SNP，全稱 Single Nucleotide Polymorphisms,，是指在基因組上單個核苷酸的變異,，包括轉(zhuǎn)換、顛換,、缺失和插入,，形成的遺傳標(biāo)記，其數(shù)量很多,，多態(tài)性豐富,。從理論上來看每一個 SNP 位點(diǎn)都可以有 4 種不同的變異形式, 但實(shí)際上發(fā)生的只有兩種, 即轉(zhuǎn)換和顛換, 二者之比為 2：1。SNP 在 CG 序列上出現(xiàn)最為頻繁, 而且多是 C 轉(zhuǎn)換為 T , 原因是 CG 中的胞嘧啶常被甲基化, 而后自發(fā)地脫氨成為胸腺嘧啶,。

一般而言,SNP 是指變異頻率大于 1 % 的單核苷酸變異,。在人類基因組中大概每 1000 個堿基就有一個 SNP , 人類基因組上的 SNP 總量大概是 3 ×10^6 個 。因此,SNP 成為第三代遺傳標(biāo)志, 人體許多表型差異、對藥物或疾病的易感性等等都可能與 SNP 有關(guān),。

SNP 根據(jù)其在基因中的位置,，可以分為基因編碼區(qū)、基因非編碼區(qū),、基因間隔區(qū)（基因之間的區(qū)域）,。由于基因序列的兼并性，編碼序列中的 SNP 不一定會改變蛋白的氨基酸序列,。編碼區(qū)的 SNP 有兩種類型: 同義和非同義,。同義單核苷酸多態(tài)性并不影響蛋白質(zhì)序列，而非同義的則會改變蛋白質(zhì)的氨基酸序列,。

而不在蛋白質(zhì)編碼區(qū)的 SNP 仍可能影響基因剪接,、轉(zhuǎn)錄子結(jié)合、信使 RNA 降解或非編碼區(qū)的 RNA 序列,。受到這種單核苷酸多態(tài)性（SNP）影響的基因表達(dá)被稱為單核苷酸多態(tài)性表達(dá)（ESNP）,，可能發(fā)生在此基因的上游或下游。

直接測序法

目前很多朋友在研究 SNP 位點(diǎn)的時(shí)候,，仍然在選用直接測序法,，Sanger 測序原理為雙脫氧終止法，會忠實(shí)的延伸出模板鏈上的堿基序列,，在毛細(xì)管電泳中會依次收集各個堿基的熒光信號,，SNP 則會在測序結(jié)果中出現(xiàn)如下套峰的情況，示例如下：

圖片來源：Google

優(yōu)點(diǎn)：直接測序法是目前最直觀,，準(zhǔn)確性相對而言最高的 SNP 分型方法,，適用于發(fā)現(xiàn)未知 SNP 位點(diǎn)，檢測少量樣本,，少量位點(diǎn)的堿基多態(tài)性,。

缺點(diǎn)：通量太低，且成本較高,，但是隨著現(xiàn)在高通量的測序技術(shù)的飛速發(fā)展,，目的片段甚至全基因組的高通量測序也讓直接測序法重新煥發(fā)活力！

片段長度多態(tài)性法

RFLP（Restriction Fragment Length Polymorphism,，限制性片段長度多態(tài)性）是一種較早的進(jìn)行 SNP 分型的技術(shù),，簡單來說就是在包含 SNP 位點(diǎn)的序列中存在有特定的限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，而 SNP 位點(diǎn)基因型的改變則會使該酶切位點(diǎn)失效,，這樣根據(jù)酶切之后 PCR 片段長度的多態(tài)性即可得知對應(yīng)的基因型，下面用一張圖片來示意該方法的實(shí)驗(yàn)流程：

如上圖所示,，三種基因型的結(jié)果條帶數(shù)目不一致,，可以比較容易判讀樣本的基因型。

優(yōu)點(diǎn)：適合小批量樣本的分型實(shí)驗(yàn)，不需要特殊的儀器,，只需要一臺 PCR 儀以及電泳儀器即可,；

缺點(diǎn)：通量小且對于位點(diǎn)要求高（需要特定的酶切位點(diǎn)），且沒法兒準(zhǔn)確的鑒別假陽性的情況（酶切不完全）,。

針對上述情況,，如果是沒找到合適的酶切位點(diǎn)，或者說存在的酶切位點(diǎn)所需要的內(nèi)切酶成本較高,，可以通過在 PCR 引物上引入錯配,，得到理想的酶切位點(diǎn)；

