電針通過(guò)調(diào)控微小RNA對(duì)失神經(jīng)肌萎縮大鼠肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖的影響

朱正威1,，唐成林1，李小宏2,，趙丹丹1,，楊之雪1，代妮1

(1 重慶醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院,，重慶400016;2 重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院康復(fù)科,，重慶400016)

【摘 要】 目的：觀察電針干預(yù)對(duì)失神經(jīng)肌萎縮大鼠腓腸肌中微小RNA-1(Mir-1)、微小RNA-133a(Mir-133a),、微小RNA-133b(Mir-133b),、配對(duì)盒轉(zhuǎn)錄因子Pax7,、組蛋白脫乙酰酶4(HDAC4)表達(dá)的影響,，探討電針延緩失神經(jīng)肌萎縮的機(jī)制。方法：SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組,、模型組和電針組,，每組8只。橫斷坐骨神經(jīng)制備大鼠右后肢失神經(jīng)肌萎縮模型,。電針組電針大鼠患側(cè)“足三里”“環(huán)跳”,，每次10 min，每日1次,，連續(xù)干預(yù)2周,。電針干預(yù)結(jié)束后稱(chēng)取并計(jì)算各組大鼠的腓腸肌濕重比，HE染色后測(cè)定腓腸肌纖維橫截面積,，實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)各組大鼠腓腸肌中Mir-1,、Mir-133a、Mir-133b,、HDAC4 mRNA,、Pax7 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果：造模2周后,，模型組大鼠腓腸肌濕重比和肌纖維橫截面積明顯低于假手術(shù)組(P<0.01);與模型組相比,，電針組大鼠腓腸肌濕重比和肌纖維橫截面積顯著增加(P<0.01)。與假手術(shù)組相比，模型組腓腸肌中Mir-1,、Mir-133a相對(duì)表達(dá)量降低,，HDAC4 mRNA和Mir-133b相對(duì)表達(dá)量升高(P<0.05)，pax7 p=''>0.05);電針組術(shù)側(cè)腓腸肌中Pax7,、HDAC4 mRNA相對(duì)表達(dá)量較模型組增加(P<0.05),，Mir-1、Mir-133a,、Mir-133b相對(duì)表達(dá)量較模型組減少(P<0.05),。結(jié)論：電針干預(yù)可能通過(guò)抑制失神經(jīng)肌萎縮大鼠腓腸肌中Mir-1、Mir-133a,、Mir-133b的表達(dá),，增加Pax7、HDAC4 mRNA的表達(dá),，促進(jìn)失神經(jīng)肌萎縮大鼠肌衛(wèi)星細(xì)胞的增殖,。

【關(guān)鍵詞】 肌萎縮;電針;肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白;微小RNA;腓腸肌

【中圖分類(lèi)號(hào)】 R245.9+7 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A

