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流式細(xì)胞術(shù)出現(xiàn)40年來(lái)一直是分析單細(xì)胞復(fù)雜通路及反應(yīng)的重要工具,，然而其系統(tǒng)上的優(yōu)勢(shì)卻未被充分利用。近年來(lái)由于生物制藥的不斷發(fā)展,，再加上流式微球與細(xì)胞的復(fù)合能力,，可實(shí)現(xiàn)多維度追蹤細(xì)胞表型和功能的研究，使得流式細(xì)胞術(shù)引起了廣泛關(guān)注,，在藥物研發(fā)中的應(yīng)用也越來(lái)越多,。不僅可以對(duì)細(xì)胞胞內(nèi)和胞外的成分進(jìn)行檢測(cè)，也可以對(duì)血清或血漿樣本中的可溶性分析物進(jìn)行測(cè)定,，如細(xì)胞因子,、藥物復(fù)合物或抗藥物抗體（ADA）。 
圖1 Beckman多色流式細(xì)胞儀 流式細(xì)胞儀可以以每秒數(shù)百至數(shù)萬(wàn)個(gè)細(xì)胞的速度進(jìn)行單細(xì)胞分析,。高通量,、快速度的優(yōu)點(diǎn)非常適合大規(guī)模的藥物研發(fā)與檢測(cè)。流式細(xì)胞術(shù)可以在一個(gè)細(xì)胞表面進(jìn)行多個(gè)參數(shù)的檢測(cè),，配合數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)可以產(chǎn)生充分且復(fù)雜的數(shù)據(jù)流,，明確地排除在單參數(shù)試驗(yàn)中的假陽(yáng)性。另外,，流式細(xì)胞術(shù)可以使用多種熒光染料和探針,，可以有更多更靈活的選擇，如目前最先進(jìn)的質(zhì)譜流式可以選用多種金屬元素探針,。 流式細(xì)胞術(shù)對(duì)于單個(gè)細(xì)胞的特性的分析包括細(xì)胞表面或內(nèi)部抗原表達(dá),、亞細(xì)胞組件（如,，線粒體）和細(xì)胞動(dòng)態(tài)屬性（如，蛋白表達(dá)變化,、鈣流以及膜電位,、細(xì)胞增殖）等。本文主要介紹流式細(xì)胞術(shù)在藥物研發(fā)與研究中的應(yīng)用和基本技術(shù)流程,，著重介紹流式細(xì)胞術(shù)在藥物臨床生物分析中的特點(diǎn),，包括生物治療劑的PK研究、免疫原性分析中基于細(xì)胞的中和抗體（NAb）評(píng)價(jià),、PD相關(guān)生物標(biāo)志物中特殊細(xì)胞群體的免疫表型分型監(jiān)測(cè)和受體占位分析,。 流式細(xì)胞術(shù)的應(yīng)用范圍很廣，在藥物研發(fā)全過(guò)程中的各個(gè)環(huán)節(jié)都有應(yīng)用,，包括藥物研發(fā)與靶點(diǎn)確認(rèn),、非臨床安全性與毒性評(píng)價(jià)以及臨床研究等方面。圖2 流式細(xì)胞術(shù)在藥物發(fā)現(xiàn),、靶點(diǎn)驗(yàn)證,、毒理學(xué)和臨床試驗(yàn)等方面的應(yīng)用[1]一,、藥物研發(fā)過(guò)程中的靶點(diǎn)確認(rèn)、藥物特性以及化合物篩選如今采用幾個(gè)單參數(shù)試驗(yàn)來(lái)證明藥物篩選的有效性已受到質(zhì)疑，只有在單細(xì)胞水平上同時(shí)測(cè)量多個(gè)參數(shù),，才能深入了解化合物復(fù)雜的相互作用機(jī)制（MOA）和亞細(xì)胞群體間的相互作用,。近年來(lái)工程細(xì)胞系（transfec,、siRNA基因敲除等）被用于靶標(biāo)驗(yàn)證相關(guān)的藥物開發(fā)的模型（多為中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢（CHO））,，這些細(xì)胞系通過(guò)穩(wěn)定表達(dá)重組靶點(diǎn)的設(shè)計(jì)而用于檢測(cè)，如與細(xì)胞目標(biāo)抗原結(jié)合的（嵌合體,、人源化或人源化的）單克隆抗體藥物通過(guò)與靶點(diǎn)結(jié)合來(lái)進(jìn)行藥效和PK分析,，或檢測(cè)抑制藥物結(jié)合的中和抗體；還可用體外培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞毒性（CDC）和抗體依賴性細(xì)胞毒性（ADCC）等檢測(cè),。二,、非臨床研究中安全性評(píng)價(jià)非臨床研究中可采用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行藥物的體內(nèi)、體外安全性評(píng)價(jià),。在毒理學(xué)評(píng)估中,，流式細(xì)胞術(shù)提供了更高的精確度和更低的變異性，降低了時(shí)間,、試劑和動(dòng)物上的成本,。