為進(jìn)一步提高《微生物組實驗手冊》稿件質(zhì)量，本項目新增大眾評審環(huán)節(jié),。文章在通過同行評審后,，采用公眾號推送方式分享全文，任何人均可在線提交修改意見,。公眾號格式顯示略有問題,，建議電腦端點擊文末閱讀原文下載PDF審稿。在線文檔(https:///l/cL8RRqHIL)大眾評審頁面登記姓名,、單位和行號索引的修改建議,。修改意見的征集截止時間為推文發(fā)布后的72小時，文章將會結(jié)合有建設(shè)性的修改意見進(jìn)一步修改后獲得DOI在線發(fā)表,，同時根據(jù)貢獻(xiàn)程度列為審稿人或致謝,。感謝廣大同行提出寶貴意見。

白蟻腸道木質(zhì)纖維素降解細(xì)菌的分離與培養(yǎng)

Isolation and cultivation of lignocellulolytic bacteria from termite gut

李靖¹,，李苗¹,，倪金鳳^{1, *}

¹微生物技術(shù)研究院，微生物技術(shù)國家重點實驗室，山東大學(xué),，青島市,，山東省

^*通訊作者郵箱: [email protected]

摘要：白蟻是自然界木質(zhì)纖維素的重要分解者，本文介紹以羧甲基纖維素鈉為唯一碳源的富集培養(yǎng)基CMC2,，從黃胸散白蟻后腸中分離培養(yǎng)具有纖維素降解活性的細(xì)菌,；以木聚糖為唯一碳源的基本鹽培養(yǎng)基BB-，從黃翅大白蟻后腸中分離培養(yǎng)具有木聚糖降解活性的細(xì)菌,。

Abstract: Termites are important decomposers of lignocellulose in nature. Here, the cellulose degrading bacteria were isolated and cultured from the hindgut of Reticulitermes speratus using enrichment medium CMC2 supplement with sodium carboxymethyl cellulose as the sole carbon source, and the xylan degrading bacteria were isolated and cultured from the hindgut of Macrotermes barneyi using the basic salt medium BB- with xylan as the sole carbon source.

關(guān)鍵詞：白蟻,，腸道微生物，木質(zhì)纖維素降解,，纖維素酶,，木聚糖酶

研究背景：木質(zhì)纖維素是植物細(xì)胞壁的主要成分，是地球上最豐富的可再生生物質(zhì),。天然的木質(zhì)纖維素材料由纖維素,、半纖維素和木質(zhì)素組成 (Himmel， 2007),。白蟻以木質(zhì)纖維素為食,，是熱帶和亞熱帶地區(qū)木質(zhì)纖維素的重要分解者 (Yamada， 2005; Kudo 2009),。白蟻依賴自身內(nèi)源性木質(zhì)纖維素酶和外源性纖維素酶共同分解食入的木質(zhì)材料,，其中內(nèi)源性纖維素酶主要由白蟻唾液腺和前腸/中腸上皮細(xì)胞分泌，外源纖維素酶由共生微生物產(chǎn)生 (Ni and Tokuda, 2013),。白蟻后腸含有300多種共生微生物,，包括原生動物、細(xì)菌,、古菌等 (Hongoh, 2011),，這些共生微生物在白蟻的營養(yǎng)代謝、木質(zhì)纖維素降解過程中發(fā)揮著重要作用 (Brune, 2014),。分離培養(yǎng)相關(guān)微生物有助于進(jìn)一步研究木質(zhì)纖維素分解菌的代謝,、生理和功能酶系統(tǒng)。本文介紹從兩種白蟻腸道獲取纖維素和木聚糖降解細(xì)菌的方法,。

材料與試劑

1.黃胸散白蟻采自于浙江大學(xué)華家池小區(qū),，將采集的白蟻蟻巢放置于有蓋的塑料盒子中帶回實驗室，1周噴水1次,，室內(nèi)室溫飼養(yǎng),。

2.黃翅大白蟻采自于湖南衡陽地區(qū)，放置于恒溫恒濕培養(yǎng)箱 (26℃,，濕度90%),。

3.瓊脂 (生工生物工程有限公司,，產(chǎn)品目錄號: A505255)

