的多酚類化合物,，可分為三類：花青素、原花青素（PAs）,、黃酮醇,。原花青素，又稱縮合單寧,，是由兒茶酸和表兒茶酸合成,。原花青素參與了植物對(duì)紫外光輻射的防護(hù)和對(duì)病原菌及害蟲的防衛(wèi)，同時(shí)具有抗氧化活性,，對(duì)人體健康頗有益處,。

無色花青素還原酶（LAR）和花青素還原酶（ANR）通過多步酶促反應(yīng)來合成原花青素,，屬于核心類黃酮途徑，在許多植物中有過研究,。在蘋果中,，LAR和ANR的轉(zhuǎn)錄水平分別與兒茶酸和表兒茶酸的含量相關(guān)，說明在原花青素合成中發(fā)揮作用,。海棠中發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)LAR基因和兩個(gè)ANR基因,，這四個(gè)基因的過表達(dá)會(huì)增加植物原花青素含量。研究表明參與類黃酮合成的基因受R2R3-MYB,、bHLH,、WD家族轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控。在蘋果中,，花青素合成通路由MdMYB1,、MdMYB10、MdMYBA調(diào)控,，低溫誘導(dǎo)的MdbHLH3表達(dá)可與MdMYB1互作,，促進(jìn)花青素生物合成。這些相似的結(jié)論也在擬南芥,、苜蓿,、草莓中研究。此外,，MdMYB9和MdMYB11基因可與MdbHLH3結(jié)合,，作用于MdANS、MdANR,、MdLAR啟動(dòng)子,。在海棠中，McMYB12a和McMYB12b通過與原花青素生物合成基因的啟動(dòng)子結(jié)合,，調(diào)控其合成,。

越來越多的研究證明，存在其他調(diào)控基因影響原花青素的生物合成,。例如,，蘋果中的一個(gè)BTB結(jié)構(gòu)域蛋白（MdBT2）在原花青素合成中起負(fù)調(diào)控作用，MdBT2與MdMYB9結(jié)合,，通過26S蛋白酶系統(tǒng)負(fù)調(diào)控MdMYB9蛋白的含量,。同時(shí)，乙烯響應(yīng)因子MdERF1B已被證明與MdMYB1,、MdMYB9,、MdMYB11結(jié)合，調(diào)節(jié)原花青素合成,。因此,，推測(cè)海棠中原花青素的生物合成可能涉及不同的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控。

海棠果實(shí)含豐富的花青素,、黃酮醇,、PAs，有利于研究PAs生物合成的分子機(jī)制,。本研究利用RNA-seq分析不同發(fā)育階段的海棠果實(shí),，找出原花青素合成的調(diào)控因子及共表達(dá)基因；利用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和酵母雜交驗(yàn)證基因的功能,。

論文ID

原名：Transcriptome Analysis Identifies Two Ethylene Response Factors That Regulate Proanthocyanidin Biosynthesis During Malus Crabapple Fruit Development

譯名：海棠中調(diào)控原花青素合成的兩個(gè)乙烯應(yīng)答因子

期刊：Frontiers in Plant Science

IF：4.106

發(fā)表時(shí)間：2020.02

通訊作者：姚允聰

通訊作者單位：北京農(nóng)學(xué)院植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院

DOI號(hào)：10.3389/fpls.2020.00076

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

① 植物材料,。火焰海棠（Malus 'Flame’），采集5個(gè)發(fā)育階段的果實(shí)液氮凍存,。

② 生化測(cè)定,。0.8-1.0 g冷凍樣品進(jìn)行HPLC分析，520 nm處檢測(cè)花青素含量,，280 nm處檢測(cè)原花青素含量,。同時(shí)，利用二甲基乙酰胺二甲基縮醛（DMACA）染色法測(cè)定葉片的原花青素含量,。

③ RNA-seq,。3 μg RNA進(jìn)行150 – 200 bp cDNA建庫測(cè)序。Bowtie2和TopHat進(jìn)行參考序列比對(duì),，HTSeq計(jì)算基因表達(dá)水平,，DESeq篩選差異表達(dá)基因。Blast2GO和KOBAS進(jìn)行富集分析,，WGCNA進(jìn)行共表達(dá)分析,。

③ 互作分析。根據(jù)篩選得到的兩個(gè)乙烯應(yīng)答因子構(gòu)建載體,，采用農(nóng)桿菌滲透法在海棠植株中瞬時(shí)表達(dá)分析,。酵母單雜交判斷兩個(gè)乙烯應(yīng)答因子與原花青素生物合成相關(guān)的調(diào)控因子的相互作用。

