研究lncRNA/circRNA/miRNA的功能，做KO/KD/過表達(dá),，看到了表型,。然后呢？如何給我的研究拔個高,？要升華,，就要探討其作用機(jī)制，無非是誰調(diào)控了ncRNA,，ncRNA向下調(diào)控了誰。

經(jīng)典策略是,，KD/KO或過表達(dá)感興趣的RNA，通過RNA-seq/蛋白質(zhì)組實(shí)驗(yàn)找出的差異基因/差異蛋白質(zhì)很可能受該RNA調(diào)控,。哈爾濱工業(yè)大學(xué)王亞東組基于這個原理建立了lncRNA2Target數(shù)據(jù)庫,，www.lncrna2target.org/，可惜三年沒更新了,。

它沒更新沒關(guān)系,。具體到某個RNA，我們自己去SRA數(shù)據(jù)庫查詢RNA-seq數(shù)據(jù),，如果已經(jīng)做過這個RNA的KD/KO樣品的RNA-seq,，就可以拿來看該RNA調(diào)控的靶基因了,。

上面找到的是間接調(diào)控，要直接調(diào)控的線索,，怎么找,？

找RNA直接調(diào)控的靶基因的最好方法是ChiRP實(shí)驗(yàn)，為RNA設(shè)計(jì)探針,，拉它結(jié)合的DNA/RNA/蛋白質(zhì),。提取DNA，測序,，找的是RNA結(jié)合的DNA,；提取蛋白質(zhì)，做質(zhì)譜MS,，找的是RNA結(jié)合的蛋白,；提取RNA，測序,，找的是RNA結(jié)合的RNA,。世界上有幾個組能做好ChiRP實(shí)驗(yàn)？一只手都數(shù)的過來,?？尚行缘停趺崔k,？預(yù)測縮小范圍,，然后用一對一的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

預(yù)測RNA結(jié)合的蛋白質(zhì)

先用預(yù)測方法找出候選基因,，然后用低通量實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,。2017年發(fā)表的基于機(jī)器學(xué)習(xí)的RNA和蛋白結(jié)合預(yù)測工具——catRAPID。http://service./page/catrapid_group,，能預(yù)測RNA結(jié)合的蛋白質(zhì),，還能預(yù)測蛋白質(zhì)結(jié)合的RNA（文末講這個問題）。用法查看tutorial,，簡單易用,。 

支持多個物種

誰來調(diào)控lncRNA/circRNA/miRNA的問題，要從轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后兩個水平來研究,。

lncRNA/circRNA的轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控

（蛋白質(zhì)結(jié)合DNA）

上篇講的研究轉(zhuǎn)錄因子對DNA的調(diào)控的方法,，同樣適用于lncRNA/circRNA/miRNA的研究。這段DNA下游基因要么轉(zhuǎn)錄成mRNA然后翻譯成了蛋白質(zhì),，要么轉(zhuǎn)錄成lncRNA或circRNA或miRNA,。因此，找蛋白編碼基因和找lncRNA/circRNA/miRNA基因上游的調(diào)控因子的方法是一樣的,。

• Plan A：大量ChIP-seq公共數(shù)據(jù)

• Plan B：motif分析預(yù)測

• 補(bǔ)充Plan C：ATAC-seq結(jié)合motif分析

返回上一篇看Plan A和Plan B,，誰來調(diào)控我感興趣的DNA,？

Plan C：ATAC-seq結(jié)合motif分析

調(diào)控蛋白所結(jié)合的DNA附近會形成open區(qū)域，產(chǎn)生DHS,。2013年,，Howard Y Chang發(fā)明了ATAC-seq。詳見從第一篇文章開始,，講講ATAC-seq能干啥,？類似于DNase-seq，ATAC-seq能夠找出基因組上的open區(qū),，根據(jù)這段區(qū)域上的motif,，推測它上面可能結(jié)合的TF。ATAC-seq用的細(xì)胞數(shù)更少,，500-50,000個細(xì)胞就能做,，實(shí)驗(yàn)更穩(wěn)定。有了ATAC-seq的加入,，把motif預(yù)測出來的候選TF范圍縮小到染色質(zhì)開放區(qū)域,，結(jié)果更準(zhǔn)確。

去年Howard Y Chang又發(fā)明了ATAC-see（assay of transposase-accessible chromatin with visualization,，利用可視化檢測轉(zhuǎn)座酶易接近的染色質(zhì)）,。

還記得Howard Y Chang嗎？美帝國自然NIH資助啥,？一文中看到,，他憑《lncRNA在癌癥中的作用機(jī)制》一項(xiàng)拿到$724,705，相當(dāng)于人民幣400多萬,，該項(xiàng)目已經(jīng)發(fā)表2篇paper,，一篇Single cell，一篇CRISPR screen,。我們站在大牛肩上,，緊跟大牛節(jié)奏，就能趕在上升期,，抓緊時間輕松發(fā)一區(qū),；否則，鄰居大媽都知道ATAC-seq的時候,。。,。

