泛癌分析識(shí)別Siglec-15表達(dá)特征,、預(yù)后價(jià)值和免疫特征
唾液酸結(jié)合免疫球蛋白樣凝集素15 （Siglec-15）被認(rèn)為是一種新的抗腫瘤靶點(diǎn),，可與程序性細(xì)胞死亡1配體1（PD-L1）相媲美,。然而，人們對(duì)Siglec-15知之甚少,。本工作的研究目的是利用公共數(shù)據(jù)庫(kù)中的多組學(xué)生物信息學(xué)了解其表達(dá)特征,、預(yù)后價(jià)值、免疫浸潤(rùn)模式和生物學(xué)功能,，并在肺癌患者中進(jìn)行驗(yàn)證,。對(duì)TCGA和Genotype-Tissue Expression portals的綜合分析顯示，Siglec-15在癌癥中過(guò)表達(dá),。利用cBioportal和UALCAN進(jìn)行遺傳和表觀改變分析,，結(jié)果顯示Siglec-15在遺傳和表觀水平上受到調(diào)控。生存分析顯示,，高表達(dá)的Siglec-15與腫瘤的有利或不利預(yù)后相關(guān)（取決于不同類型和亞型的癌癥）,。利用CIBERSORT分析免疫微環(huán)境成分，發(fā)現(xiàn)免疫細(xì)胞與Siglec-15之間的相關(guān)性在不同癌癥類型中存在顯著性差異,?；蚣患治鲲@示，Siglec- 15參與免疫,、代謝,、癌癥和傳染病的相關(guān)通路。免疫組化顯示,，Siglec- 15陽(yáng)性表達(dá)的肺癌患者無(wú)進(jìn)展生存期短,，同時(shí)CD20 + B和樹(shù)突狀細(xì)胞浸潤(rùn)減少。RT-qPCR結(jié)果顯示,，過(guò)表達(dá)Siglec- 15與趨化因子信號(hào)通路的激活相關(guān),。綜上所述,，Siglec- 15可以作為一個(gè)重要的預(yù)后生物標(biāo)志物，并在腫瘤中發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用,。回顧性收集了2013年1月至2013年5月在中國(guó)天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院行根治性（R0）切除術(shù)并組織學(xué)診斷為L(zhǎng)UAD的103例患者的資料。所有患者均行R0切除術(shù)及淋巴結(jié)清掃,。根據(jù)國(guó)際肺癌研究協(xié)會(huì)第八版TNM分期系統(tǒng)對(duì)淋巴結(jié)和肺癌分期進(jìn)行分類,。TCGA的截至2018年的33種癌癥類型的1.1萬(wàn)多個(gè)腫瘤,。獲取了基因表達(dá),、甲基化、拷貝數(shù)變異數(shù)據(jù)集和臨床數(shù)據(jù),。從UCSC Xena下載GTEx和TCGA的RNA-seq數(shù)據(jù),。使用R包limma進(jìn)行差異表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)Siglec-15在全腫瘤表達(dá)中具有顯著差異,。3. 拷貝數(shù)變異和突變數(shù)據(jù)使用cBioPortal提供的基因組數(shù)據(jù),，分析了不同癌癥中Siglec-15的基因拷貝數(shù)變異（CNA）和基因突變。使用UALCAN network （http://ualcan.path.）來(lái)分析腫瘤組織和正常組織的Siglec-15啟動(dòng)子甲基化水平使用 Kaplan–Meier plotter （http:///analysis/）分析在不同癌型中Siglec-15的預(yù)后價(jià)值,。使用TISIDB（http://cis./TISIDB/index.php）來(lái)分析Siglec-15基因在不同免疫亞型中的表達(dá),，包括C1（創(chuàng)面愈合），C2 （IFN-阻斷顯性）,，C3（炎性）,、C4（淋巴細(xì)胞消耗）、C5（免疫安靜）,、C6 （TGF-多核主導(dǎo)）亞型,，和TCGA不同分子亞型腫瘤樣本中的Siglec-15基因表達(dá)。使用CIBERSORT （https://cibersort./）來(lái)評(píng)估TCGA和GEO檢測(cè)的腫瘤腫塊中腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞的相對(duì)豐度,。