通常在這個(gè)階段進(jìn)行生物標(biāo)志物和臨床研究的初步劑量范圍的確定。流式細(xì)胞術(shù)已用于評(píng)估藥物引起的血管損傷（細(xì)胞死亡和循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞試驗(yàn)）,，同時(shí)測(cè)量T/DC細(xì)胞活化的變化或蛋白質(zhì)在特定細(xì)胞亞群上的表達(dá)水平,，可以更廣泛的描述毒性影響,、造血或免疫調(diào)節(jié),。在人類和動(dòng)物研究中，流式細(xì)胞術(shù)在骨髓分型分析上具有更多優(yōu)勢(shì),。除了確定毒性外,，流式細(xì)胞術(shù)還可以進(jìn)行靶點(diǎn)的調(diào)節(jié)和功能測(cè)定,，以了解藥物毒性評(píng)估期間的MOA,。非臨床研究中幾乎可以使用任何樣本類型，包括骨髓,、脾臟、淋巴結(jié)等,，外周血是最常見的樣本類型。流式細(xì)胞術(shù)在臨床生物分析中的應(yīng)用主要為細(xì)胞表型,、功能測(cè)定、藥效動(dòng)力學(xué)和免疫原性評(píng)價(jià),。對(duì)于靶向胞外抗原的一類生物治療劑（如靶向PD-1,、CD28的單抗），可以使用流式細(xì)胞術(shù)評(píng)價(jià)受體在細(xì)胞表面的參與程度,，或受體占用情況,。這對(duì)于藥物的臨床劑量確定有著重要的參考意義。此外,，生物治療藥物的PK研究也是基于抗體藥與活細(xì)胞表面靶點(diǎn)的結(jié)合,，也可以通過(guò)流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。流式細(xì)胞術(shù)可測(cè)定細(xì)胞功能,，即對(duì)藥物的響應(yīng),，比如細(xì)胞因子的產(chǎn)生和變化（比ELISA靈敏度高）、胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)和細(xì)胞增殖等,。功能測(cè)定也被作為癌癥疫苗效力評(píng)估的效能生物標(biāo)記物,。對(duì)于致靶細(xì)胞凋亡的藥物（如利妥昔單抗），功能測(cè)定被作為安全性相關(guān)的生物標(biāo)記物,。功能性檢測(cè)也可以用于免疫原性評(píng)估中,。但是功能性檢測(cè)由于需要體外刺激和培養(yǎng)的限制在臨床分析上不常使用。流式細(xì)胞術(shù)可通過(guò)檢測(cè)特定的細(xì)胞群來(lái)進(jìn)行藥效評(píng)估,，比如利妥昔單抗治療中通過(guò)檢測(cè)CD3+CD8+T細(xì)胞,、B細(xì)胞,、NK細(xì)胞群評(píng)估藥效。用流式細(xì)胞術(shù)分群可以在淋巴細(xì)胞分型的基礎(chǔ)上進(jìn)一步分型至小亞群,，這些亞細(xì)胞群和內(nèi)皮細(xì)胞,、循環(huán)轉(zhuǎn)移瘤細(xì)胞以及CD34干細(xì)胞等群體可作為藥效相關(guān)的生物標(biāo)志物來(lái)檢測(cè)。免疫原性評(píng)價(jià)在生物治療劑的臨床分析中的重要性不言而喻,。對(duì)于免疫原性分析通常都會(huì)涉及cell based assay和流式細(xì)胞術(shù)的應(yīng)用,。流式細(xì)胞術(shù)是一個(gè)復(fù)雜的方法，需要詳細(xì)了解流式細(xì)胞儀,、熒光色素,、光譜重疊、細(xì)胞譜系標(biāo)記,、細(xì)胞內(nèi)過(guò)程和數(shù)據(jù)分析,。一般來(lái)說(shuō)，流式分析時(shí)首先要獲得單細(xì)胞,，并使用細(xì)胞活力染料標(biāo)記細(xì)胞（區(qū)分活細(xì)胞和死細(xì)胞）,，再將細(xì)胞與需要檢測(cè)的抗體一起孵育，然后選擇熒光二抗共孵育,。如果要對(duì)細(xì)胞內(nèi)部蛋白進(jìn)行標(biāo)記,，則需要對(duì)細(xì)胞進(jìn)行通透化處理。處理后的細(xì)胞樣本通過(guò)進(jìn)樣器被輸送進(jìn)入流式細(xì)胞儀,。單個(gè)細(xì)胞上的熒光信號(hào)經(jīng)過(guò)處理,，從而可以對(duì)單個(gè)細(xì)胞所結(jié)合的抗體進(jìn)行定性和定量分析。數(shù)據(jù)的儲(chǔ)存格式是FCS文件（通用流式文件）,，可使用多種方式進(jìn)行分析和可視化,。圖3是對(duì)不同來(lái)源樣本的處理流程圖。生物分析應(yīng)用中的技術(shù)要點(diǎn)流式細(xì)胞術(shù)在生物分析應(yīng)用中的內(nèi)容涉及多個(gè)方面,，雖然這些檢測(cè)的目標(biāo)不同,，數(shù)據(jù)的輸出方式也不同，但有其共性,。流式細(xì)胞術(shù)的特點(diǎn)決定了其在PK研究,、免疫原性評(píng)價(jià)和PD生物標(biāo)志物分析及驗(yàn)證中的特殊性。