非小細胞肺癌中的預(yù)后選擇性mRNA剪接特征

背景

蛋白質(zhì)多樣性對于在真核細胞中產(chǎn)生顯著的調(diào)節(jié)和功能復(fù)雜性是至關(guān)重要的,。pre-mRNA的選擇性剪接是用有限的一組基因產(chǎn)生mRNA異構(gòu)體的普遍機制,。選擇性剪接是大多數(shù)人類多外顯子基因的內(nèi)含子被刪除，特定的外顯子被選擇性地包括或排除在外的過程,。除了蛋白質(zhì)多樣性之外,，還通過引入導(dǎo)致降解的提前終止密碼子的選擇性剪接來調(diào)節(jié)mRNA異構(gòu)體的翻譯降低。 因此,，選擇性剪接是一個重要的過程,，剪接模式的變化與蛋白質(zhì)功能密切相關(guān)。

肺癌是最常見的癌癥事件,，也是中國和世界范圍內(nèi)癌癥死亡的主要原因,。非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）是肺癌最常見和異質(zhì)性的亞型,，包括肺腺癌（LUAD）和肺鱗狀細胞癌（LUSC）,。然而，與其他基因組數(shù)據(jù),，如拷貝數(shù)變異,，DNA甲基化和基因表達不同，盡管其在癌癥中發(fā)揮重要作用,，但仍缺乏系統(tǒng)分析選擇性剪接的方法,。癌癥患者選擇性剪接的全基因組譜分析,，特別是非小細胞肺癌中，仍十分匱乏,。

癌癥基因組圖譜（TCGA）項目為調(diào)查癌癥中的選擇性剪接模式提供了豐富的資源,。外顯子，剪接和轉(zhuǎn)錄本異構(gòu)體表達水平可從TCGA Data Portal獲得,。本文系統(tǒng)地分析了TCGA中491個LUAD和471個LUSC隊列中的全基因組選擇性剪接事件,，發(fā)現(xiàn)了一些生存相關(guān)的選擇性剪接事件。更重要的是,，LUAD,，LUSC和合并的NSCLC患者的預(yù)后預(yù)測因子的構(gòu)建具有高性能，并在LUAD和LUSC中發(fā)現(xiàn)了可能是潛在機制的有趣的剪接網(wǎng)絡(luò),。

數(shù)據(jù)

TCGA數(shù)據(jù)庫中LUAD和LUSC患者的RNA-seq數(shù)據(jù)和用于生存分析的患者的臨床信息,。

結(jié)果

1、整合LUAD和LUSC患者的mRNA選擇性剪接事件譜

對TCGA的491例LUAD患者和471例LUSC患者深入分析整合的mRNA剪接事件譜,。使用SpliceSeq工具分析mRNA剪接模式,，選擇性剪接事件包括七種類型，Exon Skip (ES), Mutually Exclusive Exons (ME), Retained Intron (RI), Alternate Promoter(AP), Alternate Terminator (AT), Alternate Donor site (AD)和Alternate Acceptor site (AA).

在LUAD中,，在10367個基因中檢測到45062個mRNA剪接事件,，其中在6075個基因中包含17903個ES，在1585個基因中包含2781個RI,，在3304個基因中包含8993個AP,，在3407個基因中包含8549個AT，在1995個基因中包含3057個AD,，在2302個基因中包含3559個AA,，在202個基因中包含220個ME; 在LUSC中，在10558個基因中檢測到50732個mRNA剪接事件,，其中包括6638個基因中的22737個ES,，1757個基因中的2862個RI，3598個基因中的9302個AP,，3591個基因中的8581個AT,，2200個基因中的3263個AD，2559個基因中的3752個AAs和215個基因中的235個ME,。

LUSC中的選擇性剪接事件比LUAD中的更加頻繁,。這些結(jié)果還表明，一個基因可能有幾種類型的mRNA剪接事件,，ES是主要的類型,，將近一半的選擇性剪接事件是ES事件。

2,、LUAD和LUSC中生存相關(guān)的選擇性剪接事件

在研究mRNA剪接事件的預(yù)后價值之前,，進行了單因素生存分析以評估臨床參數(shù)與LUAD和LUSC結(jié)局的關(guān)系。在LUAD隊列中,，T分期,，N分期和TNM分期顯著與OS相關(guān); 在LUSC隊列中，M分期與OS顯著相關(guān),。這個初步評估的結(jié)果表明生存數(shù)據(jù)是有信息量的并且是適當?shù)挠脕磉M行進一步的分子研究,。

然后對LUAD和LUSC隊列中的選擇性剪接事件與OS的關(guān)聯(lián)進行了詳細研究。分別使用LUAD和LUSC隊列中的可變剪接事件進行單變量生存分析,。結(jié)果發(fā)現(xiàn)LUAD和LUSC分別有3691個和2403個生存相關(guān)的選擇性剪接事件（P <>

注意到一個基因可能有兩個或兩個以上與患者生存顯著相關(guān)的事件,。 因此，生成了UpSet圖,，一個更加可擴展的替代Venn圖的用于可視化交集的圖,。有趣的是，一個基因可能有多達四種與患者存活顯著相關(guān)的選擇性剪接事件,。