其次,，為了增大該種方法的檢測精確性,，一種方法是在 PCR 產(chǎn)物中選擇一個內(nèi)參酶切位點(diǎn)（與目標(biāo)酶切位點(diǎn)一致，用以檢測酶切是否完全）,，第二種方法就是改進(jìn)出了熒光酶切方法,，即在 PCR 的產(chǎn)物上添加上熒光，通過測序儀收集熒光信號,，報(bào)告產(chǎn)物的長度,，該種方法的優(yōu)勢在于毛細(xì)管電泳的精確性更高，分辨率更大,，同時(shí)可以混合上樣,，降低實(shí)驗(yàn)分型的成本，提高效率,。

飛行質(zhì)譜法

基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry,，MALDI-TOF MS）技術(shù)的 SNP 分型原理是：先通過 PCR 擴(kuò)增目標(biāo)序列，然后加入 SNP 序列特異延伸引物,，在 SNP 位點(diǎn)上延伸 1 個堿基,。將制備的樣品分析物與芯片基質(zhì)共結(jié)晶，將該晶體放入質(zhì)譜儀的真空管, 而后用瞬時(shí)納秒（10 - 9s）強(qiáng)激光激發(fā),，基質(zhì)分子吸收輻射能量,，導(dǎo)致能量蓄積并迅速產(chǎn)熱，使基質(zhì)晶體升華,，核酸分子就會解吸附并轉(zhuǎn)變?yōu)閬喎€(wěn)態(tài)離子,，產(chǎn)生的離子多為單電荷離子，這些單電荷離子在加速電場中獲得相同的動能,，進(jìn)而在一非電場漂移區(qū)內(nèi)按照其質(zhì)荷比率的不同得以分離,，在真空小管中飛行到達(dá)檢測器。

MALDI 產(chǎn)生的離子常用飛行時(shí)間（Time-of-Flight,，TOF）檢測器來檢測,，離子質(zhì)量越小，就越快到達(dá)。利用質(zhì)譜分析對質(zhì)量的靈敏度特別高的特點(diǎn),，很容易將僅含有一個不同堿基的兩段基因序列區(qū)別開,，推導(dǎo)出 SNP 分型。

優(yōu)點(diǎn)：成本較低,，不需要合成特殊的熒光引物,，只需要一對 PCR 引物以及延伸引物即可；檢測方便,，靈敏度高,，數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性有保證；

缺點(diǎn)：對于 SNP 位點(diǎn)兩側(cè)序列要求較高,，存在特殊序列,，如 SNP 位點(diǎn)，插入缺失等會影響準(zhǔn)確性,，另外,，對于樣本質(zhì)量稍微有些高，補(bǔ)數(shù)據(jù)較為麻煩,，如果樣本質(zhì)量不是很好的,，建議謹(jǐn)慎選用；最后一點(diǎn)是檢測成本低是基于位點(diǎn)數(shù)以及樣本數(shù)較多的情況而言,，目前市面上的公司一般是 25 - 30 個位點(diǎn)一個體系,，384 孔板為一個反應(yīng)收費(fèi)。

Taqman 熒光探針法

Taqman 探針想必各位都不陌生,，原理介紹如下：

該技術(shù)是由 ABI 研發(fā)的 SNP 分型技術(shù),，其技術(shù)原理如下：PCR 反應(yīng)時(shí)，加入一對兩端有不同熒光標(biāo)記的 MGB 特異探針來識別不同等位基因（allele1 和 allele2）,，5’端為報(bào)告熒光基團(tuán)（reporter）,，3’端為淬滅熒光基團(tuán) (quencher)。PCR 過程中,，兩個探針能與正向引物和反向引物之間的互補(bǔ)序列特異退火結(jié)合,。當(dāng)探針以完整形式存在時(shí)，由于能量共振轉(zhuǎn)移,，熒光基團(tuán)只發(fā)出微弱熒光,。

