研究旨在篩選出產(chǎn)纖維素酶較高的酵母菌,，并對(duì)其生物學(xué)特性探討。試驗(yàn)從生境中篩選到產(chǎn)纖維素酶較高一株酵母菌,，通過(guò)菌株形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)對(duì)該菌株進(jìn)行了鑒定,，并對(duì)這株菌的耐酸性、耐模擬腸液性,、產(chǎn)酶特性和抑菌能力進(jìn)行評(píng)定,。結(jié)果表明，所篩酵母菌Y3為釀酒酵母菌,，產(chǎn)纖維素內(nèi)切葡聚糖酶酶活為3.27U/ml,，纖維素外切葡聚糖酶酶活為2.22U/ml，木聚糖酶酶活為4.21U/ml,，耐酸性,、耐模擬胃液較強(qiáng)，而耐模擬腸液能力較弱,，不能產(chǎn)生抗金黃色葡萄球菌的物質(zhì),。試驗(yàn)篩選到釀酒酵母菌Y3是一株較高產(chǎn)纖維素酶菌株并具有良好的生物學(xué)特性,，對(duì)于提高糧食加工副產(chǎn)物的利用率具有非常重要的現(xiàn)實(shí)意義。

       隨著人們生活水平的提高,，玉米纖維和豆渣的產(chǎn)量逐年升高,。固態(tài)發(fā)酵玉米纖維、豆渣作為動(dòng)物飼料成為高效利用糧食加工副產(chǎn)物的一種重要生產(chǎn)方式,。工業(yè)生產(chǎn)中菌種的選擇不但能夠影響發(fā)酵后飼料的感官并且決定發(fā)酵后飼料的品質(zhì),。以酵母菌作為發(fā)酵菌種，不僅能夠提高發(fā)酵飼料的風(fēng)味,，還能夠降解纖維素和生產(chǎn)菌體蛋白,，提高飼料的利用價(jià)值[1]。酵母菌在飼料工業(yè)中有廣泛的用途,，易于在含糖量較高的偏酸性環(huán)境中生長(zhǎng),。張亮等(2007)從實(shí)驗(yàn)室海洋酵母種庫(kù)中篩選到一株CMC酶酶活為4.51U/mg，濾紙酶酶活為4.75U/mg的普魯蘭類(lèi)酵母[2],。Sarawan等(2013)篩選到一株能產(chǎn)纖維素酶的假絲酵母菌KKUFW10,，在含有1.0%羧甲基纖維素的YPD培養(yǎng)基中發(fā)酵24h所產(chǎn)纖維素酶酶活為58.24U/ml[3]。酵母的代謝產(chǎn)物中含有豐富的維生素,、氨基酸和促生長(zhǎng)因子,， 然而關(guān)于產(chǎn)纖維素酶的酵母菌卻鮮于報(bào)道。因此,，本研究從高產(chǎn)纖維素酶菌株的篩選入手,，對(duì)篩選到的菌株進(jìn)行了形態(tài)學(xué)鑒定和分子生物學(xué)鑒定，生物學(xué)特性研究,，為玉米纖維和豆渣的工業(yè)化生產(chǎn)提供了重要基礎(chǔ),，對(duì)解決玉米纖維和豆渣的利用問(wèn)題提供了必要前提，并具有重要的現(xiàn)實(shí)意義,。

        1.1試驗(yàn)材料

       米酒,、酒糟、實(shí)驗(yàn)室保存菌種由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)飼料與生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室提供,。

        1.2培養(yǎng)基及主要試劑配制

        YPD培養(yǎng)基,、孟加拉紅培養(yǎng)基、CM C-Na培養(yǎng)基,、BPY培養(yǎng)基,、酵母菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基(玉米粉20g、酵母浸提物10g,、大豆蛋白胨20g,、麩皮5g、1000ml蒸餾水、pH值6.0),、培養(yǎng)基Ⅰ[酵母浸提物10g,、大豆蛋白胨20g、葡萄糖(單獨(dú)滅菌)10g,、CMC-Na5g,、pH值6.8、蒸餾水1000ml],、培養(yǎng)基Ⅱ(酵母浸提物10g,、大豆蛋白胨20g、葡萄糖5g,、CMC-Na10g、蒸餾水1000ml,、pH值 6.0),、DNS試劑、pH值4.8乙酸緩沖液,、10mg/ml的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)貯備液,、10mg/ml的木糖標(biāo)準(zhǔn)貯備液。

