今天帶來(lái)了更詳細(xì),、深入的講解和高級(jí)玩法。

簡(jiǎn)介

軟件簡(jiǎn)介

STAMP是一款用于分析微生物分類(lèi)和功能譜的軟件,，不僅可以做統(tǒng)計(jì),，更能繪制多種圖形，方便發(fā)表使用,。

1.0于2010年發(fā)表于Bioinformatics,，被引493次；2.0于2014年1月發(fā)表于Bioinformatics,，引用483次(截止2018年5月26日),。

官網(wǎng)地址：http://kiwi.cs./Software/STAMP

最新版本2.1.3，Downloads部分可以下載適合自己系統(tǒng)：如Windows/Linux/MacOS版本的軟件,。本文內(nèi)容主要翻譯自STAMP用戶手冊(cè)v2,，2014年12月15日版本 http://kiwi.cs./Software/images/c/cd/STAMP_Users_Guide.zip ，讀者添加了自己的理解,，以及按讀者自己的學(xué)習(xí)邏輯重排,。一些章節(jié)標(biāo)注了原文頁(yè)碼，如P4代表原文第4頁(yè),。

安裝目錄中Examples目錄提供了示示例分析結(jié)果,，以及演示數(shù)據(jù)實(shí)例。

STAMP能干什么

STAMP可以現(xiàn)實(shí)不同平臺(tái)下兼容性分析數(shù)據(jù),，主要包括Beta多樣性散點(diǎn)圖,、物種豐度柱狀圖、箱線圖,，以及Post-hoc圖展示差異物種/功能,。

還可以繪制帶誤差線柱狀圖、誤差線和柱分離組合圖,、相關(guān)散點(diǎn)圖,、密度柱狀圖、P值柱狀圖等統(tǒng)計(jì)圖表,。

分析實(shí)戰(zhàn)

輸入文件

本質(zhì)上是文本的OTU表或功能組成矩陣 + 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)即可,。同時(shí)也支持biom格式。MG—RAST,、IMG/M,、CoMet、RITA等軟件的結(jié)果,。

OTU表/功能組成矩陣

最常見(jiàn)的是OTU表,、各分類(lèi)級(jí)物種組成；宏基因組的物種和功能組成表/矩陣。支持多列特征分級(jí)屬性,，但必須是嚴(yán)格的等級(jí),。多級(jí)時(shí)容易報(bào)錯(cuò)，通常只使用1或2級(jí)行名,，如下表門(mén)和屬對(duì)應(yīng)樣品中相對(duì)豐度,。

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)Metadata

一定要包括樣品名和組名，可以有多種分組方式

多組比較——腸型

安裝好軟件,，Load data打開(kāi)example中的EnterotypesArumugam目錄中的腸型數(shù)據(jù)(spf是數(shù)據(jù)矩陣,，tsv是實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì))，打開(kāi)默認(rèn)顯示PCA結(jié)果如下：

展示PC1-3之間組合的散點(diǎn)圖,。圖片大小,、關(guān)閉其它軸、圖例位置等可以下方Configure plot中設(shè)置,，圖例在右側(cè),，每組不同顏色，可在Group field中選擇實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中不同的分組,，分組可通過(guò)勾選進(jìn)行取消或選擇,，并實(shí)時(shí)顯示分析結(jié)果。(大數(shù)據(jù)時(shí),，請(qǐng)點(diǎn)擊右下角實(shí)時(shí)計(jì)算,，減少等待時(shí)間)

重現(xiàn)腸型分類(lèi)

選擇右上角Group field為Enterotype，去除后三個(gè)非主要分組,，只保留三種腸型,；同時(shí)左側(cè)的數(shù)據(jù)屬性中，Profile level選擇Genera,，現(xiàn)在我們可以看到三種腸型的不同形狀在圖中分開(kāi)比較明顯,。

屬性面板功能簡(jiǎn)介

• Parent level：標(biāo)準(zhǔn)化的總體范圍

• Profile level: 分析的具體級(jí)別，如科,、屬,、種或OTU

• Unclassified: 末分類(lèi)數(shù)據(jù)處理方法，分別為Retain保留,、Remove移除和僅用于計(jì)算比例,。不同處理方法，結(jié)果會(huì)很大差異,。

