編譯：小范兒,，編輯：小菌菌,、江舜堯。

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原名：Diarrhoeal events can trigger long-term Clostridium difficile colonization with recurrent blooms

譯名：腹瀉引起艱難梭菌長(zhǎng)期定殖并反復(fù)大量繁殖

期刊：Nature Microbiology

IF：14.3

發(fā)表時(shí)間：2020.2.10

通訊作者： Martin F. Polz

通訊作者單位：美國(guó)麻省理工學(xué)院土木與環(huán)境工程系

首先基于DNA測(cè)序的方法對(duì)David以及Hsaio等人的兩項(xiàng)研究進(jìn)行時(shí)間序列分析,，確定胃腸道紊亂是否會(huì)引起艱難梭菌定植,。為了直接測(cè)試腹瀉對(duì)艱難梭菌定植的影響，開發(fā)一種不受艱難梭菌發(fā)病機(jī)制影響的可調(diào)節(jié)胃腸紊亂強(qiáng)度的小鼠模型,。喂養(yǎng)四組小鼠,，每組十只，在接觸艱難梭菌時(shí)增加瀉藥,，在開始前3d一直到瀉藥處理后第10天每天進(jìn)行糞便取樣,，并使用16S rRNA測(cè)序監(jiān)測(cè)糞便中是否存在艱難梭菌。第10天收集回腸,、盲腸,、升結(jié)腸和回腸交界組織進(jìn)行組織學(xué)分析。

圖1.艱難梭菌的定殖和大量繁殖與腹瀉病的恢復(fù)有關(guān),。

為了確定胃腸道紊亂是否會(huì)引起艱難梭菌定植，搜索有關(guān)腸道微生物組的調(diào)查,，這些調(diào)查的時(shí)間清晰且具有較高的腹瀉發(fā)病率,，且腹瀉發(fā)生都不是抗生素治療引起的。我們關(guān)注的是基于DNA測(cè)序的微生物群落圖譜,，而不是基于培養(yǎng)的分析,。具體來說，我們發(fā)現(xiàn)一種廣泛使用的DNA提取方案,，使用二氧化硅珠進(jìn)行機(jī)械裂解和DNA純化,，這種方法對(duì)艱難梭菌營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞的效率大約比孢子高800倍。David等人進(jìn)行一項(xiàng)時(shí)間序列研究,，對(duì)兩個(gè)成年人進(jìn)行長(zhǎng)達(dá)一年的采樣(分別為291和159個(gè)樣本),，重新分析該研究揭示艱難梭菌定植和脫落的增加與腹瀉紊亂之間的關(guān)系(圖1)。研究參與者B在前151天未檢測(cè)到艱難梭菌,，但在食物中毒引起的腹瀉未得到治療后的第2天艱難梭菌數(shù)量急劇增加,，表明其在此期間發(fā)生了艱難梭菌定植,。研究參與者B在發(fā)病18天后再次出現(xiàn)胃腸道紊亂，檢測(cè)它們糞便發(fā)現(xiàn)有艱難梭菌大量繁殖,。同樣,，研究對(duì)象A出國(guó)旅行時(shí)感染了腹瀉后沒有使用抗生素治療，立即有大量艱難梭菌在其體內(nèi)定殖,。值得注意的是,，這兩個(gè)人都沒有意識(shí)到他們?cè)谶@段時(shí)間里被艱難梭菌定殖。

對(duì)David等人的30項(xiàng)研究重新分析也揭示艱難梭菌傳播的短期和長(zhǎng)期動(dòng)態(tài),。艱難梭菌定植研究參與者B后,，在他們的糞便中存留了64天。研究參與者A在取樣的最初幾天檢測(cè)到艱難梭菌,，表明開始便有該菌定殖,，在隨后的365天研究中同樣持續(xù)存在。艱難梭菌的豐度每天都有很大的變化,。雖然艱難梭菌在繁殖期間的豐度在0.02和0.05%之間,，但這些豐度在有癥狀患者的豐度范圍內(nèi)。雖然研究參與者B經(jīng)歷的兩次定殖都與腸胃紊亂有關(guān),，研究參與者A卻不是絕對(duì)的表現(xiàn)這種關(guān)系,。分析研究參與者日常糞便頻率和稠度的元數(shù)據(jù)顯示，研究參與者A所經(jīng)歷的七次艱難梭菌大量繁殖中,，只有一次大量繁殖之前大便更頻繁,、更松弛。綜上所述,，這些觀察表明,，在長(zhǎng)達(dá)一年的時(shí)間內(nèi)艱難梭菌可持續(xù)在腸道定殖，但在這段時(shí)間內(nèi)其數(shù)量變化很大,，可能與第二次腹瀉發(fā)生有關(guān),。