流式細(xì)胞術(shù)在PK研究中的應(yīng)用主要從生物治療藥物和細(xì)胞治療劑兩方面分別介紹,。生物治療藥物的PK研究可使用間接免疫熒光法。該方法與基于平板的LBA相同,，都依賴于抗原-抗體或受體-配體的結(jié)合作用,。也可以將抗原、抗藥抗體、受體或配體偶聯(lián)到微球上,，使用熒光染料偶聯(lián)的二級(jí)檢測(cè)試劑（以下稱二抗）對(duì)藥物進(jìn)行定量,。總的來(lái)說(shuō),，流式細(xì)胞術(shù)更能保證藥物的構(gòu)象與活性,，與藥物療效和安全性參數(shù)的相關(guān)性更好，且可以實(shí)現(xiàn)多參數(shù)同時(shí)檢測(cè),，有利于發(fā)現(xiàn)藥物或靶點(diǎn)相互作用的相關(guān)性,。一般來(lái)說(shuō)可通過(guò)與熒光染料（FITC、PE等）結(jié)合的二抗來(lái)實(shí)現(xiàn)不同水平的結(jié)合藥物的檢測(cè),，生成藥物濃度對(duì)信號(hào)的劑量-響應(yīng)曲線（標(biāo)準(zhǔn)曲線）,，然后通過(guò)從標(biāo)準(zhǔn)曲線內(nèi)插信號(hào)來(lái)量化未知樣本的藥物濃度。流式細(xì)胞術(shù)用于藥物PK研究的要點(diǎn)在于細(xì)胞的選擇,、抗原表達(dá)的變化以及驗(yàn)證要求中的已測(cè)樣本再分析（ISR）,。盡量選擇表面靶標(biāo)表達(dá)量高、均一性高的細(xì)胞,?？梢杂迷?xì)胞、細(xì)胞系或者基因改造的細(xì)胞,。首選具有高表達(dá)水平表面抗原的細(xì)胞,，這可以使藥物定量的動(dòng)態(tài)范圍更廣，信號(hào)/背景（有藥物存在的信號(hào)/無(wú)藥物的信號(hào)）在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)一般至少有2.5倍的差異,。由于藥物與細(xì)胞內(nèi)抗原結(jié)合的程度取決于細(xì)胞膜的通透性,，因此不能使用表達(dá)胞內(nèi)抗原的細(xì)胞,。一般選擇新鮮細(xì)胞進(jìn)行PK分析,，以便最好地保持天然靶標(biāo)抗原的構(gòu)象。如果使用固定細(xì)胞或凍干細(xì)胞,，抗原表位可能改變,，則需要證明其與藥物的結(jié)合與新鮮細(xì)胞的結(jié)合的一致性和/或可比性。在選擇細(xì)胞時(shí)經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)某一抗原在多種細(xì)胞系的表面都有表達(dá)的情況,，這時(shí)需要確定抗原表達(dá)的均一性,，在流式分析的直方圖（MFI-細(xì)胞數(shù)量）中，一個(gè)狹窄的對(duì)稱鐘形峰值在MFI mean和MFI median是近似的,，表明抗原表達(dá)是均一的,。而非常寬的峰型、拖尾或雙峰則表明細(xì)胞上抗原表達(dá)不均一,，這會(huì)導(dǎo)致MFI的變化,，實(shí)驗(yàn)重現(xiàn)性較差。因此PK評(píng)估中通常讀取MFI median。在細(xì)胞的培養(yǎng)過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)的抗原脫落和調(diào)節(jié)（內(nèi)化）等,，如外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）在體外經(jīng)歷了有限的擴(kuò)增或需要細(xì)胞因子/生長(zhǎng)因子的刺激擴(kuò)增,，可能改變細(xì)胞表型，如表面抗原的表達(dá),。應(yīng)進(jìn)行細(xì)胞傳代分析以確定限度,，保證抗原的表達(dá)量較高且穩(wěn)定?？山⒅骷?xì)胞庫(kù)并生成工作細(xì)胞庫(kù),，以支持分析方法開發(fā)、方法驗(yàn)證以及臨床樣本分析,。建立最佳低溫保存和細(xì)胞解凍程序,，保證細(xì)胞存活率和細(xì)胞再生能力，并保持抗原表達(dá)的一致性,。圖4 藥物X與人PBMC的劑量依賴性結(jié)合 （FITC與細(xì)胞數(shù)量的MFI中值）,。每個(gè)直方圖顯示藥物X濃度（μg/mL）和相應(yīng)的MFI中值[2] 大多數(shù)配體結(jié)合試驗(yàn)，包括流式細(xì)胞術(shù)PK試驗(yàn)中的藥物靶點(diǎn)抗原結(jié)合都具有S形劑量響應(yīng),，常用的模型是四參數(shù)非線性曲線擬合,。理想情況下，未知樣本的內(nèi)插值期望在理論值的80-120%范圍內(nèi),。圖4顯示了多克隆抗體藥物（藥物X）用于人類的PK分析,，表明藥物以劑量依賴的方式與表達(dá)目標(biāo)抗原的PBMC結(jié)合。圖5顯示了藥物X劑量-反應(yīng)曲線,。