骨骼肌可以引導(dǎo)骨關(guān)節(jié)收縮與伸展從而產(chǎn)生骨骼的運(yùn)動(dòng)。除了運(yùn)動(dòng)功能之外,，它也具有產(chǎn)生熱能,、儲(chǔ)存蛋白、支撐保護(hù)軟組織和重要臟器的功能,。哺乳動(dòng)物由于各種原因(如車(chē)禍,、外傷、衰老等)造成骨骼肌失神經(jīng)支配后,，骨骼肌會(huì)持續(xù)萎縮和纖維化,，最終會(huì)導(dǎo)致不可逆的損傷。失神經(jīng)肌萎縮的治療十分困難,，除了移植神經(jīng)的手術(shù)方法外,，早期電刺激治療可以維持骨骼肌的收縮能力和肌纖維大小，但具體機(jī)制并不明確,，可能與骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的增殖激活和肌纖維的再生有關(guān),。肌衛(wèi)星細(xì)胞是骨骼肌的多能干細(xì)胞，一般處于靜止?fàn)顟B(tài),，但在骨骼肌受損的情況下會(huì)被激活而參與骨骼肌的再生與組織修復(fù),。骨骼肌再生與組織修復(fù)的首要階段則是肌衛(wèi)星細(xì)胞的增殖。微小RNA(microRNAs,，miRNAs)是長(zhǎng)約20~22 nt的長(zhǎng)鏈非編碼RNA序列,，通過(guò)靶向結(jié)合信使RNAs(mRNAs)來(lái)沉默靶基因[7]，從而造成靶向mRNAs的降解或者蛋白轉(zhuǎn)錄抑制,，但也有研究證明其具有積極作用,。研究表明miRNAs以一種組織特異性的方式表達(dá)，并非無(wú)處不在，只在橫紋肌表達(dá)的miRNAs稱(chēng)為肌特異性miRNAs,，包括Mir-1和Mir-133,。Mir-1、Mir-133的主要功能是抑制成肌細(xì)胞增殖,，并促進(jìn)其分化,。配對(duì)盒轉(zhuǎn)錄因子Pax7主要存在于肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖階段，其功能主要是促進(jìn)肌衛(wèi)星細(xì)胞的增殖,，防止其過(guò)早分化,。Mir-1能靶向抑制Pax7，抑制其增殖卻促進(jìn)其分化,。同樣地,，組蛋白脫乙酰酶4(recombinant histone deacetylase 4，HDAC4)也能被Mir-1所靶向抑制,，從而抑制肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖,。有研究發(fā)現(xiàn)Mir-133也對(duì)肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖有抑制作用。團(tuán)隊(duì)前期在PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路及相關(guān)分子機(jī)制的研究中證實(shí)電針對(duì)失神經(jīng)肌萎縮大鼠肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖有明顯的促進(jìn)作用,，在此基礎(chǔ)上,，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)電針干預(yù)失神經(jīng)肌萎縮大鼠，探討電針干預(yù)是否能通過(guò)調(diào)控Mir-1,、Mir-133a,、Mir-133b、Pax7,、HDAC4的表達(dá)水平,，從而促進(jìn)骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的增殖，減少骨骼肌質(zhì)量和細(xì)胞流失,，延緩失神經(jīng)肌萎縮的發(fā)展進(jìn)程。

清潔級(jí)成年健康SD雄性大鼠24只,，體質(zhì)量(250±20)g,，由重慶醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(渝)2012-0002,。于重慶醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心動(dòng)物房代養(yǎng),，分6籠飼養(yǎng)，每籠4只,，室溫(22±2)℃,，相對(duì)濕度(50±5)%，明暗12 h/12 h交替,，飲食與水自由攝取,。大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，按隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組、模型組和電針組,，每組8只,。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中動(dòng)物的處置均符合重慶醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)標(biāo)準(zhǔn)。

Trizol總RNA提取液,、Mir-X miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒,、RR037A反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒,、Mir-1,、Mir-133a、Mir-133b,、Pax7,、HDAC4和U6、β-actin引物合成(日本TAKARA公司),。SDZ-Ⅱ型電針治療儀(蘇州醫(yī)療用品廠有限公司),，柔軟型實(shí)驗(yàn)大鼠固定器(溫州原上草醫(yī)療科技有限公司)，漢醫(yī)牌無(wú)菌針灸針(北京漢醫(yī)醫(yī)療器械中心),，T100? PCR儀,、低溫高速離心機(jī)(德國(guó)西格瑪公司)，Thermo ND2000超微量核酸蛋白測(cè)定儀(上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司),，AL204型電子天平(瑞士梅特勒-托利多公司),，BX53普通正置顯微鏡、CFX Connect?熒光定量PCR檢測(cè)系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad),、Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件,、CellSens Standard圖像采集軟件(日本奧林巴斯公司)、病理切片機(jī)(上海徠卡儀器有限公司),。