特異的探針與相應(yīng)的等位基因結(jié)合后，DNA 聚合酶發(fā)揮 5’到 3’外切酶活性,，把報(bào)告熒光基團(tuán)切割下來,，脫離 3’端淬滅熒光基團(tuán)的淬滅作用（quench），從而發(fā)出熒光,。兩個探針的 5’端標(biāo)有不同的熒光（FAM 或 VIC）,，3’端標(biāo)有 MGB 淬滅基團(tuán)結(jié)合體,。根據(jù)檢測到的不同熒光，可以判斷相應(yīng)樣本的 SNP 等位基因型,。

上圖右側(cè)即為 Taqman 實(shí)驗(yàn)分型后的結(jié)果圖，以上,，藍(lán)色和紅色代表兩種純合子,，右上角的綠色則為雜合子，左下角的黑色為 NTC,，其余地方散落的黑色的點(diǎn)則為由于樣本原因無法準(zhǔn)確分型的結(jié)果,。

優(yōu)點(diǎn)：操作簡單，準(zhǔn)確性高,，判讀也很方便,，認(rèn)可度高；

缺點(diǎn)：探針合成耗時(shí)較長,，一般為 ABI 公司合成,，從我自己的經(jīng)歷講，國內(nèi)合成的探針質(zhì)量不穩(wěn)定,，價(jià)格偏高,，通量小，一般為 1 - 2 個位點(diǎn)適用,，對于樣本的質(zhì)量要求較高,，除了樣本無降解外，還需要濃度盡可能的一致,，這樣結(jié)果才會比較集中,。

多重 SNaPshot 檢測方法

SNaPshot 技術(shù)又稱為小測序技術(shù)，是由美國應(yīng)用生物公司 (ABI) 開發(fā)的主要針對中等通量 (<20) 的 SNP 分型項(xiàng)目的分型技術(shù),。既然叫小測序技術(shù),，那么他的原理就跟一代測序很類似了，在一個含有測序酶,，四種熒光標(biāo)記的 ddNTP(注意：這里只有 ddNTP,，并沒有測序反應(yīng)中的 dNTP），緊挨多態(tài)位點(diǎn) 5’端的不同長度延伸引物和 PCR 產(chǎn)物模板的反應(yīng)體系中,，引物延伸一個堿基即終止,。

經(jīng) ABI 測序儀跑膠后，根據(jù)峰的顏色可知摻入的堿基種類,，從而確定該樣本的基因型,，針對不同的 SNP 位點(diǎn)設(shè)計(jì)不同長度的延伸引物來做到多個 SNP 在一個反應(yīng)體系中進(jìn)行分型。

重新繪制了下 SNaPshot 的原理圖如下：根據(jù)毛細(xì)管跑出來的峰的顏色區(qū)分一個樣本的單個位點(diǎn)的基因型,，根據(jù)峰的位置區(qū)分位點(diǎn),。

優(yōu)點(diǎn)：方法靈活,，位點(diǎn)選擇性不大，只要位點(diǎn)一側(cè)的序列符合設(shè)計(jì)測序引物的條件即可,，對于插入缺失,，同源區(qū)域等也有比較好的檢測方案可以設(shè)計(jì)。

缺點(diǎn)：價(jià)格比較高,。

LDR 連接酶檢測反應(yīng)法

LDR 法是基于核酸特異雜交原理,，設(shè)計(jì)兩條 3' 端堿基不一樣的鑒別引物用以鑒別 SNP 位點(diǎn)的兩種 Allele，同時(shí)設(shè)計(jì)一條在位點(diǎn)另一側(cè)的通用的引物,，在高溫連接酶的作用下,，當(dāng)左右兩條寡核苷酸探針（鑒別引物以及通用引物）與目的 DNA 序列完全互補(bǔ)，并且兩條探針之間沒有空隙時(shí)才能發(fā)生連接反應(yīng),，通過溫控循環(huán)該特異性連接反應(yīng)可反復(fù)進(jìn)行,，達(dá)到線性擴(kuò)增的效果，最后通過熒光掃描片段長度（在通用引物的合成時(shí)已經(jīng)在一端進(jìn)行了熒光修飾）,，實(shí)現(xiàn)對 SNP 位點(diǎn)的檢測,。

原理圖如下，圖中可以看出同一個位點(diǎn)的兩個 Allele 通過引物的長度不同進(jìn)行了區(qū)分,，不同的位點(diǎn)之間則是通過位置進(jìn)行的區(qū)分,。