總的來(lái)說(shuō),，流式細(xì)胞術(shù)PK分析的方法驗(yàn)證研究設(shè)計(jì)與其他PK方法類似，如ELISA和質(zhì)譜檢測(cè),，都需遵循已出版的指南及驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn),，如圖6。有研究對(duì)藥物流式細(xì)胞術(shù)PK分析方法與基于ECL的PK分析方法進(jìn)行了比較研究,。關(guān)鍵性能參數(shù)均能滿足驗(yàn)證要求,，且兩種檢測(cè)方法都是準(zhǔn)確和精確的。流式細(xì)胞術(shù)PK分析方法的成功驗(yàn)證,，使其成為PK研究的一種新選擇,。如今ISR已成為驗(yàn)證PK分析方法的監(jiān)管要求，而由于細(xì)胞表面抗體的微妙變化使得流式細(xì)胞術(shù)在ISR分析上有一定的局限性,，但可以通過(guò)對(duì)細(xì)胞的分級(jí)建庫(kù)來(lái)解決,。如果選擇使用微球則不受此限制。2. 細(xì)胞治療劑的PK研究（細(xì)胞動(dòng)力學(xué)檢測(cè)）近年隨FDA批準(zhǔn)的CAR-T細(xì)胞治療劑的成功上市,，新名詞“細(xì)胞動(dòng)力學(xué)”橫空出世,，用于評(píng)估注射入人體內(nèi)的活細(xì)胞藥物的水平。目前可采用qPCR和流式細(xì)胞術(shù)對(duì)目標(biāo)細(xì)胞進(jìn)行定量，但由于基因表達(dá)的不確定性,，PCR的檢測(cè)可能受到基因沉默的影響,，而流式細(xì)胞術(shù)能更詳細(xì)的確定正在擴(kuò)增的CAR陽(yáng)性細(xì)胞中是否存在非T細(xì)胞群體。對(duì)于細(xì)胞及基因治療藥物,，其異質(zhì)性增加了在單個(gè)細(xì)胞基礎(chǔ)上的多樣性,。因此，測(cè)量細(xì)胞的純度是非常重要的,。在CAR-T細(xì)胞治療中,，自體（患者）或異體（供體）T細(xì)胞被純化，通過(guò)基因工程表達(dá)針對(duì)腫瘤特異性表面抗原的受體,，并在實(shí)驗(yàn)室中擴(kuò)增,。這些擴(kuò)增的細(xì)胞被重新注入到癌癥患者體內(nèi)，并以非MHC限制性的方式與腫瘤細(xì)胞表面抗原結(jié)合,，增殖并殺死腫瘤細(xì)胞,。CAR-T細(xì)胞動(dòng)力學(xué)的測(cè)定對(duì)于評(píng)估體內(nèi)抗原暴露后相關(guān)的擴(kuò)增和隨后的持久性至關(guān)重要。根據(jù)CAR-T細(xì)胞治療的各種臨床試驗(yàn)最新數(shù)據(jù)表明,，注入擴(kuò)增的CAR-T細(xì)胞在隨后的2周內(nèi)達(dá)到峰值并在數(shù)月內(nèi)緩慢下降,，甚至在數(shù)年后仍可在患者體內(nèi)檢測(cè)到CAR-T細(xì)胞。流式細(xì)胞術(shù)同時(shí)檢測(cè)多個(gè)標(biāo)記物的能力非常適合研究這些T細(xì)胞的表型和功能特征,。流式細(xì)胞術(shù)用于細(xì)胞治療藥物的“細(xì)胞動(dòng)力學(xué)”研究的特點(diǎn)在于基線樣本獲取,、樣品穩(wěn)定性、商用試劑采購(gòu)以及驗(yàn)證的法規(guī)指導(dǎo),。2.1 CAR-T細(xì)胞樣本（如全血,、骨髓、腦脊液）的獲取在自體CAR-T細(xì)胞治療中,，患者接受自己的T細(xì)胞,，不可能在治療前獲得患者的基線樣本。因此,，需要使用含有相同CAR分子的健康供體樣本來(lái)制備CAR-T細(xì)胞,。然后將這些CAR-T細(xì)胞與健康供體的樣本混合并用于方法開發(fā),。與血漿或血清樣本的分析不同,，在大多數(shù)情況下，冷凍全血,、骨髓,、腦脊液樣本供細(xì)胞流式細(xì)胞術(shù)分析是不可能的，樣品需要在一個(gè)非常有限的穩(wěn)定期內(nèi)處理和分析,，通常是2~3天,。市場(chǎng)上針對(duì)T細(xì)胞表面CAR分子的試劑很少，這導(dǎo)致缺乏用于鑒定抗原特異性CAR的“金標(biāo)準(zhǔn)”，并使CAR檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)化變得困難,。如CD19 - IgG -融合蛋白,，這增加了實(shí)驗(yàn)室額外的時(shí)間和費(fèi)用來(lái)生成和表征針對(duì)CAR分子的試劑。目前在臨床研究階段的CAR-T的靶標(biāo)也不限于CD19,，那么對(duì)于相關(guān)試劑的獲取也成為一個(gè)挑戰(zhàn),。雖然FDA生物分析方法驗(yàn)證指南中很好地描述了PK檢測(cè)與驗(yàn)證的要求，然而流式細(xì)胞術(shù)不同于配體結(jié)合試驗(yàn)和其他生物標(biāo)記物試驗(yàn),，其中一些驗(yàn)證參數(shù)是不適用的,，如準(zhǔn)確性和特異性。