使用TCGA的RNA-seq數(shù)據(jù),，對(duì)Siglec-15及其共表達(dá)基因進(jìn)行GSEA，KEGG和GO通路分析發(fā)現(xiàn)潛在通路,。1. 在人類癌癥中的Siglec-15 mRNA表達(dá)整合了TCGA的腫瘤樣本和GTEx數(shù)據(jù)庫(kù)的正常樣本，來(lái)識(shí)別Siglec-15 mRNA的表達(dá)特征,。發(fā)現(xiàn)在大多數(shù)癌癥類型中,，Siglec-15上調(diào)（圖1a）。當(dāng)只分析TCGA的腫瘤和鄰近組織時(shí),，發(fā)現(xiàn)在COAD,、HNSC、KICH,、KIRP,、LUAD,、READ、SKCM,、THCA和UCEC的轉(zhuǎn)移組織中,，Siglec-15表達(dá)上調(diào)。通過(guò)TIMER數(shù)據(jù)庫(kù)分析,，Siglec-15在PRAD中下調(diào),。然后使用Oncomine分析Siglec-15在不同癌型的表達(dá)情況。然后分析了不同臨床分期和分子亞型的Siglec-15的mRNA表達(dá)模式（圖1b）,。Siglec-15在BRCA,、KIRP、PCPG,、SKCM和ESCAd的不同分子亞型中的表達(dá)差異顯著（圖1c）,。在其他癌癥中，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)Siglec-15表達(dá)與癌癥分期或分子亞型之間的關(guān)聯(lián),。圖1.人類癌癥中Siglec-15的轉(zhuǎn)錄水平
2. 不同人類癌癥中Siglec-15的CNA和DNA甲基化改變遺傳和表觀遺傳變化在調(diào)控腫瘤發(fā)育和免疫耐受中發(fā)揮著重要作用,。利用cBioPortal進(jìn)一步研究了Siglec-15的遺傳改變。發(fā)現(xiàn)OV,、HNSC,、SARC和UCEC等中Siglec-15高表達(dá)（圖2a）。在這些癌癥中,，Siglec-15基因改變的趨勢(shì)與其mRNA水平一致,。為了探討CNA對(duì)基因表達(dá)的影響，分析了基因表達(dá)與相對(duì)線性拷貝數(shù)值的關(guān)系,。結(jié)果顯示,，在COAD、HNSC和LUSC等癌型中,，Siglec-15表達(dá)與CNA呈正相關(guān),，而在SARC和PAAD中呈負(fù)相關(guān)（圖2b）。接下來(lái)確定了表觀遺傳機(jī)制是否在調(diào)控Siglec-15 mRNA表達(dá)中起作用,。為了將啟動(dòng)子DNA甲基化水平與Siglec-15表達(dá)聯(lián)系起來(lái),，進(jìn)行了DNA甲基化狀態(tài)與Siglec-15表達(dá)的相關(guān)性分析（圖2c）。在THCA,、BLCA和UCEC等癌型中,，DNA甲基化與Siglec-15表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)。然后使用UALCAN研究了癌組織和癌旁正常組織中Siglec-15啟動(dòng)子DNA甲基化狀態(tài)的差異（圖2d）,。在LUAD,、CESC和COAD等癌型中，癌組織中Siglec-15甲基化比鄰近正常組織少,。因此,，在某些癌癥中,，Siglec-15 mRNA的異常升高可能是基因改變和DNA甲基化水平降低的結(jié)果。
圖2.人類癌癥中Siglec-15的CNA和DNA甲基化和3. Siglec-15的mRNA表達(dá)相關(guān)性分析和預(yù)后價(jià)值結(jié)果顯示,，在不同類型的癌癥中,，Siglec-15具有不同的預(yù)后價(jià)值（圖3）。在TCGA數(shù)據(jù)中,，發(fā)現(xiàn)Siglec-15表達(dá)上調(diào)與BLCA,、BRCA和HNSC等癌型的更長(zhǎng)OS相關(guān)，與BRCA,、LIHC,、OV和UCEC的長(zhǎng)無(wú)復(fù)發(fā)生存期（RFS）相關(guān)（圖3a）。Siglec-15表達(dá)上調(diào)與KIRC,、PAAD和SARC短O(píng)S相關(guān),，與PAAD和SARC的短RFS相關(guān)（圖3b）,。接下來(lái)分析了GEO和其他項(xiàng)目的ChIP和RNAseq數(shù)據(jù),，發(fā)現(xiàn)高Siglec-15的mRNA表達(dá)對(duì)BRCA-luminal A、BRCA-luminal B,、OV和STAD-diffuse有較好的預(yù)后（圖3c）,。高Siglec-15的mRNA表達(dá)預(yù)測(cè)LUAD、BRCA-basal,、BRCA-Her2+和STAD較差預(yù)后（圖3d）,。