        1.3產(chǎn)纖維素酶酵母菌的分離篩選

        1.3.1酵母菌的分離

       取2g或2ml新鮮樣品,，加入盛有18 ml無(wú)菌生理鹽水的三角瓶中,，加滅菌玻璃珠，振蕩2~3min混勻,，靜置2h,，吸取5ml上清液，加入無(wú)菌試管中,。然后用無(wú)菌生理鹽水按10倍稀釋度逐級(jí)稀釋至10-4,、10-5、10-6 梯度,，在孟加拉紅培養(yǎng)基上涂布,，每個(gè)稀釋度涂布3個(gè)平板，28℃,、培養(yǎng)48h,，挑取具有酵母菌菌落特征且菌落較大的單菌反復(fù)在YPD培養(yǎng)基上劃線(xiàn)分離至長(zhǎng)出單菌落，并鏡檢確定菌體為純菌后,，進(jìn)行YPD斜面保存,。

        1.3.2產(chǎn)纖維素酶酵母菌的篩選

        1.3.2.1初篩 

       將分離到的酵母菌分別接種到裝有30mlYPD液體培養(yǎng)基的100ml三角瓶中，在28℃,、200r/min振蕩培養(yǎng)24h后,，按10倍逐級(jí)稀釋并涂布于CMC-Na培養(yǎng)基上，放置28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h。采用0.2%的剛果紅染色30min,，洗去染液,，最后用5%醋酸溶液固定顏色。觀(guān)察菌落周?chē)欠癞a(chǎn)生透明圈,，測(cè)量透明圈和菌落直徑并計(jì)算其比值,，挑選比值較大的菌落進(jìn)行復(fù)篩。

        1.3.2.2復(fù)篩 

       將初篩到的產(chǎn)纖維素酶能力較強(qiáng)的菌株以1%的接種量接種于酵母菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基中,，28℃搖床200r/min振蕩培養(yǎng)48h,。發(fā)酵12h后補(bǔ)加CMC-Na使培養(yǎng)基中CMC-Na的含量為0.5%左右。發(fā)酵后在5000r/min的離心機(jī)上離心10min,，收集上清液即為待測(cè)粗酶液,。測(cè)定纖維素內(nèi)切葡聚糖酶酶活，選取酶活最大的為目標(biāo)菌株,。

        1.4酶活測(cè)定方法

        1.4.1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制

       利用10mg/ml的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液配制濃度分別為0,、1、1.5,、2,、2.5、3,、3.5mg/ml一系列梯度的葡萄糖溶液,，每一濃度3個(gè)平行，利用分光光度計(jì)在540nm處測(cè)其吸光度,，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)(見(jiàn)圖1),。

        1.4.2木糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制

       利用10mg/ml的木糖標(biāo)準(zhǔn)液配制濃度分別為0,、1、1.5,、2,、2.5,、3、3.5mg/ml一系列梯度的木糖溶液,，每一濃度3個(gè)平行，利用分光光度計(jì)在540nm處測(cè)其吸光度,，繪制木糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)(見(jiàn)圖2),。

        1.4.3粗酶液的制備

       液體樣品采取液態(tài)發(fā)酵后,，離心，取上清液,，即為粗酶液；固態(tài)樣品采取固態(tài)發(fā)酵后取1.0g發(fā)酵料加10ml蒸餾水,，室溫下振蕩浸泡1h，離心,，取上清液,，即為粗酶液,。

        1.4.4 纖維素內(nèi)切葡聚糖酶活力測(cè)定

       取3支25ml刻度的比色管，分別加入1.5ml1%的CMC-Na(pH值4.8乙酸緩沖液配制),。其中2支作為待測(cè)試管,，在(50±0.5)℃恒溫水浴鍋中預(yù)熱5min,，再加入0.5ml粗酶液,，另1支作為空白對(duì)照試管，同時(shí)置于(50±0.5)℃恒溫水浴鍋中水浴20min,，然后取出3支試管，并把空白對(duì)照試管迅速放入冰水中,，向待測(cè)試管中加入3mlDNS。待空白對(duì)照試管冷卻后加入0.5ml粗酶液和3mlDNS,。將三支試管沸水浴5min后,，迅速放入冰水中冷卻,，加蒸餾水至25ml，以空白對(duì)照試管調(diào)零,，在540nm波長(zhǎng)下測(cè)量OD值。