此外,，由于樣品穩(wěn)定性短,，細(xì)胞表達(dá)量變化，對(duì)PK分析方法驗(yàn)證進(jìn)行的ISR分析又是一挑戰(zhàn),。因此,，PK方法驗(yàn)證所使用的各種技術(shù)平臺(tái)的差異需要來(lái)自監(jiān)管機(jī)構(gòu)的明確指導(dǎo)?？梢詤⒖妓帉W(xué)科學(xué)界已經(jīng)發(fā)表的流式細(xì)胞分析方法驗(yàn)證的白皮書,。二、免疫原性研究 基于流式細(xì)胞技術(shù)的免疫原性主要用于抗藥抗體陽(yáng)性樣本中的中和活性檢測(cè),，并納入分層設(shè)計(jì)研究中,，以檢測(cè)和表征臨床（或非臨床）樣本的特定抗藥抗體反應(yīng)。然而,，針對(duì)流式細(xì)胞術(shù)的檢測(cè)驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn)需要將細(xì)胞的生長(zhǎng)特性,、靶點(diǎn)的表達(dá)水平和細(xì)胞/微球結(jié)合特性與儀器的配置結(jié)合起來(lái)考慮。由于細(xì)胞的使用和儀器信號(hào)輸出的潛在漂移,，檢測(cè)的接受標(biāo)準(zhǔn)可能比其他基于非流式細(xì)胞術(shù)的LBA方法更寬泛,。了解這些局限性，特別是使用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行分析驗(yàn)證及長(zhǎng)期檢測(cè)時(shí)更有利,。流式細(xì)胞術(shù)用于免疫原性檢測(cè)的要點(diǎn)在于試劑的偶聯(lián),、細(xì)胞的選擇、數(shù)據(jù)的輸出方式選擇,、確定合適的閾值以及如何用閾值來(lái)判定陽(yáng)性/陰性,。大量的熒光染料都可以用于檢測(cè)試劑（抗體、可溶性受體,、藥物,、配體或酶，可能是完整分子也可能是功能片段）的偶聯(lián),，在免疫原性檢測(cè)中可以直接標(biāo)記試劑或者使用間接標(biāo)記的二級(jí)抗體來(lái)檢測(cè),。但最重要的是試劑的結(jié)合活性以及是否可以支持長(zhǎng)期的檢測(cè),。通常都選擇直接用熒光染料標(biāo)記藥物來(lái)結(jié)合細(xì)胞表面的蛋白，在特殊情況下也會(huì)考慮對(duì)特定位點(diǎn)的定向標(biāo)記,，以避免偶聯(lián)后結(jié)合功能的丟失,，其中要注意中和抗體會(huì)抑制其結(jié)合作用。另一方面,，免疫原性的檢測(cè)試劑在偶聯(lián)時(shí)要注意摩爾耦合比（molar coupling ratios,，MCRs），它會(huì)直接影響試劑與靶點(diǎn)的親和力,。因此要對(duì)不同耦合比例的試劑與未耦合試劑進(jìn)行比較,，明確其結(jié)合活性的差異、評(píng)估染料的摻入水平和檢測(cè)性能,。通常NAb的檢測(cè)信號(hào)是下降的,，但如果藥物的作用模式會(huì)導(dǎo)致信號(hào)下降，那么中和活性則會(huì)使信號(hào)升高,，彼此是一個(gè)競(jìng)爭(zhēng)抑制的關(guān)系,。用于免疫原性測(cè)定的相關(guān)細(xì)胞系與生物治療產(chǎn)品的PK研究中對(duì)細(xì)胞系的要求是一樣的，比如對(duì)于細(xì)胞因子類的藥物,，一般會(huì)選擇細(xì)胞因子依賴的細(xì)胞株,，在檢測(cè)中可以避免干擾。細(xì)胞在培養(yǎng)中的狀態(tài)變化往往是微妙的,，隨著代次的增加對(duì)實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生的影響也需要仔細(xì)評(píng)估,。圖7中是對(duì)細(xì)胞融合狀態(tài)下結(jié)合和抑制的比較以及不同培養(yǎng)代次對(duì)對(duì)抑制率的影響?？梢钥吹綄?duì)于藥物與細(xì)胞的結(jié)合,，細(xì)胞融合狀態(tài)的變化對(duì)幾何平均熒光強(qiáng)度 （GFMI）是有明顯影響的。不同代次的細(xì)胞對(duì)強(qiáng)陽(yáng)性和弱陽(yáng)性對(duì)照的抑制率的變化有一定的波動(dòng),，尤其是對(duì)于弱陽(yáng)性對(duì)照更明顯,，但對(duì)于檢測(cè)陽(yáng)性對(duì)照（PC）抑制率是沒(méi)有影響的。另外,，GFMI還非常容易受到儀器性能的影響,，這種變化在不同儀器之間可能會(huì)高達(dá)50%，因而通常會(huì)選擇計(jì)算抑制百分比,。圖7 細(xì)胞融合狀態(tài)下結(jié)合和抑制的比較以及不同培養(yǎng)代次對(duì)對(duì)抑制率的影響[2]在流式細(xì)胞儀上的數(shù)據(jù)輸出可以是MFI或GMFI和以此計(jì)算出的抑制百分比 （1-sample signal / max signal）×100或最大信號(hào)百分比（sample signal / max signal）×100,，如需要可以扣除背景信號(hào)。