硫氧還蛋白還原酶（TrxR）是一類存在于哺乳動(dòng)物體內(nèi)的硒蛋白,，主要以在胞質(zhì)中的TrxR1,、在線粒體中的TrxR2和在睪丸中表達(dá)的硫氧還蛋白谷胱甘肽還原酶（TGR）三種形式存在。胞質(zhì)中的TrxR系統(tǒng)由TrxR1,、硫氧還蛋白（Trx）和NADPH組成,。其中，TrxR1在黑色素瘤,、肺癌和前列腺癌等許多癌癥中過(guò)表達(dá),。因此，研究選擇性檢測(cè)TrxR1的方法具有重要的意義,。

近日,，美國(guó)波特蘭州立大學(xué)的Robert M. Strongin和俄勒岡健康與科學(xué)大學(xué)的Pamela B. Cassidy合作，通過(guò)將半萘羅丹明類染料與鏈狀二硒化物淬滅劑偶聯(lián),，合成了第一個(gè)基于二硒化物的熒光探針1a,，用于選擇性檢測(cè)TrxR的活性。其中,，TrxR還原二硒鍵,，使探針的熒光開(kāi)啟。相關(guān)成果以“ADiselenide turn-on Fluorescent Probe for the Detection of Thioredoxin Reductase”為題發(fā)表在Angew. Chem. Int. Ed.上（DOI: 10.1002/anie.202004094）,。

首先,，作者使用AutoDock Vina和UCSF Chimera的對(duì)接探究了不同構(gòu)型探針的結(jié)合能以及從探針到Sec（U498）殘基的距離（Figure 1）。結(jié)果表明,，與含有二硫鍵的探針1b相比,，TrxR對(duì)1a的親和力更高。

（來(lái)源：Angew. Chem. Int. Ed.）

二硒鍵探針1a的選擇不僅實(shí)現(xiàn)了TrxR1選擇性,，還優(yōu)化了動(dòng)力學(xué),，其主要的響應(yīng)機(jī)制如Scheme 1所示。作者猜測(cè),，由于硒醇的pKa比硫醇低以及硒化物的親電性比二硫化物大,，硒醇比硫醇鹽更容易形成。這主要是因?yàn)槲脑影霃捷^大,，空間擁擠度較小，二硒化物σ*反鍵軌道的能量相對(duì)較低,，具有更小的鍵能,，有利于鍵的斷裂。

（來(lái)源：Angew. Chem. Int. Ed.）

隨后,，作者簡(jiǎn)單介紹了探針1a和1b的合成過(guò)程（Scheme 2）,。1,8-二羥基萘（8）經(jīng)CH₃I單烷基化得到化合物7,。羅丹明110鹽酸鹽（4）經(jīng)水解形成化合物3，并與化合物7經(jīng)霍本-赫施反應(yīng)得到熒光染料2,。隨后熒光染料2與羥基二硒化物5在三光氣的作用下得到探針1a,。同樣的，作者用類似的方法制備了二硫化物探針1b,。

（來(lái)源：Angew. Chem. Int. Ed.）

為了探究探針的光學(xué)響應(yīng)性,，作者在含有EDTA、BSA和NADPH的磷酸鹽緩沖液中,，用大鼠肝臟中的TrxR1進(jìn)行了酶促分析,，結(jié)果表明熒光染料2的熒光強(qiáng)度與TrxR1的濃度成正比。對(duì)于0.12單位的酶（約100 nM的TrxR1）,，反應(yīng)在30分鐘內(nèi)達(dá)到穩(wěn)定,，且反應(yīng)需要NADPH的存在（Figure 2）。

（來(lái)源：Angew. Chem. Int. Ed.）

隨后,，作者進(jìn)行了不同濃度的探針1a（0-20 μM）在TrxR1（0.12單位）存在條件下的動(dòng)力學(xué)研究,，并繪制了反應(yīng)速度與底物濃度的關(guān)系圖，計(jì)算得到K_m值約為15.89 μM（Figure 3）,，這表明TrxR1與探針1a之間具有較高的親和力,。

（來(lái)源：Angew. Chem. Int. Ed.）

為了探究探針1a的選擇性，作者選擇常見(jiàn)的生物還原劑（Na₂S,、Hcy,、Cys、GSH等）與探針1a進(jìn)行反應(yīng),，發(fā)現(xiàn)只有TrxR1顯示出明顯的熒光增強(qiáng)（Figure 4）,。而相比之下，GSH對(duì)探針的干擾性相對(duì)較大,，但實(shí)驗(yàn)是在GSH為毫摩爾（生理細(xì)胞）水平下,，但TrxR1（100 nM）遠(yuǎn)低于生理?xiàng)l件下進(jìn)行的。

（來(lái)源：Angew. Chem. Int. Ed.）

為了實(shí)現(xiàn)細(xì)胞成像,，作者將HCC827（肺腺癌）細(xì)胞接種到96孔板中并培養(yǎng)過(guò)夜,，24小時(shí)后用TrxR的不可逆親電子抑制劑2,4-二硝基氯苯（DNCB）處理細(xì)胞1小時(shí)，最后用探針1a和1b孵育,，并進(jìn)行熒光共聚焦成像,。熒光成像圖顯示只有在僅用探針1a和1b處理的細(xì)胞中表現(xiàn)出強(qiáng)烈的熒光，DNCB的處理使細(xì)胞的熒光明顯減弱（Figure 5）,。

（來(lái)源：Angew. Chem. Int. Ed.）