結(jié)果

1,、不同發(fā)育階段的代謝差異和轉(zhuǎn)錄組差異

本研究比較了五個(gè)發(fā)育階段的海棠果實(shí)（圖1A）,，HPLC分析表明總原花青素B1/B2含量在發(fā)育中逐漸減少，而花青素僅在發(fā)育最后階段被檢測(cè)到（圖1B）,。RNA-seq表明黃酮類生物合成基因CHS,、CHI、F3H等具差異表達(dá)特性,，原花青素生物合成基因LAR,、ANR隨果實(shí)發(fā)育表達(dá)呈下調(diào)趨勢(shì)（圖1C）。

五個(gè)發(fā)育階段的差異表達(dá)基因數(shù)目如圖2A所示,，多數(shù)基因與苯丙氨酸代謝,、苯丙素生物合成,、類黃酮生物合成、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)（圖2B）,。其中的植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)基因包括生長(zhǎng)素應(yīng)答因子,、乙烯應(yīng)答因子等（圖2C），ERS（乙烯反應(yīng)傳感因子）和ERF（乙烯響應(yīng)因子）在果實(shí)發(fā)育后期表達(dá)顯著上調(diào),。

圖1 海棠果實(shí)的五個(gè)發(fā)育階段（A）,，原花青素含量差異（B）及相關(guān)基因的表達(dá)差異（C）。

圖2 海棠果實(shí)不同發(fā)育階段的差異表達(dá)基因富集分析,。

2,、基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析

對(duì)9471個(gè)差異表達(dá)基因進(jìn)行共表達(dá)分析，得到17個(gè)表達(dá)模式（圖3A）,，其中MElightcyan模式與原花青素B2的代謝模式高度相關(guān),，包含4297個(gè)基因，137個(gè)與植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān),，296個(gè)與轉(zhuǎn)錄相關(guān)（圖3B）,。轉(zhuǎn)錄相關(guān)的基因多為MYB、bHLH,、ERF,、ARF家族（圖3B）。通過調(diào)控網(wǎng)絡(luò)鑒定了較為重要的12個(gè)轉(zhuǎn)錄因子做進(jìn)一步研究,，均為MYB,、bHLH、ERF家族（圖3C）,。這些基因?yàn)橐蚁?yīng)答因子（ERF105,、ERF023、RAP2-4,、ERF1A,、ERF5、RAV1,、DREB1A、DREB1D,、ERF1E、ERF061）,，MYB44,，bHLH13（圖4A）,。RT-qPCR證明這12個(gè)基因在果實(shí)發(fā)育過程中表達(dá)下調(diào),，與RNA-seq結(jié)果相同（圖4B和C）,。

圖3 共表達(dá)分析選出與原花青素代謝有高度相似表達(dá)模式的基因（A）,，進(jìn)行富集分析（B）,，挑選重要轉(zhuǎn)錄因子基因（C）,。

圖4 12個(gè)原花青素相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)模式（A），及其RT-qPCR驗(yàn)證（B and C）,。

3,、乙烯應(yīng)答因子RAP2-4和RAV1的功能分析

本研究中RAP2-4和RAV1與原花青素的代謝相關(guān)性最大,。構(gòu)建這兩個(gè)基因的克隆載體,，在植物中過表達(dá)，利用DMACA染色體現(xiàn)原花青素含量,。結(jié)果表明,，RAP2-4過表達(dá)可提高葉片原花青素含量,，而RAV1相反（圖5A和B）。qPCR表明，RAP2-4促進(jìn)McLAR1和McANR1的表達(dá),，而RAV1抑制McANR2的表達(dá)（圖5C）,。同時(shí)，在果實(shí)中過表達(dá)RAP2-4也導(dǎo)致原花青素積累（染色呈深藍(lán)色），而RAV1相反（圖5D和E）,。qPCR表明RAP2-4促進(jìn)McLAR1表達(dá),，而RAV1抑制McLAR2和McANR2表達(dá)（圖5F）,。綜上，RAP2-4激活原花青素生物合成,，而RAV1起抑制作用,。酵母雜交分析表明,，RAP2-4余McLAR1啟動(dòng)子結(jié)合,，而RAV1與McANR2的啟動(dòng)子結(jié)合（圖6）。

