▎藥明康德內(nèi)容團(tuán)隊(duì)編輯

如果說人類的基因組是書寫生命的一本“天書”,，那么讀出構(gòu)成DNA的A,、C、G,、T的測序技術(shù)就是讓我們能夠讀懂這本“天書”的工具,。出現(xiàn)伊始，基因組測序技術(shù)對生物醫(yī)學(xué)研究的重要性就得到了廣泛的關(guān)注,。20年前,，人類基因組計(jì)劃（Human Genome Project）發(fā)布了第一版人類基因組圖譜，標(biāo)志著人類基因組測序領(lǐng)域的突破性里程碑,。此后,，基因組測序領(lǐng)域繼續(xù)突飛猛進(jìn)，多種技術(shù)創(chuàng)新讓基因組測序更為高效,，精準(zhǔn)和普及,。在第一版人類基因組序列圖譜公布20周年之際，《自然》網(wǎng)站列舉了20年來在基因組測序領(lǐng)域的重要里程碑,。今天藥明康德內(nèi)容團(tuán)隊(duì)將與讀者一起回顧其中的部分精彩內(nèi)容,。

2001年：第一版人類基因組圖譜發(fā)布

在1990年,，由世界上多個國家的研究人員組成的國際性團(tuán)隊(duì)開展了人類基因組計(jì)劃（HGP）,，目標(biāo)是完成對人類基因組中的30億堿基的測序,。在1998年,，由Craig Venter博士創(chuàng)建的Celera Genomics也宣布開展人類基因組測序計(jì)劃。在2001年2月,，《自然》和《科學(xué)》雜志分別發(fā)布了人類基因組計(jì)劃和Celera Genomics公司完成的人類基因組草圖,。這兩項(xiàng)突破性研究開啟了生物醫(yī)藥的新時代,。

2004：宏基因組學(xué)的誕生

在21世紀(jì)以前，對微生物的研究通常需要通過培養(yǎng)來分離單個菌株,。然而,，微生物學(xué)家很早就發(fā)現(xiàn),，很多種自然界中存在的微生物無法在實(shí)驗(yàn)室中培養(yǎng),，這意味著,，使用培養(yǎng)的研究策略,，只能夠捕捉到自然界中微生物多樣性的1%,，那么用什么手段才能夠研究那剩余的99%？

在2004年,，兩項(xiàng)劃時代的研究通過對環(huán)境中采集的包含多種不同微生物的樣本進(jìn)行測序,，成功構(gòu)建了樣本中包含的不同微生物的基因組序列。這兩項(xiàng)研究表明,，不用單獨(dú)分離和培養(yǎng)一種微生物,，就可以通過DNA測序技術(shù)，對復(fù)雜微生物群體中不同微生物進(jìn)行分類,，并且發(fā)現(xiàn)未知的微生物,。它們揭示了宏基因組學(xué)（metagenomics）的巨大潛力。

2008：下一代基因測序技術(shù)

第一代核酸測序技術(shù)稱為Sanger測序法,。在2003年發(fā)布的第一版人類基因組圖譜就是通過Sanger測序來完成的,。然而，Sanger測序法需要通過電泳分離大小不同的DNA片段來讀取DNA序列,，在成本和速度上的局限限制了它的大規(guī)模應(yīng)用,。

2008年，在《自然》雜志上發(fā)表的兩篇論文使用下一代基因測序技術(shù)（NGS）,，生成了一名非裔個體和一名亞裔個體的基因組,。在這兩項(xiàng)研究中，研究人員使用了稱為Solexa測序的下一代測序技術(shù),。這一技術(shù)目前仍然是Illumina公司短讀測序儀的基礎(chǔ)。

下一代測序技術(shù)與Sanger測序法相比的一大重要突破是通過將單個DNA分子固定在基質(zhì)上,，能夠允許對上百萬個不同的DNA分子同時進(jìn)行測序,。在2001年發(fā)布的第一版人類基因組圖譜耗資3億美元，耗時十幾年,。而使用下一代測序技術(shù),，在2008年可以在幾周內(nèi)完成對一個人類基因組的測序，將測序成本降低到50萬美元,。下一代測序技術(shù)的出現(xiàn)是測序可及性方面的重大進(jìn)步,，時至今日，這一技術(shù)仍然在進(jìn)一步降低測序需要的時間和成本,。