        1.4.5纖維素外切葡聚糖酶活力測(cè)定

       取3支25ml刻度的比色管，分別加入50mg的脫脂棉球和1.5ml乙酸沖液,。其中2支作為待測(cè)試管，在(50±0.5)℃恒溫水浴鍋中預(yù)熱5min,，再加入0.5ml粗酶液,，另取1支作為空白對(duì)照試管,，同時(shí)置于(50±0.5)℃恒溫水浴鍋中水浴20min，然后取出3支試管,，并把空白對(duì)照試管迅速放入冰水中，向待測(cè)試管中加入3mlDNS,。待空白對(duì)照試管冷卻后加入0.5ml粗酶液和3mlDNS,。將3支試管沸水浴5min后，迅速放入冰水中冷卻,，加蒸餾水至25ml,，以空白對(duì)照試管調(diào)零，在540nm波長(zhǎng)下測(cè)量OD值,。

        1.4.6木聚糖酶活力測(cè)定

       取3支25ml刻度的比色管,，分別加入1.5ml1%的木聚糖溶液(pH值4.8乙酸緩沖液配制)，其中2支作為待測(cè)試管,，在(50±0.5)℃恒溫水浴鍋中預(yù)熱5min,，再加入0.5ml粗酶液，另取1支作為空白對(duì)照試管,，同時(shí)置于(50±0.5)℃恒溫水浴鍋中水浴20min,，然后取出3支試管，并把空白對(duì)照試管迅速放入冰水中,，向待測(cè)試管中加入3mlDNS,。待空白對(duì)照試管冷卻后加入0.5ml粗酶液和3mlDNS。將三支試管沸水浴 5min后,，迅速放入冰水中冷卻,，加蒸餾水至25ml以空白對(duì)照試管調(diào)零，在540nm波長(zhǎng)下測(cè)量OD值,。

        1.5菌株鑒定

        1.5.1形態(tài)學(xué)鑒定 

       觀(guān)察該菌在YPD平板上的菌落形態(tài)和顯微鏡下的菌體形態(tài),。

        1.5.2分子生物學(xué)鑒定

       使用酵母菌基因組提取試劑盒提取總DNA,，利用5.8SrDNA-ITS進(jìn)行菌種鑒定,，并根據(jù)ITS1,、ITS4的保守序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，正向引物ITS1：5′-TCCGTAG? GTGAACCTGCGG-3′,，反向引物ITS4：5′-TCCTCC?GCTTATTGATATGC-3′,。對(duì)所提酵母菌DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，采用0.8%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳,，檢測(cè)DNA提取情況及擴(kuò)增后的分子量,。將擴(kuò)增后的基因測(cè)序，并對(duì)所測(cè)的序列在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST比對(duì)以確定菌屬,。

        1.6酵母菌的馴化

       將篩選到的產(chǎn)纖維素酶能力較強(qiáng)的目標(biāo)菌株以1%的接種量接種于培養(yǎng)基Ⅰ中,，28℃、200r/min搖床振蕩培養(yǎng)6d,。然后,，將初步馴化的菌種再接種到培養(yǎng)基Ⅱ中搖床28℃、200r/min振蕩培養(yǎng)6d,，得到馴化后的菌種并進(jìn)行酶活力測(cè)定,。

        1.7耐酸性測(cè)定

       取純?nèi)樗峒拥結(jié)PD液體培養(yǎng)基中，使pH值分別為2.5,、3.0、3.5,、4.0,、4.5,，每個(gè)pH值分別取250ml至500ml三角瓶中,，121℃滅菌20min,。冷卻至室溫后接入7.5×108CFU/ml酵母菌28℃搖床200r/min振蕩培養(yǎng),，分別于12,、24、36,、48、60,、72h取樣采用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù),。

        1.8模擬胃液試驗(yàn)