接下來，分析Hsaio等人的時(shí)間序列,，采集孟加拉國(guó)7名求治霍亂弧菌感染患者的糞便樣本,。在治療感染的過程中收集他們的每一次排便，在第一次排出固體大便后允許出院,。前兩周每天對(duì)研究參與者采集樣本,，之后每周采集一次，研究參與者最初接受單次口服阿奇霉素,，然后在整個(gè)住院期間接受補(bǔ)液治療,。7名研究參與者在感染期間都表現(xiàn)出類似的群落轉(zhuǎn)變模式，即從一個(gè)以變形桿菌為主的群落向以厚壁菌門和擬桿菌門為主的健康狀態(tài)轉(zhuǎn)變(圖2)。此外,，7名研究參與者在康復(fù)階段,，無論是出院前還是出院后幾天都有艱難梭菌大量繁殖。具體來說,，每個(gè)研究參與者都出現(xiàn)艱難梭菌數(shù)量的突然峰值,，占總菌群的0.2-4.3%，比其他時(shí)期的平均數(shù)量高1到3個(gè)數(shù)量級(jí),。甚至在出院幾個(gè)月后,，所有七名研究參與者的糞便中都檢測(cè)到艱難梭菌。這些觀察提供進(jìn)一步的證據(jù),，艱難梭菌在腸道內(nèi)存活的時(shí)間較長(zhǎng)，在急性感染后的早期恢復(fù)階段是決定其是否容易定殖的關(guān)鍵時(shí)期,。

雖然7名霍亂弧菌感染患者接受單一劑量的阿奇霉素,，但不太可能對(duì)艱難梭菌定植有實(shí)質(zhì)性的影響。對(duì)患者抗生素使用和CDI發(fā)生率的薈萃分析表明,，使用大環(huán)內(nèi)酯類抗生素,，包括阿奇霉素，發(fā)生CDI 的風(fēng)險(xiǎn)較低,。但是,，我們從嬰兒使用阿奇霉素的一項(xiàng)隨機(jī)安慰劑對(duì)照試驗(yàn)中，對(duì)糞便的16S rRNA測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行了重新分析,，以更直接地評(píng)估阿奇霉素對(duì)無癥狀艱難梭菌定植的影響,。嬰兒是研究無癥狀艱難梭菌傳播的特別有用的隊(duì)列，因?yàn)橄啾瘸赡耆怂鼈兏菀妆欢ㄖ?，但很少出現(xiàn)疾病癥狀,。在阿奇霉素處理3天之前和之后兩周，收集120名研究參與者糞便樣本,，共有29名研究參與者在研究中的某個(gè)時(shí)間點(diǎn)被艱難梭菌定殖（17個(gè)阿奇霉素,，12個(gè)安慰劑），但與安慰劑組的研究參與者相比,，在開始都呈艱難梭菌陰性的情況下,，接受阿奇霉素治療的研究參與者感染艱難梭菌的可能性并沒有增加。對(duì)于治療前艱難梭菌陽(yáng)性的研究參與者,，阿奇霉素組的艱難梭菌含量增加,，降低或降至檢測(cè)限以下的可能性與安慰劑組相同?？紤]到霍亂弧菌感染引起嚴(yán)重的胃腸道紊亂,，導(dǎo)致在Hsaio等調(diào)查的7例患者糞便中，腸上皮和粘膜的碎片清晰可見。每小時(shí)排便0.7次-3.5次很可能是艱難梭菌定植敏感性的主要因素,，而不是使用阿奇霉素,。

圖2.艱難梭菌在感染霍亂弧菌后恢復(fù)的病人中繁殖。

頂部的圖表總結(jié)隨時(shí)間推移糞便微生物群落的科水平系統(tǒng)發(fā)育結(jié)構(gòu),。同一顏色的不同色度代表同一門的不同科,。下圖顯示艱難梭菌在整個(gè)研究中的相對(duì)數(shù)量。

圖3.與安慰劑對(duì)照組相比,，阿奇霉素治療對(duì)嬰兒艱難梭菌定植無明顯影響,。

a 兩組糞便仍為艱難梭菌陰性的比例，兩組研究參與者在最初為陰性后變?yōu)槠D難梭菌陽(yáng)性或在最初為陽(yáng)性后變?yōu)槠D難梭菌陰性,。在這些類別中,，用阿奇霉素治療的研究參與者的人數(shù)與安慰劑組在統(tǒng)計(jì)學(xué)上沒有差異。b.研究參與者在12d的治療后較治療前艱難梭菌豐度發(fā)生成倍的變化,。在研究參與者中阿奇霉素組與安慰劑組一樣,，在治療前和治療后艱難梭菌的數(shù)量都有可能增加或減少。