圖5 RAP2-4和RAV1過表達(dá)在對(duì)植物原花青素合成的影響,。

圖6 酵母單雜交驗(yàn)證RAP2-4和RAV1與原花青素合成調(diào)控基因的互作,。

討論

PAs在許多植物組織尤其是果實(shí)中大量存在，在生理和發(fā)育上起重要作用。PAs是類黃酮途徑的主要產(chǎn)物,，對(duì)人體健康有許多益處,。海棠果實(shí)中含有豐富的PAs化合物,，是研究PAs生物合成的分子機(jī)制的有價(jià)值的模式植物,。本研究通過HPLC分析發(fā)現(xiàn)海棠果實(shí)發(fā)育過程中，PAs在幼果中大量存在,，與先前在香蕉果實(shí)中的研究相似,，先前研究發(fā)現(xiàn)MaANR和MaLAR基因的表達(dá)水平與幼果PAs的積累有關(guān)。因此作者利用RNA-seq分析PAs在果實(shí)發(fā)育過程中生物合成的分子機(jī)制,。

據(jù)研究報(bào)道,，脫落酸、乙烯和茉莉酸促進(jìn)植物花青素的合成,，促進(jìn)果實(shí)成熟,，而生長(zhǎng)素和赤霉素抑制花青素的合成,，延緩果實(shí)成熟。此外,，研究表明脫落酸信號(hào)促進(jìn)了早期陸生植物的黃酮醇的生物合成（尤其是槲皮素衍生物）,，這些結(jié)果表明植物激素在果實(shí)發(fā)育和成熟過程中起重要作用，本研究同樣發(fā)現(xiàn)了許多植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的基因在海棠果實(shí)中的差異表達(dá),。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)生長(zhǎng)素和乙烯信號(hào)參與了PAs的生物合成調(diào)控,，其中包括乙烯響應(yīng)因子（ERF轉(zhuǎn)錄因子）。與原花青素B2代謝相關(guān)性最高的基因表達(dá)模式表明,，MYBs,、bHLHs、ARFs家族轉(zhuǎn)錄因子可能參與了PAs的代謝,，證明PAs的生物合成受多種轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控,。其中，MYB和bHLH轉(zhuǎn)錄因子是目前研究最全面的基因,，在擬南芥,、草莓、葡萄,、柿子,、蘋果中廣泛研究。海棠中MdARF13與MdMYB10可結(jié)合作用于MdDFR啟動(dòng)子,，促進(jìn)花青素生物合成,，而MdERF1B則作用于MdMYB9和MdMYB11。本研究認(rèn)同MYB,、bHLH,、ERF家族基因在海棠PAs生物合成調(diào)控中起重要作用，并通過共表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)選擇了12個(gè)重要基因進(jìn)行后續(xù)研究,。

乙烯是躍變型果實(shí)的主要促進(jìn)成熟的激素,，也參與調(diào)控類黃酮的生物合成。在葡萄果實(shí)中,，外源乙烯的處理可誘導(dǎo)CHS,、F3H、LDOX,、UFGT基因的表達(dá)從而促進(jìn)花青素的生物合成,。蘋果果實(shí)中，果實(shí)成熟的外源乙烯處理增加了果實(shí)內(nèi)花青素含量,，提高了相關(guān)酶的活性,。然而，乙烯對(duì)果實(shí)成熟過程中的原花青素的積累是否有調(diào)控作用仍不清楚,，具體的調(diào)控機(jī)制未有研究,。

綜上,，原花青素的代謝受到許多轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，研究較多的為MYB和bHLH基因家族,，而本研究發(fā)現(xiàn)了除此之外的10個(gè)重要乙烯應(yīng)答因子,，并選擇RAP2-4和RAV1做進(jìn)一步研究。結(jié)論表明,，這兩個(gè)乙烯應(yīng)答因子通過與原花青素調(diào)控基因的啟動(dòng)子結(jié)合,，調(diào)控原花青素的積累和代謝。該結(jié)論表明乙烯應(yīng)答因子對(duì)原花青素的生物合成起調(diào)控作用,。

評(píng)論

該研究發(fā)現(xiàn)了植物原花青素代謝相關(guān)的10個(gè)乙烯應(yīng)答基因,，并證明了其中兩個(gè)基因RAP2-4和RAV1的調(diào)控作用，RAP2-4起正調(diào)控作用,，而RAV1則抑制原花青素的表達(dá),，促進(jìn)了乙烯對(duì)原花青素的調(diào)控機(jī)制研究。