不管使用那一種算法都必須使用分析閾值對(duì)樣品進(jìn)行判定,。免疫原性檢測(cè)通常是半定量的,，對(duì)于檢測(cè)中和活性的閾值通常設(shè)為使用未經(jīng)治療的患者人群或正常群體的單側(cè)95%或99%置信區(qū)間來(lái)區(qū)分樣品的中和活性陽(yáng)性和陰性,。如果在試驗(yàn)供體中觀察到反應(yīng)的高變異性,，則可以在一定限度內(nèi)評(píng)價(jià)稀釋的試驗(yàn)基質(zhì),，以使試驗(yàn)靈敏度不受影響。如果用空白供體血清建立的供體間閾值顯示出的供體間變異過(guò)多,，且不能通過(guò)進(jìn)一步稀釋供體基質(zhì)來(lái)克服,，那么就要采取第三種方法，即在10~20個(gè)特定人群血清中加入一定濃度的PC,，該濃度PC能夠產(chǎn)生1.5~2倍的抑制作用,，將這些加藥血清與未加藥血清一起在NAb試驗(yàn)中進(jìn)行檢測(cè)，所得結(jié)果可用于計(jì)算該供體人群的后/前比值,，從被測(cè)人群中獲得的最低后/前比率可以用作分析的閾值,。對(duì)于生物基質(zhì)產(chǎn)生的對(duì)閾值的干擾會(huì)出現(xiàn)兩種情況，如果樣品有非特異性活性干擾物,，在分析中其響應(yīng)值高于基質(zhì)干擾分析的閾值,；如果樣本中含有藥物特異性干擾物且缺乏任何混雜的非特異性因子，則其響應(yīng)值應(yīng)低于基質(zhì)干擾分析的閾值,。此時(shí)需要在沒(méi)有添加藥物或配體的情況下,，比較基質(zhì)/樣品對(duì)細(xì)胞的影響。對(duì)于中和抗體檢測(cè)中出現(xiàn)的基質(zhì)干擾可以參考圖8的策略,。
圖8 用于檢測(cè)藥物特異性中和抗體的基質(zhì)干擾試驗(yàn)的類型[7] 免疫原性驗(yàn)證的要求可以參考相關(guān)法規(guī)對(duì)免疫原性方法驗(yàn)證的要求,。見圖9 。圖9 免疫原性檢測(cè)驗(yàn)證建議[3]生物標(biāo)志物的檢測(cè)取決于生物標(biāo)志物的特點(diǎn)以及檢測(cè)的預(yù)期用途,，在藥物的臨床生物分析中主要有免疫細(xì)胞的分型檢測(cè)以及受體占位分析。使用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)外周血白細(xì)胞異常的表征在自體免疫,、腫瘤,、心血管和代謝疾病等治療領(lǐng)域都有應(yīng)用。白細(xì)胞異?？赡苁悄骋惶囟?xì)胞類型豐度的變化,，也可能是某一特定細(xì)胞類型受體表達(dá)的變化。這些細(xì)胞生物標(biāo)志物是慢性,、全身性炎癥或疾病的特異性生物標(biāo)志物,。在免疫調(diào)節(jié)治療的臨床試驗(yàn)中監(jiān)測(cè)這些細(xì)胞的異常狀況可作為疾病發(fā)病機(jī)制中的生物標(biāo)志物。對(duì)于流式細(xì)胞術(shù)在免疫表型分型檢測(cè)中的要點(diǎn)在于目標(biāo)群體的表征與多參數(shù)分析的準(zhǔn)確性,。對(duì)目標(biāo)群的表征依賴于在同一分析中識(shí)別并確定多種表面抗原的表達(dá),。如，針對(duì)CD20+ B細(xì)胞的治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）的藥物,。CD20在大多數(shù)B細(xì)胞淋巴瘤和所有正常B細(xì)胞上均有表達(dá),，但早期祖細(xì)胞和終末分化漿細(xì)胞除外,?？笴D20治療導(dǎo)致外周血中B細(xì)胞的短暫耗竭,。假設(shè)用CD20靶向化合物治療會(huì)導(dǎo)致自身反應(yīng)性B細(xì)胞的耗竭,，而免疫系統(tǒng)的其他部分完好無(wú)損,。在針對(duì)CD20的細(xì)胞毒性嵌合單克隆抗體利妥昔單抗（rituximab）的初步研究中，需要針對(duì)目標(biāo)細(xì)胞群進(jìn)行分析，那么首先是識(shí)別目標(biāo)細(xì)胞群,，其次是表征目標(biāo)細(xì)胞群的變化（數(shù)量或抗原），這需要在一個(gè)樣本中同時(shí)處理大量數(shù)據(jù),，那么在熒光染料的選擇上不僅要考慮儀器的激光與濾光片,，還需要考慮后期熒光補(bǔ)償?，F(xiàn)在市面上有很多已經(jīng)配比好的針對(duì)常規(guī)血細(xì)胞分型染料可供選擇。1.2 多參數(shù)數(shù)據(jù)的分析