4.酵母粉 (Oxoid, England, 產(chǎn)品目錄號: LP0021)

5.胰蛋白胨 (生工生物工程有限公司，產(chǎn)品目錄號: A505247)

6.NaCl,，K₂HPO₄,，MgSO₄，KNO₃,，NaAc (國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,，上海，分析純)

7.乙醇 (國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,，上海,，分析純)

8.有蓋的4.4 L塑料箱 （29.5cm*20cm*9.6cm）

9.樺木木聚糖 (Birchwood xylan) (Sigma 公司)

10.羧甲基纖維素鈉 （Carboxymethylcellulose sodium，CMC-Na）(生工生物工程有限公司)

11.富集培養(yǎng)基CMC2 (見溶液配方)

12.CMC2選擇平板 (見溶液配方)

13.BM基本鹽培養(yǎng)基 (Basic Media, BM) (見溶液配方)

14.BB-培養(yǎng)基：在去除NaAc的BM培養(yǎng)基中加入0.2 %的樺木木聚糖

15.70 %酒精

16.0.9 %生理鹽水

17.1 M NaCl

18.0. 1 %剛果紅溶液

19.移液器和槍頭

20.1.5 ml離心管

21.無菌水

22.玻璃試管

23.鑷子

24.解剖針

25.滅菌牙簽

26.涂布棒

27.Millex-GP針頭式過濾器（Millipore）

儀器設(shè)備

1.體視顯微鏡 (奧林巴斯, 日本,，model: SZ51)

2.超凈工作臺 (蘇凈安泰,，蘇州，model:SW-CJ-1FD)

3.分析天平 (賽多利斯公司,，北京，model: ALC-110.4&1100.2)

4.立式高壓滅菌器 (申安公司,，上海,，model:LDZM-80L)

5.電熱恒溫培養(yǎng)箱 (精宏實驗設(shè)備公司，上海,，model: DNP-9052)

6.水浴振蕩器 (哈東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司,，哈爾濱，model: HZS-H)

實驗步驟

一,、白蟻解剖及后腸菌懸液制備

1.選取白蟻工蟻（黃胸散白蟻）5頭,，放置冰上稍微冷凍使其活動性減弱，便于后續(xù)操作,。

2.將白蟻放入裝有70 %的酒精的2 ml離心管中消毒2分鐘,，然后轉(zhuǎn)入無菌水中清洗2次，每次1分鐘,。

3.用70 %的酒精擦拭解剖鏡的載物臺,，然后在載物臺上滴一滴0.9 %生理鹽水，用鑷子夾一頭白蟻放于其中,。

4.按住頭部,，在尾部用鑷子輕輕的往外拉，整個腸道即被拉出,，截取后腸部分置于盛有無菌水的滅菌1.5 ml離心管中,，經(jīng)無菌水沖洗2次后，轉(zhuǎn)入含200 μl富集培養(yǎng)基CMC2的1.5 ml離心管中,，用無菌的解剖針攪動后腸使其內(nèi)容物溢出,。

5.將上述含有個5頭白蟻后腸內(nèi)容物的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)入10 ml富集培養(yǎng)基CMC2中混勻，即為白蟻后腸菌懸液。

二,、纖維素降解菌的富集培養(yǎng)

1.取上述黃胸散白蟻后腸菌懸液5 ml轉(zhuǎn)入無菌的玻璃試管中,，于30 °C，200 r/min條件下振蕩培養(yǎng),。

2.培養(yǎng)1~3 d后,，按2 %的接種量，取0.1 ml菌液轉(zhuǎn)接至5 ml新的富集培養(yǎng)基CMC2中進(jìn)行第2次富集培養(yǎng),。

三,、用選擇平板篩選纖維素降解菌

1.將富集培養(yǎng)后的菌液做系列稀釋，選取合適稀釋倍數(shù)（本實驗中稀釋到10^-4～10^-5）的菌懸液,，涂布于CMC2選擇平板,，以平板上出現(xiàn)均勻的單菌落為準(zhǔn)。