將LUAD和LUSC中最顯著的生存相關(guān)基因?qū)隿ytoscape產(chǎn)生基因相互作用網(wǎng)絡(luò),。基因網(wǎng)絡(luò)的分析揭示了重要的癌癥途徑,。

3,、LUAD和LUSC患者的預(yù)后預(yù)測因子

作者選擇了七種類型中最重要的生存相關(guān)的選擇性剪接事件作為候選。為了消除預(yù)后基因模型中可能不是獨立因素的事件,，分別對七種類型的候選剪接事件應(yīng)用多變量Cox回歸模型,。

獨立的預(yù)后選擇性剪接事件被進一步分析來建立LUAD和LUSC的最終預(yù)后預(yù)測因子。 ROC曲線也被用來比較這些預(yù)后模型的效率,。最終預(yù)后預(yù)測因子確實在區(qū)分患者的良好或較差生存方面表現(xiàn)出更好的表現(xiàn)（圖5）,。ROC曲線證實最終的使用所有類型可變剪接預(yù)測因子具有最高的效率，與在特定類型的可變剪接上構(gòu)建的其他模型相比,。

 4,、NSCLC患者的預(yù)后預(yù)測因子

為了構(gòu)建適用于非小細胞肺癌患者的預(yù)后預(yù)測指標，在臨床實踐中更容易和更有價值,，選擇了LUAD和LUSC隊列中重疊的生存相關(guān)的選擇性剪接事件（P <>

這種預(yù)后預(yù)測因子在NSCLC和LUAD或LUSC中都表現(xiàn)良好,。在非小細胞肺癌患者中的ROC曲線下面積為0.817，略低于LUAD（AUC = 0.820）,，略高于LUSC（AUC = 0.813）,。雖然這個預(yù)后預(yù)測因子與LUAD和LUSC特異性模型（0.817 vs. 0.940和0.960）相比稍弱一些，這一預(yù)后指標在臨床實踐中仍具有很大的應(yīng)用潛力,。

5,、生存相關(guān)的選擇性剪接事件網(wǎng)絡(luò)

接下來，分別對LUAD和LUSC中194個和327個最顯著的生存相關(guān)的選擇性剪接事件的剪接調(diào)控網(wǎng)絡(luò)進行了表征,。具體而言,，作者考察這些選擇性剪接事件中是否有很大一部分可能受到NSCLC組織中表達改變的一些關(guān)鍵剪接因子的調(diào)控,。使用TCGA中LUAD和LUSC 的level 3的RNA-seq數(shù)據(jù)計算的基因表達水平，鑒定了在LUAD和LUSC中基因表達水平與OS顯著相關(guān)的51和11個剪接因子,。

此外,，生存相關(guān)剪接因子的基因表達水平與生存相關(guān)的剪接事件的PSI值之間的相關(guān)性通過Spearman方法進行計算。相關(guān)網(wǎng)絡(luò)被構(gòu)建,，且只有顯著的相關(guān)性被展示,。在LUAD的相關(guān)網(wǎng)絡(luò)中，49個生存相關(guān)剪接因子（紫色點）的表達與75個生存相關(guān)的選擇性剪接事件顯著相關(guān),，其中37個與患者的良好存活（綠點）顯著相關(guān),，而38個與患者存活率差顯著相關(guān)（紅點）。在LUSC相關(guān)網(wǎng)絡(luò)中,，9個生存相關(guān)剪接因子（紫色點）的表達與75個生存相關(guān)的剪接事件顯著相關(guān),，其中29個與患者良好生存顯著相關(guān)（綠點），46個與患者存活率差顯著相關(guān)（紅點）,。

6,、癌癥特異性和臨床分期相關(guān)的選擇性剪接事件

雖然本研究主要集中在非小細胞肺癌預(yù)后相關(guān)的選擇性剪接事件，LUAD和LUSC癌癥特異性和臨床分期相關(guān)的選擇性剪接事件也被分析,，以提供異常選擇性剪接的概述和重要的附加信息,。與正常對照相比，LUAD和LUSC中分別有9284和13290個差異剪接的選擇性剪接事件,。此外,，在LUAD和LUSC中，數(shù)十至數(shù)千個選擇性剪接事件與臨床分期（包括T分期,，N分期和M分期）顯著相關(guān),。許多這些異常的選擇性剪接事件也與患者的總生存相關(guān)。例如,，與正常對照相比,，LUAD和LUSC中差異性剪接的CHCHD7是NSCLC患者預(yù)后的獨立因子。

總結(jié)

盡管檢測患者事件的能力有限,，本文發(fā)現(xiàn)了生存相關(guān)的選擇性剪接事件可以用來構(gòu)建NSCLC中高性能的風險分層的預(yù)后預(yù)測因子,，這在臨床實踐中是有前景的。此外,，本文還在LUAD和LUSC患者中發(fā)現(xiàn)了獨特的剪接相關(guān)網(wǎng)絡(luò),。這些結(jié)果對于揭示RNA剪接在非小細胞肺癌發(fā)生中的功能貢獻將是最有價值的。RNA剪接模式的深入分析可能確實揭示了新的癌癥驅(qū)動因素,，并提供了這些途徑的機制見解,。

參考文獻

Li Y, Sun N, Lu Z, Sun S, Huang J, Chen Z and He J. Prognostic alternative mRNA splicing signature in non-small cell lung cancer. Cancer letters. 2017; 393:40-51.

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