• Statistical properties：統(tǒng)計(jì)屬性,，主要包括統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)方法,，事后檢驗(yàn)方法和置信區(qū)間,，效應(yīng)大小,，多重檢驗(yàn)校正方法等的選擇,；

• Filtering: 過(guò)濾閾值,，主要是設(shè)置P值和效應(yīng)大小,。修改后，下方同步有符合條件的結(jié)果數(shù)量,。方便在查看圖表結(jié)果時(shí)只關(guān)注符合條件的features,。

圖表類(lèi)型介紹

比較常用的是兩組比較，本軟件對(duì)多組比較支持也非常好,，很容易進(jìn)一步探索數(shù)據(jù),。

• 柱狀圖：顯示每個(gè)樣品中feature的相對(duì)比例，并添加組均值,，方便查看單個(gè)Feature的數(shù)據(jù)分布,，如下圖顯示三種腸型中擬桿菌屬的相對(duì)豐度。
  

注：Feature列表下方,，可勾遠(yuǎn)Show active來(lái)只顯示符合條件的結(jié)果,。

• 箱線圖：簡(jiǎn)單快速顯示組內(nèi)數(shù)據(jù)分布。

箱線圖展示三種腸型中擬桿菌的相對(duì)豐度分布和整體統(tǒng)計(jì)P值

具體解析,，可閱讀 - 擴(kuò)增子圖表解讀-理解文章思路

• 熱圖：顯示每個(gè)Features在樣品中豐度的比例,，優(yōu)熱在于不僅顯示所有樣本的豐度值，更可以對(duì)行Features和列樣品進(jìn)行聚類(lèi)顯示之間的關(guān)系,；

• 主成分分析PCA：散點(diǎn)圖在低維空間顯示高維數(shù)據(jù)間主要差異,；

• Post-hoc圖：多組統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)的無(wú)效假設(shè)(如ANOVA或Kruskal-Wallis)是所有組相等。提供每對(duì)組間測(cè)量的P-value和效應(yīng)大小,。

擴(kuò)展柱狀圖/事后圖顯示組間兩兩比較柱狀圖,，及置信區(qū)間分布和P值。

圖片的具體參數(shù)見(jiàn)Configure plot頁(yè)面,，可在File菜單中Save plot保存圖片,，有PNG位圖，和PDF, PS,， EPS, SVG共4種矢量圖可選,，推薦PDF格式方便查看和修改。

統(tǒng)計(jì)表導(dǎo)出

我們想導(dǎo)出統(tǒng)計(jì)結(jié)果的表格,，方便發(fā)表文章作為原始數(shù)據(jù),，和進(jìn)一步分析。

View —— Multiple group statistics table

可以看到特征Feature,、P值,、假陽(yáng)性率FDR、效應(yīng)大小,、各組均值和標(biāo)準(zhǔn)差等,?？蛇x擇全部或顯示部分，Save保存表格至文件,。(P12)

其它功能

全局設(shè)置：Setting - Preferences中可設(shè)置豐度過(guò)濾,、bootstrap次數(shù)、圖標(biāo)簽截短長(zhǎng)度,、軸顏色,、其它樣本顏色、和P-value閾值等

軟件的擴(kuò)展：可編寫(xiě)添加新統(tǒng)計(jì)方法和圖表類(lèi)型

統(tǒng)計(jì)方法

關(guān)于樣本重復(fù)

需要多少樣本才能檢測(cè)統(tǒng)計(jì)顯著,？推薦閱讀：Suresh and Chandrashekara (2012) and the article “Getting the Sample Size Right” by Jeremy Miles (http://www./misc/power/),。

我們的建議是沒(méi)有最小的樣本數(shù)，但統(tǒng)計(jì)假設(shè)必須符合數(shù)據(jù)分布,。小樣本量更可能不符合假設(shè),。小樣本量也不太可能有足夠的統(tǒng)計(jì)強(qiáng)度來(lái)鑒定效應(yīng)大小。如t-test考慮每組4個(gè)樣本,，可以提供足夠的準(zhǔn)確度和精確度的信息,。