2.將平板放置于30℃下恒溫培養(yǎng)1～3 d,。

3.待長出單菌落后,，用牙簽點種在CMC2選擇平板上。

4.每個單菌落點種兩個平板,，一個平板用于剛果紅染色觀察,，另一個作為保存平板。兩個平板置于同樣條件,，分別于30 °C恒溫培養(yǎng)1~3 d,。剛果紅染色的具體方法為: 用70 %酒精將菌落洗掉，然后用0.1 %剛果紅浸染CMC2選擇平板30 min,，再用1 M NaCl水溶液脫色30 min,。

5.觀察菌落周圍有無透明圈產(chǎn)生，如有透明圈產(chǎn)生,，則可初步判斷該菌株具有纖維素降解活性,。

四、纖維素降解菌的分離純化

1.將CMC2選擇平板上有透明圈的克隆劃線分離,，得到的單克隆進(jìn)行剛果紅染色,。

2.再重復(fù)上述劃線分離步驟，直至得到穩(wěn)定降解纖維素的單克隆,。

五,、木聚糖降解菌的分離純化

1.參照前面白蟻解剖和菌懸液制備的方法，從50頭黃翅大白蟻工蟻獲得后腸樣品,。

2.以0.5 %接種量接種至BB-培養(yǎng)基中30 °C培養(yǎng)3 d,，至木聚糖降解較完全。

3.將上述培養(yǎng)液涂布于固體BM-平板,，30℃培養(yǎng)3 d,。

4.將生長的克隆用牙簽點于固體BB-平板上進(jìn)行篩選,。

5.在固體BB-平板上用剛果紅染色實驗篩選木聚糖降解菌。

結(jié)果與分析

一,、從黃胸散白蟻分離到纖維素降解菌株

以CMC-Na為唯一碳源的富集培養(yǎng)基CMC2進(jìn)行腸道菌富集培養(yǎng),，然后涂布于CMC2選擇平板上進(jìn)行培養(yǎng)和篩選。在10^-4～10^-5稀釋倍數(shù)下分離出單菌落,，單菌落點種,、剛果紅染色后，觀察到透明圈,。對產(chǎn)生透明圈的菌落重復(fù)點種2次,，在30 °C培養(yǎng)條件下分離到10個纖維素降解菌株 (圖1A) (吳燕，2011),。

二,、從黃翅大白蟻后腸分離到木聚糖降解菌

目前，還沒有報道白蟻甚至是昆蟲來源的木聚糖酶,，但是在白蟻腸道內(nèi)能夠檢測到木聚糖酶的活性 (寧娜 2015),，其白蟻腸道內(nèi)的木聚糖酶可能是由腸道共生微生物提供。使用調(diào)整過的BM培養(yǎng)基：在BM培養(yǎng)基中去除NaAc,，加入0.2 %樺木木聚糖,，通過剛果紅平板篩選獲得一株木聚糖降解菌Mb1 (石小玉，2016),。

圖1. 木質(zhì)纖維素降解菌篩選和剛果紅染色平板

注：A：纖維素降解菌的篩選。B: 木聚糖降解菌的劃線培養(yǎng),。C和D：木聚糖降解菌的篩選和剛果紅染色,。

失敗經(jīng)驗

選用含有酵母粉 (0.2 %)，以CMC-Na為唯一碳源的培養(yǎng)基富集培養(yǎng)2次,，剛果紅染色法分析了約400個菌落,，沒有獲得有透明圈克隆。在富集培養(yǎng)基中加入無機(jī)氮源KNO₃ (0.1 %) 代替酵母粉,，獲得有透明圈的克隆,，另外在37 °C條件下培養(yǎng)的菌落，通過以上步驟沒有分離到具有纖維素酶活的微生物,。