原則上,，使用的熒光標(biāo)記種類越多,，可檢測(cè)的信息就越多,，可以將細(xì)胞亞群分得更加精細(xì)。在流式細(xì)胞圖中通常都是雙參數(shù)圖,，常規(guī)7色分析會(huì)用到2-2參數(shù)圖21個(gè)組合,，10色就會(huì)上升到40多個(gè)，24色就會(huì)到達(dá)276個(gè)組合圖,，一般來(lái)說(shuō)8色以上就可稱為高維流式分析。這時(shí)候手動(dòng)分析不僅難度大,，誤差也會(huì)隨著設(shè)門邏輯而放大,，同一個(gè)人設(shè)門策略的改變也會(huì)出現(xiàn)顯著的實(shí)驗(yàn)誤差,。有文獻(xiàn)研究了一對(duì)標(biāo)記及其設(shè)門邏輯順序?qū)K bright和CD161 DC的影響（如圖10）,，其變異性很高,。圖10 設(shè)門策略產(chǎn)生的實(shí)驗(yàn)誤差[4]改變2-2參數(shù)配對(duì)的順序不僅會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞數(shù)量的變化,，而且會(huì)導(dǎo)致門中細(xì)胞群的部分重疊，門控誤差主要是由較大的群體對(duì)較小的群體的掩蓋造成的,。因此，為了提高人工門控的可靠性,，應(yīng)該優(yōu)先選擇在頻繁表達(dá)的標(biāo)記之前顯示特定標(biāo)記的策略,。另一方面要加強(qiáng)標(biāo)準(zhǔn)化的分析流程，可以借助基于算法的多參數(shù)分析工具來(lái)完成（圖11），如Cytobank,。圖11 基于算法的多參數(shù)分析方法[Beckman]受體占位（Receptor occupancy ，RO）分析是指導(dǎo)臨床前和早期臨床活動(dòng)劑量設(shè)置的關(guān)鍵,，來(lái)自RO評(píng)估的信息用于生成綜合PK/PD模型,，以確定所研究藥物的濃度-效應(yīng)關(guān)系和劑量-效應(yīng)-時(shí)間分布，有助于建立生物治療劑的最小生物效應(yīng)水平（Minimal Biological Effect Level,，MABEL），并建立最佳的劑量和給藥方案以及安全性評(píng)估和確定適當(dāng)?shù)氖茉囌唠S訪時(shí)間,。流式細(xì)胞術(shù)是檢測(cè)受體占位率（%RO）的最佳手段。受體占位分析的要點(diǎn)在于檢測(cè)模式的選擇和驗(yàn)證要求。RO評(píng)估有兩種基本模式,。一種是評(píng)估未占用（未結(jié)合）位點(diǎn)比例的間接方法,，使用標(biāo)記熒光的藥物分子與藥物分子競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合靶點(diǎn),，稱之為“free”（圖12中分析模式1）,。第二種方法是使用識(shí)別藥物分子的熒光標(biāo)記二抗直接評(píng)估結(jié)合藥物的水平（圖12中分析模式2）,，稱為“bound”。這兩種方法都可以用來(lái)評(píng)估陽(yáng)性細(xì)胞相對(duì)于背景對(duì)照（如無(wú)熒光對(duì)照、同型對(duì)照）的比率，或者測(cè)量受體表達(dá)的熒光強(qiáng)度MFI（mean或median）。RO試驗(yàn)已經(jīng)在臨床前和臨床開發(fā)中使用,，并延續(xù)到臨床III期和上市后的研究，說(shuō)明了其在藥物開發(fā)過(guò)程中的重要性和實(shí)用性。RO分析“free”分析模式的評(píng)估是迄今為止主要使用的模式,。檢測(cè)看上去相對(duì)簡(jiǎn)單，但事實(shí)并非如此,?！癴ree”分析由兩個(gè)測(cè)試來(lái)完成，Tube 1是待測(cè)樣本+標(biāo)記藥物,，Tube 2是待測(cè)樣本+過(guò)量藥物+標(biāo)記藥物,，用于評(píng)估背景；“bound”分析包含兩個(gè)管,。Tube 3是測(cè)試樣本+標(biāo)記的二抗，Tube 4是測(cè)試樣本+過(guò)量藥物+標(biāo)記的二抗,，用于確定總受體,。從這些測(cè)量中可以計(jì)算出游離受體的百分比（% free）和結(jié)合受體的百分比（% bound），如圖13,。 雖然這兩種試驗(yàn)都可評(píng)估受體占位率,，但都有其固有的優(yōu)缺點(diǎn)?！癴ree”需要預(yù)實(shí)驗(yàn)來(lái)建立總受體水平的參考點(diǎn),。如果總受體水平在劑量設(shè)置后發(fā)生變化（如受體的內(nèi)化,、脫落或上調(diào)），該分析得出的%RO會(huì)過(guò)高或過(guò)低,。另外,，“free”檢測(cè)可以通過(guò)非競(jìng)爭(zhēng)性抗體來(lái)檢測(cè)總受體表達(dá)的變化,，但是由于抗體試劑之間的各種生物物理性質(zhì)（如不同的熒光染料,、熒光染料與蛋白質(zhì)的偶聯(lián)比、抗體結(jié)合特性等）的差異,，非競(jìng)爭(zhēng)性抗體只能檢測(cè)總受體表達(dá)比例,，而不能建立總水平的參考點(diǎn)。