2008：癌癥基因組測序的突破

在人類基因組圖譜發(fā)布之后,，從事癌癥研究的科學(xué)家們很快就意識到了DNA測序在癌癥研究和抗癌療法開發(fā)方面的巨大潛力?；蚪M學(xué)可能幫助回答與癌癥相關(guān)的一些根本性的問題,，例如,，腫瘤細(xì)胞中究竟包含了哪些基因變異？

在2008年,，《自然》發(fā)布了首個急性髓系白血?。ˋML）樣本的全基因組序列。在這項(xiàng)研究中,，科學(xué)家使用下一代測序技術(shù),，對一名50多歲的AML患者的腫瘤細(xì)胞和正常皮膚細(xì)胞樣本進(jìn)行了全基因組測序。通過將癌細(xì)胞的基因組序列和正常細(xì)胞的基因組序列進(jìn)行比較,，研究人員發(fā)現(xiàn)了在癌細(xì)胞中的8個全新基因突變,。這一突破性研究驗(yàn)證了腫瘤學(xué)家的猜測，那就是利用基因組測序能夠發(fā)現(xiàn)可能導(dǎo)致腫瘤發(fā)生的全新基因突變,，從而提供一系列潛在的藥物靶點(diǎn),。

自這一突破以來，腫瘤學(xué)領(lǐng)域的測序研究以驚人的速度進(jìn)展,。如今,，基于DNA測序的檢測已經(jīng)能夠幫助發(fā)現(xiàn)癌癥驅(qū)動基因，腫瘤突變負(fù)荷以及新抗原的出現(xiàn),，為個體化治療提供非常寶貴的信息,。

2008：RNA測序和轉(zhuǎn)錄子組

人類基因組圖譜雖然揭示了人類基因組的DNA序列，但是要進(jìn)一步了解這些序列的功能,，科學(xué)家們需要對DNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物RNA進(jìn)行檢測,。在21世紀(jì)初，對轉(zhuǎn)錄子組（transcriptome）的研究依靠的主要技術(shù)之一是微陣列（microarray）技術(shù),。然而,，這一技術(shù)的缺陷在于只能研究固定在微陣列芯片上的已知基因或外顯子序列。

在2008年,，一系列研究在不同生物模式生物中展示了使用高通量下一代測序技術(shù),，對轉(zhuǎn)錄子組進(jìn)行測序的可能。這種稱為RNA測序的技術(shù)首先通過mRNA的Poly（A）尾部分離RNA,，然后將它們逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA并且使用下一代測序技術(shù)對cDNA進(jìn)行測序,。在2008年，利用RNA測序技術(shù),，多個研究團(tuán)隊(duì)對酵母和擬南芥（Arabidopsis thaliana）的轉(zhuǎn)錄子組進(jìn)行了測序,，并發(fā)現(xiàn)了全新的轉(zhuǎn)錄子和基因。

RNA測序不但能夠確定功能性基因組,，而且可以用于監(jiān)測不同條件下RNA的數(shù)量變化,，它已經(jīng)成為遺傳學(xué)、生物學(xué)和醫(yī)藥領(lǐng)域的標(biāo)志性研究工具之一,。

2009：外顯子組測序

歷史上,，想要找到單基因疾病的原因通常先要通過遺傳學(xué)研究確定可能的致病突變在染色體上的位置,。而外顯子組測序的突破讓研究人員在不知道致病基因突變的位置和它的功能的情況下，發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致單基因疾病的基因突變,。

外顯子組測序技術(shù)通過使用微陣列捕捉到基因組DNA中的外顯子序列,，然后對富集的外顯子序列進(jìn)行測序。它在降低測序成本的同時,，對編碼蛋白的序列能夠進(jìn)行更深度的測序,。

在2009年，華盛頓大學(xué)（University of Washington）的Sarah Ng博士和她的同事們報告了首個利用全外顯子組測序發(fā)現(xiàn)單基因疾病致病突變的概念驗(yàn)證結(jié)果,。在這項(xiàng)研究中,，這一團(tuán)隊(duì)對8個對照樣本和四名罕見疾病Freeman–Sheldon綜合征患者的樣本進(jìn)行了外顯子測序。他們發(fā)現(xiàn)MYH3基因是在4名患者中均出現(xiàn)非同義突變或者剪接位點(diǎn)異常的基因,。這一研究確立了使用外顯子測序技術(shù)發(fā)現(xiàn)致病基因變異的研究框架,。隨后，這一團(tuán)隊(duì)?wèi)?yīng)用同樣的策略,，又發(fā)現(xiàn)了Miller綜合征等其它單基因疾病的致病基因變異,。