采用手術(shù)橫斷坐骨神經(jīng)制備大鼠失神經(jīng)性肌萎縮模型,。以4%水合氯醛(0.8 mL/100 g)腹腔注射進(jìn)行麻醉;固定大鼠后在其右側(cè)后肢手術(shù)區(qū)域進(jìn)行備皮;于右側(cè)股后正中行一長(zhǎng)約6~8 mm的手術(shù)切口，暴露股二頭肌,，鈍性分離并暴露坐骨神經(jīng);剪斷坐骨神經(jīng)兩端并制備1.5 cm的缺口;將兩神經(jīng)斷端翻轉(zhuǎn)180°后縫合于鄰近肌組織上,，逐層縫合肌肉和皮膚。假手術(shù)組僅暴露坐骨神經(jīng)但不行神經(jīng)截?cái)嘈g(shù),。

術(shù)后第2天開(kāi)始,，每日上午10點(diǎn)以柔軟型實(shí)驗(yàn)大鼠固定器固定電針組大鼠，并參考《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》的方法,，用0.25 mm×13 mm的一次性無(wú)菌針灸針在其右側(cè)“足三里”“環(huán)跳”穴直刺進(jìn)針5~7 mm,，“足三里”連接電針儀的負(fù)極，“環(huán)跳”連接正極,，施以2 Hz,、1.0 mA的電針干預(yù),，每次10 min，每日1次,，每周7次,，共治療2周。模型組和假手術(shù)組大鼠每日以相同方法固定但不進(jìn)行電針干預(yù),。

取材：治療結(jié)束后,，以4%水合氯醛(0.8 mL/100 g)腹腔注射麻醉大鼠，完整剝離雙側(cè)腓腸肌,，吸干表面殘液并稱(chēng)重;將各個(gè)腓腸肌組織分為兩份,，一份放入液氮罐中速凍，隨后轉(zhuǎn)至-80 ℃冰箱儲(chǔ)存待測(cè),，另一份置于4%多聚甲醛溶液中固定,，待包埋后進(jìn)行形態(tài)學(xué)檢測(cè)。

腓腸肌濕重比檢測(cè)：取材時(shí)大體觀察雙側(cè)腓腸肌飽滿(mǎn)度和萎縮度,。觀察后將其置于電子天平上稱(chēng)取肌濕重,，以各自非手術(shù)側(cè)作為對(duì)照，計(jì)算各組大鼠的腓腸肌濕重比,。肌濕重比=

腓腸肌纖維橫截面積檢測(cè)：術(shù)側(cè)腓腸肌標(biāo)本經(jīng)4%多聚甲醛固定后,，經(jīng)乙醇梯度脫水、浸蠟,、包埋制備石蠟切片并進(jìn)行HE染色,。石蠟包埋、切片(厚度：3 μm)及HE染色均由重慶醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織切片室完成,。每組選取8張切片進(jìn)行400倍光學(xué)顯微鏡觀察,，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野拍照，每個(gè)視野隨機(jī)選取4個(gè)細(xì)胞,，經(jīng)Image Pro Plus 6.0圖像分析軟件計(jì)算各組大鼠腓腸肌纖維橫截面積,。

熒光定量PCR法檢測(cè)腓腸肌中Mir-1、Mir-133a,、Mir-133b,，Pax7、HDAC4 mRNA的相對(duì)表達(dá)量：取-80 ℃冰凍保存的各組大鼠術(shù)側(cè)腓腸肌組織樣本約50 mg,，以Trizol法提取總RNA;檢測(cè)總RNA濃度和純度后按RR037A反轉(zhuǎn)錄試劑盒和Mir-X miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒的操作步驟分別配置普通RNA和miRNA的反應(yīng)體系，離心后行反轉(zhuǎn)錄：37 ℃ 15 min, 85 ℃ 5 s,。96孔板加樣,上機(jī)行熒光定量PCR反應(yīng)：90 ℃ 30 s,，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s,， 95 ℃ 5 s,， 60 ℃ 1 min,，共40個(gè)循環(huán)，用CFX manager 3.1軟件獲取Ct值,。用2-ΔΔCt值表示模型組,、電針組與假手術(shù)組目的RNA表達(dá)的倍比關(guān)系。上下游引物序列見(jiàn)表1,。

采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析,，結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析,，方差齊時(shí)多重組間兩兩比較均采用Bonferroni檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析,，方差不齊時(shí)采用Dunnett’s T3檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析。以P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的標(biāo)準(zhǔn),。