       取1mol/l的鹽酸加水稀釋至pH值為1.5,、2.0,、2.5,、3.0,、3.5,，每個(gè)pH值分別取30ml至100ml三角瓶中121℃滅菌20min,，冷卻至室溫，用濾菌器向每個(gè)三角瓶中加入0.5g胃蛋白酶,，搖勻后待用，將培養(yǎng)12h后的菌液3ml加入各三角瓶中,，分別測(cè)定酵母菌在0、1,、2、3,、4h的OD600nm,，并計(jì)算相對(duì)含量,。

         1.9模擬腸液試驗(yàn)

       將A液(A胰腺液：稱(chēng)取1.1g碳酸氫鈉,、0.85g氯化鈉加入100ml蒸餾水中，用氫氧化鈉調(diào)pH值至6.8,，121℃滅菌20min，冷卻后,，無(wú)菌操作下加入1.5g胰蛋白酶混合備用。)和B液(B膽液：稱(chēng)取1.2g?；撬崮扄}加入至100ml蒸餾水中，121℃滅菌20min,。冷卻備用。)以2：1體積混合即可得到人工腸液,，每個(gè)三角瓶取100ml人工腸液，放置待用,。將培養(yǎng)12h后的菌液3ml加入各三角瓶中，分別測(cè)定酵母菌在0,、1、2,、3,、4h的OD600nm，并計(jì)算相對(duì)含量,。

        1.10抑菌能力測(cè)定

       將金黃色葡萄球菌接種于BPY液體培養(yǎng)基中，37℃,、180r/min培養(yǎng)12h,，稀釋活菌數(shù)為106CFU/ml,，取100μl涂布于BPY平板。將待測(cè)酵母菌在YPD液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h后12000r/min離心10min,，取200μl上清液加入牛津杯中,，37℃培養(yǎng)12h，觀(guān)察是否出現(xiàn)抑菌圈,。

        2.1 產(chǎn)纖維素酶酵母菌篩選

       對(duì)篩到的12株菌進(jìn)行CMC-Na平板篩選后，獲得5株能夠產(chǎn)纖維素酶的菌株(見(jiàn)圖3),，并測(cè)量和計(jì)算菌落直徑,、透明圈直徑、透明圈直徑與菌落直徑的比值(見(jiàn)表1),。選取透明圈直徑與菌落直徑較大的菌株進(jìn)行纖維素內(nèi)切葡聚糖酶活力測(cè)定(見(jiàn)表2)。由表2可知,，Y3內(nèi)切葡聚糖酶活最高為2.92U/ml，選定此菌株為目標(biāo)菌株,。

        2.2菌株鑒定

        2.2.1形態(tài)學(xué)鑒定 

       所篩酵母菌在YPD平板上菌落呈乳白色,，濕潤(rùn)、 圓形,、表面光滑、邊緣整齊,、頂部突起,、不透明(見(jiàn)圖4a),。鏡檢觀(guān)察菌株細(xì)胞形態(tài)：細(xì)胞較大，呈圓形或橢圓型,，出芽生殖(見(jiàn)圖4b)。

        2.2.2分子生物學(xué)鑒定

       將所選目標(biāo)菌株使用ITS1和ITS4引物對(duì)其5.8SrDNA-ITS區(qū)基因PCR擴(kuò)增,，擴(kuò)增產(chǎn)物900bp,。在GenBank對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物的序列進(jìn)行比對(duì)發(fā)現(xiàn)，所篩的Y3菌株序列片段與GenBank中釀酒酵母菌序列片段相似性達(dá)99%,，從而鑒定其為釀酒酵母菌。

        2.3馴化后釀酒酵母菌Y3酶活 

       馴化后的酵母菌能有更高的耐受和產(chǎn)酶能力[4-5],。釀酒酵母菌Y3進(jìn)行馴化,，馴化后此菌株纖維素內(nèi)切葡聚糖酶酶活達(dá)到3.27U/ml，纖維素外切葡聚糖酶酶活為2.22U/ml,，木聚糖酶酶活為4.21U/ml。

         2.4耐酸性試驗(yàn)