相比之下,，“bound”測(cè)定中總受體水平的參考點(diǎn)是在同一樣本中評(píng)估的，所測(cè)的結(jié)合%RO不受試驗(yàn)過(guò)程中總受體表達(dá)變化的影響,。如果假設(shè)抗藥二抗的背景結(jié)合在一段時(shí)間內(nèi)保持不變,，也可以用結(jié)合%RO的預(yù)劑量評(píng)估來(lái)補(bǔ)充分析，以建立一個(gè)背景值,，可用于高背景的規(guī)范化計(jì)算校正,，參考圖13中的公式4。%RO計(jì)算的基本原理是基于精密度和準(zhǔn)確度評(píng)估,，當(dāng)兩種方法中的一種比另一種有更好的總體性能時(shí),，要考慮到差異。如果% free[公式1]的性能明顯優(yōu)于% bound[公式2]，則應(yīng)該只考慮使用% free來(lái)確定%RO,，反之亦然,。如果% free和% bound在整個(gè)濃度范圍內(nèi)的精度和準(zhǔn)確度相似，則可以使用% bound和% free的算術(shù)平均值來(lái)表示RO[公式5],。如果% bound在較低濃度范圍內(nèi)的準(zhǔn)確度優(yōu)于% free范圍,，則應(yīng)考慮使用加權(quán)函數(shù)[公式6]。相反的,，如果% bound在較高濃度范圍內(nèi)具有較好的準(zhǔn)確性,，而% free在較低濃度范圍內(nèi)有較好的準(zhǔn)確性，應(yīng)考慮[公式7]中的加權(quán)函數(shù),。在實(shí)際數(shù)據(jù)分析中,，可以利用兩種模式分析各自的優(yōu)點(diǎn)來(lái)計(jì)算RO,，并隨著動(dòng)態(tài)范圍的增加而建立更精確的RO評(píng)估?？墒沟脧腎期劑量增加試驗(yàn)得到的臨床數(shù)據(jù)有更可靠的解釋,，以及對(duì)II期研究的模型預(yù)測(cè)更有利。當(dāng)然是否有必要花費(fèi)如此長(zhǎng)的時(shí)間來(lái)獲取RO信息還存在爭(zhēng)議,。大多數(shù)報(bào)道的研究只實(shí)現(xiàn)了兩種檢測(cè)模式中的一種,，并且通常是“free”。2.2 生物標(biāo)志物的驗(yàn)證要求盡管PD生物標(biāo)志物和探索性生物標(biāo)志物驗(yàn)證中很多條款不適用,，但還是盡可能去驗(yàn)證準(zhǔn)確度,、精密度、靈敏度,、特異性,、可報(bào)告范圍、相互作用和功能性特點(diǎn),。圖14中給出了表型方法驗(yàn)證的建議,，圖15給出了功能方法驗(yàn)證的建議。驗(yàn)證的程度取決于分析方法和數(shù)據(jù)的預(yù)期用途,。圖14 表型檢測(cè)相關(guān)的驗(yàn)證建議 [3]流式細(xì)胞術(shù)的數(shù)據(jù)輸出取決于所研究系統(tǒng)的生物學(xué)特性,、所提出的具體科學(xué)問(wèn)題以及結(jié)果的預(yù)期用途，因此流式細(xì)胞術(shù)的方法驗(yàn)證更具挑戰(zhàn)性,。這些挑戰(zhàn)與細(xì)胞,、試劑、細(xì)胞參考物質(zhì)缺乏和儀器的復(fù)雜性等有關(guān),。雖然針對(duì)流式細(xì)胞術(shù)“fit-for-purpose”的方法學(xué)驗(yàn)證指南還需要更多的討論,，以達(dá)成一致意見，但與LBA法和質(zhì)譜法相比,，流式細(xì)胞術(shù)對(duì)單細(xì)胞的精準(zhǔn)分析,，已經(jīng)成為生物治療藥物研發(fā)與細(xì)胞治療產(chǎn)業(yè)中必不可少的分析工具。它不僅能夠同時(shí)進(jìn)行多個(gè)參數(shù)的檢測(cè),，還能夠以不同的方式靈活地報(bào)告數(shù)據(jù),。隨著流式細(xì)胞術(shù)在生物治療藥物研發(fā)和細(xì)胞治療領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，必將提高生物醫(yī)藥相關(guān)檢測(cè)高通量,、多維度分析的可行性,，在醫(yī)藥研發(fā)過(guò)程中提供更精準(zhǔn)、更具臨床相關(guān)性的參考數(shù)據(jù),，為藥物研發(fā)作出更大貢獻(xiàn),。特別聲明：本文如有疏漏和誤讀相關(guān)指南和數(shù)據(jù)的地方，請(qǐng)讀者評(píng)論和指正,。所有引用的原始信息和資料均來(lái)自已經(jīng)發(fā)表學(xué)術(shù)期刊,，官方網(wǎng)絡(luò)報(bào)道等公開渠道,，不涉及任何保密信息。參考文獻(xiàn) [1] Litwin V, Marder P. 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