為了確定健康的人如果沒有胃腸紊亂的情況是否會(huì)有艱難梭菌定殖,，我們接下來搜索關(guān)于沒有腹瀉的人的一些微生物組的最近研究。首先確定了Caporaso等人的一項(xiàng)研究,。一年的時(shí)間,，研究人員分別對(duì)兩名成年人的糞便、舌頭和手掌進(jìn)行332次和130次采樣,，兩名研究對(duì)象都沒有出現(xiàn)腹瀉癥狀,。分別在兩個(gè)不同的研究參與者的手掌上檢測(cè)到艱難梭菌，我們可以推斷,，這些研究參與者在日?；顒?dòng)中偶爾會(huì)接觸到艱難梭菌。然而,，沒有在這兩個(gè)人的糞便中檢測(cè)到艱難梭菌,，表明盡管他們反復(fù)接觸艱難梭菌但都沒有被感染。

美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院人類微生物組計(jì)劃健康隊(duì)列用更多研究參與者測(cè)試健康人是否有艱難梭菌定殖,。30多項(xiàng)排除標(biāo)準(zhǔn)確保所有的研究參與者都是健康的,。這些標(biāo)準(zhǔn)可以排除在取樣前6個(gè)月使用抗生素、有胃腸道疾病或急性疾病史的研究參與者,。分別對(duì)286名研究參與者采樣三次,，共603個(gè)樣本。只在一個(gè)樣本中檢測(cè)到艱難梭菌(相對(duì)豐度為0.001%),，這個(gè)樣本來自一名被取樣三次的研究參與者,，表明艱難梭菌在健康人群中很少見,。

盡管在人身上觀察到的結(jié)果令人信服,，但最終無法排除不受控制的因素影響到觀察結(jié)果,。為了直接測(cè)試腹瀉對(duì)艱難梭菌定植的影響，我們開發(fā)一種可調(diào)節(jié)胃腸紊亂強(qiáng)度的小鼠模型,，該模型不受艱難梭菌發(fā)病機(jī)制影響,。我們喂養(yǎng)四組小鼠，每組十只,，在接觸艱難梭菌時(shí)增加滲透性瀉藥,，并通過16S rRNA測(cè)序檢測(cè)糞便中是否存在艱難梭菌。處理結(jié)束時(shí),，對(duì)照組(第1組;0 mg/ml PEG3350)有堅(jiān)硬,、成形良好的糞便顆粒；2組(15mg/ml PEG3350)糞便顆粒柔軟,、成形良好,；3組(30 mg/ml PEG3350)糞便顆粒柔軟，但無水樣,；第4組(150 mg/ml PEG3350)出現(xiàn)稀水便。第1組至第3組觀察到行為和體重減輕均無明顯變化，但第4組小鼠變得不活動(dòng)，平均體重減輕其初始體重的6％,。第10天收集回腸,、盲腸、升結(jié)腸和回腸交界組織的組織學(xué)分析顯示,，四個(gè)小組共40只小鼠均無炎癥癥狀，即每只小鼠以炎癥五分制計(jì)算均為零分。因此,，這些觀察結(jié)果表明，處理組近似輕度腹瀉(組2),，強(qiáng)腹瀉(組3)和急性腹瀉(組4),，但在所有小鼠中均未出現(xiàn)持續(xù)性腸道炎癥。