圖3. Kaplan-Meier分析評(píng)估的Siglec-15的預(yù)后意義4. Siglec-15 的mRNA表達(dá)與腫瘤免疫微環(huán)境的關(guān)系接下來(lái)分析了Siglec-15與腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞之間的關(guān)系（圖4a）。首先通過(guò)CIBERSORT算法評(píng)估了TCGA中33種癌癥的免疫微環(huán)境成分,。根據(jù)Siglec-15與免疫細(xì)胞關(guān)系的聚類熱圖顯示,，在一些癌癥中，尤其與調(diào)節(jié)性T細(xì)胞呈正相關(guān),，與巨噬細(xì)胞的相關(guān)性大多為陽(yáng)性,。而在BLCA和ACC中與巨噬細(xì)胞、腎上腺皮質(zhì)癌呈負(fù)相關(guān),。由于其抑制T細(xì)胞的功能,，所以接下來(lái)重點(diǎn)研究了Siglec-15和CD8 + T細(xì)胞之間的關(guān)系。在ACC中,，Siglec-15與CD8 + T細(xì)胞呈顯著正相關(guān),，而在BRCAbasal、THCA和UCS中,，Siglec-15與CD8 + T細(xì)胞呈顯著負(fù)相關(guān),。接下來(lái)使用GEO的多個(gè)數(shù)據(jù)分析了Siglec-15與免疫微環(huán)境之間的關(guān)系（圖4b）。GSE31684中,，Siglec-15與記憶B細(xì)胞正相關(guān),，巨噬細(xì)胞（M0, M1）呈負(fù)相關(guān),；與BRCA-Basal的γδT cells正相關(guān)；在LUAD中與巨噬細(xì)胞（M0）正相關(guān),，與TCGA一致,。利用免疫亞型的分子分型，研究了不同免疫亞型中Siglec-15 mRNA的表達(dá),。在C1（創(chuàng)面愈合）,、C2（干擾素-γ顯性）、C3（炎癥）,、C4（淋巴細(xì)胞耗盡）,、C5（免疫沉默）和C6 （TGF-β顯性）中的表達(dá)有顯著差異（圖4c）。在不同免疫亞型中Siglec-15的差異表達(dá)可能部分解釋了為什么Siglec-15在各種癌癥的預(yù)后中發(fā)揮著不同的作用,。圖4. Siglec-15表達(dá)與腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞相關(guān)分析為了進(jìn)一步研究Siglec-15的潛在功能,，對(duì)許多癌癥類型進(jìn)行了KEGG和GO GSEA富集分析（圖5a）。免疫相關(guān)通路在大部分癌癥中高度富集,。Siglec-15顯著涉及“趨化因子信號(hào)通路”,、“JAK-STAT信號(hào)通路”和“NF-kappa B信號(hào)通路”等通路的激活。GO分析顯示,，在大多數(shù)癌癥中,，Siglec-15對(duì)免疫相關(guān)的BP、CC和MF均有影響（圖5b）,。在GO MF條目,，細(xì)胞因子相關(guān)的MFs在SARC、TGCT和UVM等癌型中富集（圖5c）,。在CC分類,，“質(zhì)膜的外側(cè)面”、“質(zhì)膜的細(xì)胞質(zhì)側(cè)”和“細(xì)胞表面”等是主要富集的條目（圖5d）,。6. LUAD中Siglec-15特征的初步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證為驗(yàn)證上述結(jié)果,，重點(diǎn)研究了在LUAD中Siglec-15的表達(dá)、預(yù)后價(jià)值,、與免疫細(xì)胞的關(guān)系及相關(guān)通路,，并利用天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院的組織標(biāo)本進(jìn)行了體外實(shí)驗(yàn)。首先通過(guò)RT-qPCR檢測(cè)20份配對(duì)的LUAD組織樣本中Siglec-15的表達(dá),。結(jié)果顯示,，在原發(fā)腫瘤組織中，Siglec-15表達(dá)明顯上調(diào)（圖6a）,。