       飼料發(fā)酵過(guò)程中,，通常pH值<3.8時(shí)，有害菌才能完全被抑制,，乳酸菌是主要產(chǎn)酸的菌。酵母菌一般在pH值4.0~6.0的環(huán)境中生長(zhǎng)[6],。因此，耐酸的酵母菌的篩選將有利于飼料的發(fā)酵和提高飼料的發(fā)酵品質(zhì),。本試驗(yàn)測(cè)定了篩選到的釀酒酵母菌Y3在不同pH值下，作用不同時(shí)間,，酵母菌的活菌數(shù)，結(jié)果見(jiàn)表3,。由表3可知，該酵母菌株對(duì)乳酸有較高的耐受性,，并且該酵母菌隨著時(shí)間不斷增殖。在pH值2.5環(huán)境中,，該酵母菌在36h達(dá)到最大的生物量1.90×108CFU/ml。在pH值3.0~4.0環(huán)境中,，該酵母菌在48h達(dá)到最大生物量，分別是2.40×108,、3.15×108、3.05×108CFU/ml,。

        2.5模擬胃液試驗(yàn)

       成年豬胃與家禽肌胃內(nèi)正常pH值為2.0~3.5，能夠殺死大部分的微生物,。微生物只有耐受胃液，才能進(jìn)入小腸定植[7],。本試驗(yàn)測(cè)定了釀酒酵母菌Y3在不同pH值的模擬胃液中作用不同時(shí)間酵母菌的相對(duì)活菌數(shù)，結(jié)果見(jiàn)表4,。由表4可知，該酵母菌對(duì)模擬胃液有較強(qiáng)的耐受性,。在pH值1.5的模擬胃液中，該菌株的相對(duì)活菌數(shù)隨時(shí)間逐漸降低,，4h時(shí)相對(duì)活菌數(shù)為68.0% 。當(dāng)pH值≥2.0時(shí),，該菌株在前1h進(jìn)入適應(yīng)期，之后菌株的相對(duì)活菌數(shù)隨時(shí)間逐漸增加，并且pH值越大越適宜該菌株的繁殖,。

        2.6模擬腸液試驗(yàn)

       動(dòng)物腸道中存在大量的微生物,，也是益生菌發(fā)揮作用的主要場(chǎng)所[8]。然而,，小腸液偏堿性且含有大量的酶與膽鹽，膽鹽能夠阻止微生物在腸道中增殖[9-10],，因此，腸道環(huán)境不利于微生物的增殖,。本試驗(yàn)測(cè)定了篩選到的釀酒酵母菌Y3在模擬腸液中作用不同時(shí)間酵母菌的相對(duì)活菌數(shù)，結(jié)果見(jiàn)圖5,。由圖5可知，該株釀酒酵母菌對(duì)模擬腸液的耐受性較弱,，模擬腸液處理3h，該株酵母菌相對(duì)活菌數(shù)是37.0%,；模擬腸液處理處理1h，該株釀酒酵母菌相對(duì)活菌數(shù)是77.8%,。

        2.7抑菌能力試驗(yàn)

       通過(guò)取釀酒酵母菌Y3培養(yǎng)物的上清液，進(jìn)行牛津杯37℃培養(yǎng)12h后,，發(fā)現(xiàn)未出現(xiàn)透明圈(見(jiàn)圖6)，即該酵母菌未能產(chǎn)生抗金黃色葡萄球菌的物質(zhì),。

       通過(guò)初篩和復(fù)篩得到一株能夠產(chǎn)纖維素酶的酵母菌Y3,，對(duì)其進(jìn)行形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定后,，確定為釀酒酵母菌,。酶活測(cè)定發(fā)現(xiàn),，該菌株所產(chǎn)纖維素內(nèi)切葡聚糖酶酶活為3.27U/ml，纖維素外切葡聚糖酶酶活為2.22U/ml,，木聚糖酶酶活為4.21U/ml,。此菌株 有較強(qiáng)的耐酸和耐豬膽鹽特性，在pH值2.5的乳酸環(huán)境中36h,，該酵母菌的生物量為1.90×108CFU/ml,，在pH值1.5的模擬胃液中4h,，該酵母菌相對(duì)活菌數(shù)是68.0%。但該菌對(duì)模擬腸液耐受性較差,，在模擬腸液處理3h，其相對(duì)活菌數(shù)為37.0%,；該菌對(duì)金黃色葡萄球菌沒(méi)有抑制作用。