溶液配方

1.富集培養(yǎng)基CMC2：

KH₂PO₄ 2g ,，MgSO4 0.15 g，KNO₂ 1 g,，CMC-Na 10 g,，加蒸餾水定容至1 L。121℃,，高壓蒸汽滅菌30 min,。

2.CMC2選擇平板：

酵母粉5 g,，胰蛋白胨10 g ，CMC-Na 2 g ,，NaCl 10 g ,，瓊脂15 g，加蒸餾水定容至1 L,。121℃,，高壓蒸汽滅菌30 min。

3.BM基本鹽培養(yǎng)基 (Basic Media, BM)：

KH₂PO₄ 0.2 g,，NH₄Cl 0.25 g,，KCl 0.5 g，CaCl₂·2H₂O 0.15 g,，NaCl 1.0 g,，NaAc 0.0246 g，MgCl₂·6H₂O 0.62 g,，Na₂SO₄ 2.84 g,，HEPES (pH 6.8) 10 mM；trace element solution 1 ml,；mixed vitamin solution 1 ml,；瓊脂18 g，加蒸餾水定容至1 L

4.Trace element stock solution g/L：

FeCl₂·4H₂O 1.5 g,，CoCl₂·6H₂O 0.19 g,，MnCl₂·4H₂O 0.1 g，ZnCl₂ 0.07 g,，H₃BO₃ 0.006 g,，Na₂MoO₄·2H₂O 0.036 g,，NiCl₂·.H₂O 0.024 g,，CaCl₂.H₂O 0.002 mg，HCl (25 % [v/v]), 配制10 ml過濾除菌

5.Mixed vitamin stock solution：

4-aminobenzoic acid 0.04 g,，biotin 0.01 g,，nicotinic acid 0.1 g,，calcium-pantothenate，0.05 g,，配制10 ml,，然后用Millex-GP針頭式過濾器過濾除菌。

6.BB-培養(yǎng)基：

BM-NaAc+0.2 % Birchwood xylan,，即在無NaAc的BM培養(yǎng)基中加入0.2 %的樺木木聚糖 (Birchwood xylan)

致謝

本項目獲得國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃 (973計劃, 編號：2011CB707402),，國家自然科學(xué)基金 (編號：31970119, 31272370, 30870085) 及山東大學(xué)微生物技術(shù)國家重點實驗室自主設(shè)置課題的支持。

參考文獻(xiàn)

1.寧 娜,，張倪,，吳 燕, 倪金鳳. (2015). 臺灣乳白蟻和黃翅大白蟻消化道主要木質(zhì)纖維素降解酶活性的比較. 應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報. 21(4): 678-682.

2.石小玉,，張寧，寧娜,，員超,，倪金鳳. (2016). 一株培菌白蟻后腸木聚糖降解細(xì)菌的分離與鑒定. 微生物學(xué)通報. 43(3): 504?509.

3.吳燕, 遲紹麗，倪金鳳. (2011). 從白蟻中分離到具有纖維素酶活的貪噬菌. 應(yīng)用昆蟲學(xué)報. 48(1): 33-28.

4.Brune, A. (2014). Symbiotic digestion of lignocellulose in termite guts. Nat Rev Microbiol. 12(3): 168-180.

5.Himmel, M. E., Ding, S. Y., Johnson, D. K., Adney, W. S., Nimlos, M. R., Brady, J. W. and Foust, T. D. (2007). Biomass recalcitrance: engineering plants and enzymes for biofuels production. Science. 315(5813): 804-807.

6.Hongoh, Y. (2011). Toward the functional analysis of uncultivable, symbiotic microorganisms in the termite gut. Cellular and Molecular Life Sciences. 68(8): 1311-1325.

7.Kudo, T. (2009). Termite-microbe symbiotic system and its efficient degradation of lignocellulose. Biosci Biotechnol Biochem. 73(12): 2561-2567

8.Ni, J. and Tokuda, G. (2013). Lignocellulose-degrading enzymes from termites and their symbiotic microbiota. Biotechnol Adv. 31(6): 838-850.

9.Yamada, A., Inoue, T., Wiwatwitaya, D., Ohkuma, M., Kudo, T., Abe, T. and Sugimoto, A. (2005). Carbon mineralization by termites in tropical forests, with emphasis on fungus combs. Ecological Research. 20(4): 453-460.