之前的分析顯示,，Siglec-15與“趨化因子信號(hào)通路”、“細(xì)胞因子受體相互作用”、“細(xì)胞因子產(chǎn)生”和“調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的產(chǎn)生”的激活相關(guān)（圖6b）,。接下來(lái)主要集中在“趨化因子信號(hào)通路”,，并通過(guò)對(duì)20個(gè)LUAD組織樣本進(jìn)行RT-qPCR來(lái)驗(yàn)證它（6c）。趨化因子信號(hào)通路（CXCR3,、GNAI2,、RAC2和MMP9）及其下游PI3 K-AKT信號(hào)通路（AKT3、LPAR6和CDK6）的基因表達(dá)與Siglec-15呈正相關(guān)趨勢(shì),。PI3 K與Siglec-15 表達(dá)顯著正相關(guān),。然后把癌組織分成兩組（Siglec-15高、低）來(lái)評(píng)估通路中關(guān)鍵基因的mRNA表達(dá)水平,。PI3 K在Siglec-15高組高表達(dá)（p < .05）,。同時(shí)，對(duì)103例LUAD標(biāo)本進(jìn)行免疫組化以評(píng)估Siglec-15的表達(dá)和預(yù)后價(jià)值,?；颊叩娜丝趯W(xué)特征及Siglec-15表達(dá)與臨床病理因素的關(guān)系見(jiàn)表1。經(jīng)Fisher精確檢驗(yàn),，Siglec-15陽(yáng)性表達(dá)與腫瘤大小,、淋巴轉(zhuǎn)移、TNM分期,、吸煙指數(shù),、年齡和性別無(wú)關(guān)。共有17例（16.5%）患者的Siglec-15染色呈陽(yáng)性,，分為膜陽(yáng)性和膜陰性（表1）。具有代表性的陰性和陽(yáng)性標(biāo)本在200倍和400倍放大鏡下拍攝（圖6d）,。T分型,、N分型和臨床分期是確定OS和PFS的危險(xiǎn)因素（表2）。生存曲線顯示,，Siglec-15陽(yáng)性表達(dá)的患者PFS不佳,。陽(yáng)性和陰性患者的OS無(wú)顯著差異（圖6e）。此外,，根據(jù)臨床病理因素對(duì)選擇的LUAD患者亞組研究了Siglec-15的預(yù)后價(jià)值（表3）,。接下來(lái)用免疫組化來(lái)評(píng)估88例LUAD標(biāo)本中Siglec-15陰性和陽(yáng)性患者的相對(duì)免疫細(xì)胞浸潤(rùn)水平（圖6f, 6g）。結(jié)果表明,，陰性患者的B細(xì)胞和DCs的浸潤(rùn)更強(qiáng),。還發(fā)現(xiàn)Siglec-15表達(dá)與B細(xì)胞和DCs呈負(fù)相關(guān)，這與TCGA的結(jié)果一致,。然后,，進(jìn)一步用RTqPCR檢測(cè)這些基因的表達(dá)情況。在20個(gè)LUAD組織中，Siglec-15與CD68,、CD163和 FoxP3呈正相關(guān),。
圖6.LUAD中Siglec-15特征的初步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證
表1.患者臨床參數(shù)及其與Siglec-15表達(dá)的關(guān)系 
表2.LUAD患者的單因素生存分析 
表3.不同亞型中Siglec-15表達(dá)的單因素生存分析 本工作利用公共數(shù)據(jù)庫(kù)中的基因表達(dá)、拷貝數(shù),、甲基化數(shù)據(jù)等對(duì)新的抗腫瘤靶點(diǎn)Siglec-15的表達(dá)特征,、預(yù)后價(jià)值、免疫浸潤(rùn)模式和生物學(xué)功能進(jìn)行分析,，并在肺癌患者中進(jìn)行驗(yàn)證,。基因表達(dá)分析顯示,，Siglec-15在癌癥中過(guò)表達(dá),。遺傳和表觀改變分析顯示Siglec-15在遺傳和表觀水平上受到調(diào)控。生存分析顯示,，高表達(dá)的Siglec-15與腫瘤的有利或不利預(yù)后相關(guān),。同時(shí)免疫細(xì)胞與Siglec-15之間的相關(guān)性在不同癌癥類型中存在顯著性差異。Siglec- 15參與免疫,、代謝,、癌癥和傳染病的相關(guān)通路。免疫組化結(jié)果說(shuō)明,，Siglec- 15陽(yáng)性表達(dá)的肺癌患者無(wú)進(jìn)展生存期短,。
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