優(yōu)點(diǎn)：操作簡單，無需特制的試劑,，比較適合 10 個位點(diǎn)以下的檢測,。

缺點(diǎn)：該方法需要在位點(diǎn)兩側(cè)設(shè)計(jì)引物，對于位點(diǎn)的要求會較 SNaPshot 方法較高,。

改進(jìn)的連接酶檢測法（iMLDR)

iMLDR 技術(shù)是基于傳統(tǒng)的連接酶反應(yīng)經(jīng)過改進(jìn)后的多重 SNP 分型技術(shù),，相比于傳統(tǒng)的連接酶反應(yīng)技術(shù)，iMLDR 提高了準(zhǔn)確性和分型的成功率,，該方法的特色在于采用了一個雙連接反應(yīng),，將區(qū)分基因型的熒光使用連接方法加到連接產(chǎn)物上，這樣一來可以輕松的增加該分型方法的通量,。

重新繪制了下該方法的原理圖,，分型方法的原理圖上已經(jīng)描述的很清楚啦：

優(yōu)點(diǎn)：準(zhǔn)確性較于 LDR 來說有了一定的提升，檢測通量較高,。

缺點(diǎn)： LDR 一樣,，對于位點(diǎn)的選擇性較高。

基因芯片法

DNA 基因芯片技術(shù)是近年來新開發(fā)的一種 DNA 序列變異檢測工具,，其原理是利用目標(biāo) DNA 與支持物上所固定的密集的寡核苷酸探針陣列進(jìn)行等位基因特異性反應(yīng),，根據(jù)反應(yīng)信號的有無和強(qiáng)弱確定 SNP 位點(diǎn)。

近年來隨著復(fù)雜性疾病研究的深入,，以及可利用的基因組數(shù)據(jù)的增加,，基于各種原理的 SNP 芯片反應(yīng)被開發(fā)出來,，以適應(yīng)不同目的、規(guī)模和條件的基因分型,，那么市面上現(xiàn)在常見的基因芯片 Illumina SNP 芯片分型平臺（包括 Infinium?技術(shù)和 GoldenGate?技術(shù)）和 Affymetrix 基因分型平臺（Affymetrix GeneTitan?技術(shù)）,，這兩大公司的基因分型平臺是目前應(yīng)用最為廣泛的基因分型平臺，適用于大樣本不同標(biāo)記密度的快速基因分型,。

這里由于商品化芯片種類有很多,，就不單獨(dú)介紹，有需要的同學(xué)可以去各家公司的官網(wǎng)上進(jìn)行查詢,，這里主要介紹一下這兩家的芯片的制造區(qū)別：Illumina 的技術(shù)為微珠技術(shù)，將 DNA 探針序列偶聯(lián)到微珠的表面,，再將各種微珠均勻的撒在已經(jīng)通過光蝕刻技術(shù)蝕刻出很多微孔的玻璃基片上,，而 Affymetrix 的技術(shù)則是直接在玻璃載體表面通過光蝕刻的方法植上探針序列，具體的技術(shù)細(xì)節(jié)這里就不做贅述了,。

SNPSCAN 分型法

SNPSCAN 分型法采用連接酶連接反應(yīng)的高特異性實(shí)現(xiàn)對 SNP 位點(diǎn)等位基因的識別,，然后通過在連接探針末端引入不同長度的非特異性序列以及通過連接酶加接反應(yīng)獲得位點(diǎn)對應(yīng)的不同長度連接產(chǎn)物，利用標(biāo)記熒光的通用引物對連接產(chǎn)物進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增,，通過熒光毛細(xì)管電泳擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳分離,，最后通過 GeneMapper 軟件分析獲取各個 SNP 位點(diǎn)的基因型。

重繪了一下原理圖,，幫助大家理解這種方法：

優(yōu)點(diǎn)：通量足夠大,，原理上來說可以一次性檢測 48n 個位點(diǎn)。

缺點(diǎn)：對于位點(diǎn)的要求更高,，比 LDR 的要求更高,，因?yàn)樵摲椒z測的只有位點(diǎn)兩側(cè)的幾十 bp 序列，如果這部分的序列存在著比較特殊的結(jié)構(gòu)或者很高的同源性,，那么基本可以告別這種方法了,。