本來miRNA要退二線，結(jié)果lncRNA經(jīng)常請它出山,；現(xiàn)在circRNA加了一把力,，讓miRNA出鏡率又高了起來,。發(fā)展了這么多年，直接篩選與RNA結(jié)合的RNA的高通量實(shí)驗(yàn)技術(shù)難度依然很大,，因此,，大家喜歡先預(yù)測，再用低通量實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,。

通過預(yù)測miRNA靶基因,，篩選作為ceRNA競爭miRNA的lncRNA/circRNA。這種帖子已經(jīng)滿天飛,。review總結(jié)的ceRNA數(shù)據(jù)庫,，https:///10.1093/bib/bbx042

小哈只說一點(diǎn)，如果做miRNA靶基因預(yù)測,，首選TargetScan,。由專做miRNA的大牛Bartel組開發(fā)，持續(xù)維護(hù)更新,，最新更新到2016年6月,。提供人、小鼠,、線蟲,、果蠅、斑馬魚的獨(dú)立檢索頁面和下載,。其余的工具已經(jīng)很久不更新了,，例如pictar用的還是hg18，miRanda更新到2010年,。

蛋白質(zhì)調(diào)控RNA

依舊是先講基于高通量實(shí)驗(yàn)的篩選方法,，再談預(yù)測方法。

基于高通量實(shí)驗(yàn)的篩選調(diào)控RNA的蛋白質(zhì)

什么樣的蛋白質(zhì)會來調(diào)控RNA呢,？有一類RNA結(jié)合蛋白（簡稱RBP）,，它們會結(jié)合RNA，調(diào)控RNA加工,。目前發(fā)現(xiàn)的人類RBP有1072個,。

單獨(dú)做一套RNA結(jié)合蛋白的RIP-seq或CLIP實(shí)驗(yàn)，能看到該RBP的靶基因是誰,，motif長啥樣,。少數(shù)專門研究RBP的人對這樣的問題感興趣。

上面是模式圖,，下面是真實(shí)數(shù)據(jù)

更多的研究者想知道：哪個RBP調(diào)控了我感興趣的ncRNA,。這就需要多套RIP/CLIP數(shù)據(jù)整合分析了。當(dāng)你手里有成百上千套RIP-seq或CLIP-seq數(shù)據(jù)時，就看哪套數(shù)據(jù)在感興趣的RNA上有peak,，也就知道了哪個RBP結(jié)合了我的RNA,。

上面是模式圖，下面是真實(shí)數(shù)據(jù)

有哪些RBP的高通量數(shù)據(jù)可以用呢,？

曾經(jīng)有個收錄RBP的數(shù)據(jù)庫RBPDB,，http://rbpdb.ccbr./，五年沒更新了,。

所幸ENCODE已經(jīng)產(chǎn)生了332套高質(zhì)量的eCLIP-seq數(shù)據(jù),，包含250個RBP，2種細(xì)胞系,，存儲在ENCORE數(shù)據(jù)庫中,。點(diǎn)擊左下角“閱讀原文”直達(dá)eCLIP-seq數(shù)據(jù)檢索界面。

下面的視頻由ENCODE里面主攻RBP的Yeo Lab的Eric Van Nostrand講解,。介紹了RBP數(shù)據(jù)庫里都有哪些數(shù)據(jù),；eCLIP-seq數(shù)據(jù)處理pipeline和命令行；以及用RBP數(shù)據(jù)庫能做哪些研究,？

ENCORE數(shù)據(jù)庫里有哪些數(shù)據(jù),？

eCLIP-seq數(shù)據(jù)處理pipeline

ENCODE只產(chǎn)生了332套eCLIP-seq數(shù)據(jù)，在SRA上能檢索到更多的RIP-seq和CLIP-seq數(shù)據(jù),，人的有1890條記錄,。充分利用這些公共數(shù)據(jù)，將為研究lncRNA/circRNA調(diào)控機(jī)制提供有實(shí)驗(yàn)證據(jù)的線索,。

預(yù)測調(diào)控RNA的蛋白質(zhì)

積累越來越多的RBP RIP-seq或CLIP數(shù)據(jù),，識別motif，以后我們也可以通過motif預(yù)測的方式找調(diào)控RNA的RBP了,。目前已有機(jī)器學(xué)習(xí)方法計(jì)算Global Score,，已經(jīng)整合進(jìn)catRAPID工具中，http://service./page/catrapid_group,，預(yù)測哪個RBP調(diào)控我感興趣的ncRNA,。