通過增加飲用水中瀉藥的濃度,，在小鼠糞便中發(fā)現(xiàn)艱難梭菌的繁殖速度和數(shù)量都增加(圖4),。對(duì)照組和最低瀉藥劑量處理組(第2組)的小鼠糞便中均未檢測(cè)到艱難梭菌。然而,，第3組的一只老鼠和第四組的八只老鼠糞便中有艱難梭菌繁殖,，這種情況持續(xù)三天。通過檢測(cè)微生物群落的整體變化,，艱難梭菌的豐度也隨著腹瀉引起的胃腸道紊亂程度的增加而增加,。重要的是,，PEG3350處理后，在糞便的稠度和總體細(xì)菌豐度恢復(fù)正常后出現(xiàn)艱難梭菌大量繁殖,。該觀察結(jié)果表明,，這些繁殖代表著艱難梭菌數(shù)量的絕對(duì)增加，而不是由于樣品細(xì)胞密度不均勻而測(cè)量到的相對(duì)豐度,。此外,，從細(xì)菌大量繁殖的小鼠糞便樣本中培養(yǎng)艱難梭菌，并證實(shí)這些分離出的細(xì)菌的基因型與添加到飲用水中的孢子相同,。艱難梭菌的培養(yǎng)豐度與16S rRNA序列測(cè)定的豐度基本一致,。在將艱難梭菌孢子添加到水里之前以及PEG3350處理后的小鼠中，無法分離出任何其他艱難梭菌菌株,。表明在處理之前不存在艱難梭菌污染,，且檢測(cè)到的大量定殖的艱難梭菌是所接種的艱難梭菌菌株。我們還無法在小鼠的16SPIP數(shù)據(jù)庫(kù)中找到與任何病原體相對(duì)應(yīng)的16S rRNA序列,，表明不存在偶然感染影響艱難梭菌的定殖,。總的來說,，這些結(jié)果表明,，瀉藥引起的胃腸道紊亂使小鼠更容易感染艱難梭菌，證實(shí)了從腹瀉病患者身上觀察到的情況,，即胃腸道紊亂后幾天是艱難梭菌易感的關(guān)鍵時(shí)期,。

圖4.增加干擾強(qiáng)度導(dǎo)致艱難梭菌在小鼠中繁殖的可能性和程度增加。

每組中小鼠糞便有艱難梭菌繁殖的小鼠數(shù)量,。b. 干擾程度的大小,，以相對(duì)于治療前3 d每只小鼠在第1天的糞便微生物群落之間的平均Bray Curtis差異來衡量。c. 隨時(shí)間變化的糞便微生物群落的科水平系統(tǒng)發(fā)育結(jié)構(gòu)（上圖）,，以及隨時(shí)間推移每只小鼠中艱難梭菌的相對(duì)豐度（底部）,。

像克林霉素這樣的抗生素可以破壞腸道的屏障功能，改變腸道的物理和化學(xué)性質(zhì),，使人們?nèi)菀资艿?/span>CDI的影響,。我們證明，這一關(guān)系比先前認(rèn)為的更為普遍,，因?yàn)楦篂a引起的胃腸道紊亂可引發(fā)對(duì)定殖的敏感性,，而不論其病因如何。我們的觀察證明對(duì)于艱難梭菌是醫(yī)院感染中最重要的病原體之一,，與抗生素使用有關(guān)的描述不夠完整,。我們的結(jié)果表明艱難梭菌是一種與干擾有關(guān)的機(jī)會(huì)主義者，其定植與胃腸道疾病的病史有關(guān),。

我們的分析強(qiáng)調(diào),，敏感性的關(guān)鍵時(shí)期在緊接著干擾之后的幾天,，即恢復(fù)期。七名從霍亂感染中恢復(fù)的研究參與者中,，有四人在住院期間第一次排出固體狀糞便時(shí)出現(xiàn)艱難梭菌大量繁殖(圖2),。剩下的三名研究參與者在出院后幾天內(nèi)經(jīng)歷艱難梭菌繁殖。同樣地,，所有的小鼠在瀉藥處理的前2天內(nèi)出現(xiàn)第一次艱難梭菌繁殖,。因此，腹瀉后幾天是阻斷艱難梭菌傳播周期的一個(gè)重要目標(biāo),。

長(zhǎng)期時(shí)間序列研究分析揭示艱難梭菌的傳播可以在長(zhǎng)達(dá)一年的時(shí)間尺度內(nèi)持續(xù)存在,，脫落量在這段時(shí)間內(nèi)大幅波動(dòng)(圖1)。特別是在攜帶者中第二次紊亂不斷觸發(fā)短期艱難梭菌大量脫落,。這種與腹瀉的聯(lián)系突出在胃腸道紊亂后針對(duì)此時(shí)期阻斷艱難梭菌傳播的重要性,。然而，并非我們檢測(cè)到的所有艱難梭菌繼發(fā)感染都與腹瀉病有明顯的關(guān)聯(lián),，表明一旦有人感染艱難梭菌,，除了腸胃紊亂外，其他因素也會(huì)引發(fā)艱難梭菌大量脫落,。隨著時(shí)間的推移,，艱難梭菌在攜帶者體內(nèi)高度可變的豐度也對(duì)診斷有重要意義。艱難梭菌在同一時(shí)間內(nèi)往往會(huì)在檢測(cè)限度以下波動(dòng)幾天,，揭示單時(shí)間點(diǎn)診斷是否為攜帶者不可靠,。