外顯子測序?qū)Φ鞍拙幋a序列進(jìn)行深度測序的能力大幅度加快了研究人員發(fā)現(xiàn)致病基因的速度，尤其是在罕見病領(lǐng)域,。

2009：單細(xì)胞測序

基于對組織樣本的基因表達(dá)檢測只能夠發(fā)現(xiàn)不同細(xì)胞類型產(chǎn)生的平均結(jié)果,，這可能導(dǎo)致研究人員忽略特定細(xì)胞類型的表現(xiàn)。在2009年,，Nature Methods發(fā)布了首個對單個小鼠卵裂球（blastomere）進(jìn)行的全轉(zhuǎn)錄子組研究,。與微陣列技術(shù)相比，這一技術(shù)具有更高的敏感性,，研究人員不但能夠檢測到更多轉(zhuǎn)錄RNA的基因,，而且發(fā)現(xiàn)了全新的剪接位點(diǎn)。

單細(xì)胞測序技術(shù)的發(fā)展,，為分析細(xì)胞狀態(tài),、發(fā)現(xiàn)罕見細(xì)胞類型，追蹤細(xì)胞發(fā)育軌跡和譜系,，以及研究腫瘤異質(zhì)性都提供了有力的工具。

2012：構(gòu)建人類基因組的“百科全書”

在第一版人類基因組圖譜完成之前,，科學(xué)家們已經(jīng)意識到,，確定基因組的DNA序列還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能達(dá)到了解生命分子過程的目的。儲存在DNA序列中的信息需要被調(diào)控和解讀,，與蛋白的相互作用,，染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)和化學(xué)修飾，都對這一過程有著重要的影響,。因此,，在2003年,，名為DNA元件百科全書（Encyclopedia of DNA Elements, ENCODE）的研究項(xiàng)目開始啟動。這一項(xiàng)目旨在確認(rèn)基因組中所有的功能性元件,，這不僅包括編碼蛋白的基因,，還包括啟動子和增強(qiáng)子這樣的調(diào)控元件。

▲調(diào)節(jié)基因表達(dá)的多種功能性元件（圖片來源：ENCODE官網(wǎng)）

在2012年,，這一項(xiàng)目的第二階段（ENCODE 2）完成,，研究團(tuán)隊(duì)在《自然》，Genome Research和Genome Biolgoy上發(fā)表了30篇論文,。他們不但確認(rèn)了20687個編碼蛋白的基因,，而且在147種不同的細(xì)胞類型中描繪了它們的表達(dá)模式。研究人員還發(fā)現(xiàn)了超過7萬個啟動子和接近40萬個增強(qiáng)子區(qū)域,，為基因組中接近80%的序列找到了至少一種功能,。

ENCODE 3的研究結(jié)果匯集了5992個實(shí)驗(yàn)，顯著擴(kuò)展了人們對人類和小鼠基因組中調(diào)控元件的了解,。

目前這一項(xiàng)目已經(jīng)進(jìn)入到第四階段,。它將進(jìn)一步整合個體基因組和單細(xì)胞多組學(xué)信息，為了解人類生物學(xué),、進(jìn)化和疾病提供一本與時俱進(jìn)的“百科全書”,。

結(jié)語

20年前，人類基因組圖譜的發(fā)布代表了多個研究團(tuán)隊(duì)將近15年的研究成果,。然而,，這只是開始。在《自然》紀(jì)念人類基因組圖譜發(fā)表20周年的特刊中,，研究人員表示,，基因組圖譜的發(fā)布激發(fā)了闡明基因組非編碼部分功能的新時代，為療法開發(fā)鋪平了道路,。更為重要的是,，在關(guān)注單個基因功能的同時，它幫助建立了在系統(tǒng)水平上對生物學(xué)的理解,，讓我們能夠解讀定義生命的“天書”,。