樣本數(shù)量也由樣品本身決定，如果原始樣本穩(wěn)定且測(cè)量結(jié)果精度高,，只需極少樣本可決定統(tǒng)計(jì)差異,，如不同面值硬幣間重量差異，因?yàn)樗鼈冎谱鞯木雀咔覝?zhǔn)確稱量較容易,。

生物學(xué)數(shù)據(jù)充滿了各種噪音,，物種和功能組成也容易受多種因素影響，具有低準(zhǔn)確度和精密度的特點(diǎn),。實(shí)驗(yàn)和分析每步都可能對(duì)想結(jié)果有影響,，因此我們需要生物學(xué)重復(fù)，才能鑒定組間差異,。如健康和疾病樣本,，有多種因素不可控，需要極大量樣本才可能發(fā)現(xiàn)均值和方差顯著的不同,。(P6,、原文Page|6)

多組比較

表1. STAMP中可用的多組比較方法,，其中加粗為推薦方法(STAMP官方幫助文檔P14)

分析兩組

表2. STAMP中可用的多組比較方法,，其中加粗為推薦方法(STAMP官方幫助文檔P17)

分析兩樣品

表3. STAMP中兩樣品統(tǒng)計(jì)方法,。推薦方法加粗,。CC = 連續(xù)校正,，DP = 比例差異，OR = 讓步比,，RP = 比例,。

常見(jiàn)問(wèn)題

讀入文件錯(cuò)誤

Data does not form a strick hierarchy. Child Unassigned has multiple parents.

它要求的輸入分類(lèi)級(jí)不允許在各級(jí)別有重名，而物種命名總有些不規(guī)范的級(jí)別和末命名的,，所以建議將門(mén),、綱、目,、科,、屬、OTU水平分別制作成spf文件給STAMP分析,，可確保正常使用,；

STAMP也提供了檢查不符合要求的,，非層級(jí)的分類(lèi)檢查腳本

末注釋的最好統(tǒng)計(jì)標(biāo)記為unclassified,，上文提到有多種處理方法，但沒(méi)有完美解決問(wèn)題,。

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和豐度矩陣樣品名不對(duì)應(yīng)

Metadat warnings: Missing metadat for the following samples:

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中缺失OTU表中的樣品名,，如果是人為注釋或去除掉的，可以忽略此警告,，否則仔細(xì)檢查實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)是否與矩陣中樣品名對(duì)應(yīng)

總結(jié)

分析三步曲：

整體：PCA plot,，可通過(guò)不斷篩選分組來(lái)觀察組間整體差異

多組: 組間重復(fù)數(shù)3-15個(gè)，可用bar或boxplot逐個(gè)查看顯著差異的OTUs,，大于15個(gè)最好只用boxplot,；組內(nèi)樣本波動(dòng)大用boxplot更直觀，波動(dòng)小可選barplot+error bar也很漂亮,。組間差異明顯,，組內(nèi)重復(fù)好，可選熱圖+聚類(lèi)信息更豐富,。

兩組：boxplot,，barplot用原始數(shù)據(jù)。整體可用extended barplot

軟件功能非常強(qiáng)大,，但還是些局限性：如有些步驟不能選擇原始數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì),；強(qiáng)行進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)化，這樣對(duì)部分?jǐn)?shù)據(jù)分析可能會(huì)有影響,；軟件無(wú)法保存工作狀態(tài),、上次訪問(wèn)路徑等,；新項(xiàng)目必須關(guān)閉軟件重新打開(kāi)才能開(kāi)始分析等。

Reference

• Parks DH and Beiko RG. (2010). Identifying biologically relevant differences between metagenomic communities. Bioinformatics, 26, 715-721.

• Parks DH, Tyson GW, Hugenholtz P, Beiko RG. (2014). STAMP: Statistical analysis of taxonomic and functional profiles. Bioinformatics, 30, 3123-3124.