雖然在小鼠模型中觀察到各種干擾強(qiáng)度下艱難梭菌的繁殖都是短暫的，但艱難梭菌的數(shù)量可能只是低于檢測(cè)限度,。我們對(duì)人類的觀察表明，這種豐度是高度可變的,，常常幾天內(nèi)都低于檢測(cè)的極限,。事實(shí)上，Lawley等人的一項(xiàng)研究表明,，在小鼠體內(nèi),，由克林達(dá)霉素誘導(dǎo)的艱難梭菌定植在初始定植過程中也產(chǎn)生了類似的繁殖-脫落動(dòng)態(tài)，艱難梭菌的豐度最初很高,，但幾天內(nèi)就陡然下降了6個(gè)數(shù)量級(jí),，達(dá)到檢測(cè)的極限。但是,，隨后對(duì)相同小鼠進(jìn)行抗生素處理可能會(huì)在30 d后引起艱難梭菌二次繁殖,。因此，有可能在瀉藥處理后出現(xiàn)艱難梭菌繁殖的小鼠細(xì)菌定殖變得穩(wěn)定,，但我們的模型系統(tǒng)中艱難梭菌的穩(wěn)態(tài)豐度低于16S rRNA測(cè)序的檢測(cè)限度,。

觀察到胃腸道紊亂會(huì)引起攜帶者體內(nèi)艱難梭菌短暫的脫落,，有助于解釋為什么通常認(rèn)為艱難梭菌是一種共感染病原體。最近,，醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室開始使用獨(dú)立培養(yǎng)的檢測(cè)方法,，同時(shí)檢測(cè)數(shù)十種不同的病原體，表明腹瀉患者中同時(shí)感染的情況非常普遍,。大約10%的腹瀉患者檢測(cè)出多種胃腸道病原體呈陽(yáng)性,，其中40%的病例將艱難梭菌確定為共同感染源。然而,，還不清楚艱難梭菌是否是這些患者疾病的驅(qū)動(dòng)因素,。我們的研究結(jié)果表明，許多這些共感染患者可能是無癥狀攜帶者,，而導(dǎo)致他們癥狀的繼發(fā)性感染導(dǎo)致艱難梭菌脫落,。如果這是真的，可能意味著由艱難梭菌引起的實(shí)際患病率低于目前的估計(jì),。

腹瀉可能足以刺激艱難梭菌的易感性,，但在本研究中被確定為長(zhǎng)期攜帶者的9名研究參與者沒有人出現(xiàn)癥狀?？赡鼙砻?，引起疾病發(fā)展的因素與促進(jìn)定植的因素是分開的。大多數(shù)抗生素與灌腸或服用大便軟化劑引起的CDI相對(duì)危險(xiǎn)升高相似,。但是克林霉素,，氟喹諾酮類和頭孢菌素類抗生素發(fā)展為CDI的風(fēng)險(xiǎn)大大增加，由于抗生素引起的常見副作用是腹瀉,，因此許多抗生素可能通過引起腸道紊亂而促進(jìn)對(duì)定植的敏感性,。然而，只有少數(shù)抗生素也會(huì)影響腸道的物理,、化學(xué)和微生物特性的變化,，從而影響疾病的進(jìn)展，比如改變結(jié)腸中的膽汁酸成分,。

確定長(zhǎng)期攜帶者多久出現(xiàn)一次癥狀或成為其他人的感染源非常重要,。有證據(jù)表明，艱難梭菌定植降低發(fā)展CDI的可能性,，特別是如果該菌株不產(chǎn)生毒素,。但是，如果定殖菌株來自艱難梭菌的高毒力進(jìn)化枝,，則如果腸道條件發(fā)生變化,，這些攜帶者就可能轉(zhuǎn)變?yōu)榧膊顟B(tài)。事實(shí)上,，大多數(shù)無癥狀的艱難梭菌攜帶者都攜帶有致毒性菌株,。即使無癥狀攜帶者人不太可能發(fā)生CDI,，無論定植的基因型如何，反復(fù)大量繁殖并伴隨著脫落模式的增加表明這些攜帶者是艱難梭菌傳播的重要驅(qū)動(dòng)力,。我們的結(jié)果表明,，未來的干預(yù)措施需要更加認(rèn)真地考慮非抗生素引起的胃腸道紊亂在艱難梭菌傳播周期中的作用。我們的分析強(qiáng)調(diào)在腹瀉發(fā)生后的幾天內(nèi)確定具體傳播時(shí)期的重要性,。在美國(guó),，每年約有4800萬人感染食源性疾病，著重強(qiáng)調(diào)此類疾病發(fā)生后的幾天,，將其作為降低艱難梭菌患病率的重要目標(biāo),。在此期間開發(fā)新的藥物或生物療法以增加定殖抗性可能是實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)的重要一步。

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