模型組和電針組大鼠術(shù)側(cè)腓腸肌與假手術(shù)組相比,，飽滿(mǎn)度明顯降低，彈性減弱,，色澤欠佳,，呈進(jìn)行性肌萎縮。造模2周后模型組大鼠腓腸肌濕重比明顯低于假手術(shù)組(P<0.01),，而與模型組相比,，電針組腓腸肌濕重比增加(P<0.01)。見(jiàn)圖1,。

2.2 各組大鼠腓腸肌形態(tài)及肌纖維橫截面積比較

如圖2所示,，各組腓腸肌橫截面結(jié)構(gòu)清晰，顏色及形態(tài)均正常,。與假手術(shù)組相比,，模型組大鼠術(shù)側(cè)腓腸肌纖維萎縮變小，纖維間隙擴(kuò)大,，且肌細(xì)胞變圓,。電針組肌細(xì)胞排列較模型組規(guī)整，肌纖維直徑更大,。如圖3所示,，模型組大鼠術(shù)側(cè)腓腸肌纖維橫截面積顯著小于假手術(shù)組(P<0.01)，電針組橫截面積顯著大于模型組(P<0.01),。

2.3 各組大鼠腓腸肌中Mir-1,、Mir-133a、Mir-133b,，Pax7,、HDAC4 mRNA的相對(duì)表達(dá)量比較

如圖4所示，與假手術(shù)組相比,，模型組Mir-1,、Mir-133a相對(duì)表達(dá)量降低,，HDAC4 mRNA和Mir-133b相對(duì)表達(dá)量升高(P<0.05)，pax7 p=''>0.05),。與模型組相比,，電針組術(shù)側(cè)腓腸肌中Pax7、HDAC4 mRNA相對(duì)表達(dá)量增加(P<0.05),，Mir-1,、Mir-133a、Mir-133b相對(duì)表達(dá)量減少(P<0.05),。

失神經(jīng)肌萎縮在中醫(yī)學(xué)中屬于“痿癥”,，《素問(wèn)·痿論》中提出“治痿獨(dú)取陽(yáng)明”，意在強(qiáng)調(diào)脾胃在治療痿證中的關(guān)鍵作用,。足陽(yáng)明胃經(jīng)之合穴足三里為臨床治療“痿癥”的常用穴,，其具有主潤(rùn)宗筋作用，而宗筋主束骨而利關(guān)節(jié);環(huán)跳屬足少陽(yáng)膽經(jīng),，善于通經(jīng)活絡(luò),、行氣活血，為疏理下肢氣血經(jīng)絡(luò)的常用穴,。兩穴配伍則陽(yáng)明充盛,，氣血充足，筋脈得以濡養(yǎng),，從而使筋脈柔軟,，關(guān)節(jié)滑利，運(yùn)動(dòng)靈活,。本實(shí)驗(yàn)大鼠的失神經(jīng)肌萎縮得以延緩可能是通過(guò)電針刺激“足三里”“環(huán)跳”穴實(shí)現(xiàn)疏通筋脈,、通調(diào)氣血的作用。

大鼠去神經(jīng)支配后出現(xiàn)的骨骼肌萎縮,，以肌肉質(zhì)量明顯減輕,、肌纖維萎縮變細(xì)甚至消失為病理特征。實(shí)驗(yàn)中判斷肌萎縮的程度通常使用肌濕重比,、肌纖維橫截面積為參考指標(biāo),，本實(shí)驗(yàn)顯示電針干預(yù)能有效延緩術(shù)側(cè)腓腸肌濕重比和纖維截面積的下降，提示電針干預(yù)能有效延緩失神經(jīng)肌萎縮,。

骨骼肌的再生主要依靠肌衛(wèi)星細(xì)胞,，肌衛(wèi)星細(xì)胞以配對(duì)盒轉(zhuǎn)錄因子Pax7的表達(dá)為特征。研究表明Pax7對(duì)肌衛(wèi)星細(xì)胞的生存和增殖是必不可少的,，并且可以防止肌源祖細(xì)胞的過(guò)早分化,。HDAC4是連接神經(jīng)元活性和肌肉轉(zhuǎn)錄程序的關(guān)鍵因子。在骨骼肌再生過(guò)程中,，Pax7和HDAC4對(duì)肌衛(wèi)星細(xì)胞的增殖起促進(jìn)作用,。研究[20]顯示，敲除HDAC4的肌衛(wèi)星細(xì)胞會(huì)引起Pax7及其靶基因表達(dá)的減少,，從而抑制肌衛(wèi)星細(xì)胞的增殖,，HDAC4的減少會(huì)降低肌衛(wèi)星細(xì)胞的增殖率。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,，在失神經(jīng)支配的第2周,，大鼠術(shù)側(cè)腓腸肌中Pax7變化不明顯，HDAC4有增高趨勢(shì),，提示肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖不明顯,，電針干預(yù)后HDAC4、Pax7表達(dá)水平明顯高于模型組,，進(jìn)而推斷電針干預(yù)可能促進(jìn)了肌衛(wèi)星細(xì)胞的增殖水平從而抑制了失神經(jīng)萎縮進(jìn)程,。

肌特異性miRNAs對(duì)骨骼肌的增殖和再生也有重要的作用，Mir-1,、Mir-133屬于肌特異性miRNAs,。許多Mir-1的靶基因都與增殖相關(guān)，有研究發(fā)現(xiàn)Mir-1的過(guò)表達(dá)會(huì)抑制肌衛(wèi)星細(xì)胞的增殖潛能,，但抑制Mir-1則會(huì)促進(jìn)肌衛(wèi)星細(xì)胞的增殖,。除此以外，Mir-1在成肌細(xì)胞中靶向調(diào)節(jié)HDAC4,，從而促進(jìn)了衛(wèi)星細(xì)胞的分化但抑制其增殖作用;Mir-133與肌衛(wèi)星細(xì)胞和肌肉再生有密切聯(lián)系,，敲除Mir-133a的小鼠出現(xiàn)線粒體功能障礙和肌纖維形態(tài)受損[23]，Mir-133a,、Mir-133b會(huì)通過(guò)絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路抑制成肌細(xì)胞的增殖,。在肌生成的早期階段，MAPKs對(duì)Mir-133a,、Mir-133b的負(fù)調(diào)節(jié)作用也維持了細(xì)胞的增殖功能[24],。Mir-1和Mir-133a會(huì)通過(guò)調(diào)控HDAC4的方式來(lái)影響肌衛(wèi)星細(xì)胞的增殖和骨骼肌再生，抑制Mir-1和Mir-133a會(huì)靶向增加HDAC4的表達(dá),進(jìn)而促進(jìn)肌衛(wèi)星細(xì)胞的增殖,。本實(shí)驗(yàn)表明,，在失神經(jīng)支配的第2周，大鼠術(shù)側(cè)腓腸肌中Mir-1和Mir-133a降低且HDAC4增高,，提示肌衛(wèi)星細(xì)胞處于增殖狀態(tài),。電針組Mir-1、Mir-133a,、Mir-133b表達(dá)水平明顯降低,，且HDAC4顯著升高，說(shuō)明電針干預(yù)后加速了骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的增殖,。

綜上所述,，電針干預(yù)失神經(jīng)大鼠延緩肌萎縮進(jìn)程可能是通過(guò)抑制Mir-1,、Mir-133a、Mir-133b而靶向調(diào)節(jié)Pax7,、HDAC4的表達(dá)水平,，從而增加肌衛(wèi)星細(xì)胞的增殖潛能，減少骨骼肌質(zhì)量的下降,，維持了肌纖維的結(jié)構(gòu),，最終延緩了失神經(jīng)支配的肌萎縮進(jìn)程。但是電針干預(yù)通過(guò)抑制Mir-1,、Mir-133a,、Mir-133b而調(diào)控HDAC4、Pax7表達(dá)的明確關(guān)系,，還需進(jìn)一步的研究證明,。