酶是一種重要的生命物質(zhì),，參加體內(nèi)幾乎所有的生物反應(yīng),，如蛋白質(zhì)的合成、能量的產(chǎn)生和利用,，以及細(xì)胞中基因的表達(dá),。因此，酶的水平和活性顯著影響生物體的生理功能,，并與人類各種疾病密切相關(guān),。磷酸酶是水解酶家族的重要成員，其通過對(duì)蛋白質(zhì)或其他酶進(jìn)行脫磷酸化來(lái)調(diào)節(jié)它們的生物學(xué)功能,。磷酸酶本身的活性受其他上游信號(hào)分子如活性氧（ROS）和氣體遞質(zhì)控制,。在這些信號(hào)分子中，硫化氫（H₂S）是一種重要的調(diào)節(jié)劑,。因此,，探究活細(xì)胞中H₂S水平和磷酸酶活性的關(guān)系顯得尤為重要。

近日,，安徽大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院的張忠平教授課題組基于H₂S和磷酸酶敏感的熒光團(tuán)設(shè)計(jì)合成了一個(gè)一體化識(shí)別探針N₃-CR-PO₄,，該探針可同時(shí)檢測(cè)活細(xì)胞中的H₂S水平和磷酸酶活性。相關(guān)成果以“Revealing Gasotransmitter Regulation to Phosphatase Activity in Live Cells by Three-Channel Imaging Correlation”為題發(fā)表在Angew. Chem. Int. Ed.上（DOI: 10.1002/anie.201811391）,。論文通訊作者為張忠平教授和張瑞龍博士,。

作者選用香豆素（發(fā)射波長(zhǎng)為445 nm）和rhodol（發(fā)射波長(zhǎng)為545 nm）構(gòu)建探針，主要考慮因素為：1. 兩者的發(fā)射峰之間的距離可達(dá)100 nm,，有效避免了光譜重疊,；2. 香豆素的發(fā)射光譜與rhodol的吸收光譜重疊，具備熒光能量共振轉(zhuǎn)移（FRET）的條件,。N₃修飾的香豆素和磷酸修飾的rhodol通過哌嗪環(huán)連接,，組成了探針N₃-CR-PO₄。N₃具有很強(qiáng)的吸電子效應(yīng),，抑制香豆素的藍(lán)色熒光,；磷酸則抑制rhodol的綠色熒光,。一方面,，H₂S存在時(shí),，N₃被還原為NH₂，探針發(fā)出藍(lán)色熒光,；另一方面,，磷酸酶存在時(shí)，磷酸基團(tuán)被切斷從而探針發(fā)出綠色熒光,；而在H₂S和磷酸酶的共存下,，由于FRET作用，僅能在香豆素的激發(fā)波長(zhǎng)下檢測(cè)到綠色熒光,，且該信號(hào)比單一的磷酸酶誘導(dǎo)的信號(hào)弱（圖1a）,。

（來(lái)源：Angew. Chem. Int. Ed.）

獲得了探針N₃-CR-PO₄之后，作者探究了其對(duì)H₂S和堿性磷酸酶（ALP）的響應(yīng)性,。首先被研究的是探針對(duì)H₂S的響應(yīng)性,。在Tris-HCl緩沖液中，探針在360 nm光激發(fā)下,，445和545 nm處存在兩個(gè)弱發(fā)射峰,。隨著H₂S的加入，探針在445 nm處的發(fā)射峰逐漸增強(qiáng)（圖1b）,。當(dāng)H₂S的濃度為70 μM時(shí),，熒光強(qiáng)度達(dá)到最大值（增強(qiáng)了13倍）。即使在1 nM H₂S的條件下,，熒光強(qiáng)度仍增強(qiáng)約1.4倍,，表明探針對(duì)H₂S具有高靈敏性。另外,，545 nm處的弱發(fā)射峰并沒有隨著H₂S的加入而改變,。然后作者研究了探針對(duì)ALP的響應(yīng)性。隨著ALP的加入,，510 nm光激發(fā)下,，探針在545 nm處的熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)（圖1c）。當(dāng)ALP濃度為2 U/L時(shí),，熒光強(qiáng)度增強(qiáng)了23倍,。而在0.01 U/L ALP條件下，熒光強(qiáng)度仍增強(qiáng)了2倍,，表明探針對(duì)磷酸酶具有極高的敏感性,。接著，作者探究了在H₂S和ALP共同存在條件下探針的響應(yīng)情況,。在360 nm光激發(fā)下,，10 μM探針與50 μM H₂S的混合溶液在445 nm處表現(xiàn)出藍(lán)色熒光發(fā)射。在上述溶液中逐漸加入ALP,，445 nm處發(fā)射峰的熒光強(qiáng)度迅速下降,，而545 nm處的熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)約7倍（圖1d）,。這些現(xiàn)象均證實(shí)了FRET的發(fā)生。此外,，作者進(jìn)行了探針選擇性實(shí)驗(yàn),，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)常見的分子（氨基酸、肽,、蛋白質(zhì),、酶和無(wú)機(jī)鹽等）對(duì)探針的熒光均沒有顯著的影響（圖1e）。

隨后,，作者用10 μM探針處理HeLa細(xì)胞,，發(fā)現(xiàn)通道CH1（檢測(cè)H₂S）、CH2（檢測(cè)磷酸酶）和CH3（檢測(cè)FRET相關(guān)性）都表現(xiàn)出強(qiáng)熒光信號(hào)（圖2a）,。為了進(jìn)一步研究熒光產(chǎn)生的原因,，作者用磷酸酶抑制劑（Na₃VO₄）和H₂S生成酶抑制劑（氨氧基乙酸，AOAA）進(jìn)行了陰性對(duì)照實(shí)驗(yàn),。當(dāng)Na₃VO₄和探針依次與細(xì)胞共孵育后,，CH2和CH3的熒光信號(hào)明顯減弱，而CH1的熒光信號(hào)增強(qiáng),，作者推測(cè)可能是磷酸酶活性受到抑制造成FRET中斷而引起的,。在另一對(duì)照組中，AOAA加入后CH1熒光信號(hào)減弱,，同時(shí)CH2和CH3的熒光信號(hào)變得極微弱,，與加入Na₃VO₄時(shí)的熒光信號(hào)強(qiáng)度大致相當(dāng)（圖2b）。這說(shuō)明H₂S水平降低可能導(dǎo)致活細(xì)胞中磷酸酶失活,。

（來(lái)源：Angew. Chem. Int. Ed.）

為了驗(yàn)證H₂S對(duì)磷酸酶活性的影響,，作者預(yù)先用H₂S清除劑PMA處理細(xì)胞以降低細(xì)胞內(nèi)H₂S水平，隨后加入10 μM探針共孵育,。隨著PMA劑量的增加,，三個(gè)通道的熒光信號(hào)逐漸變?nèi)酰⑶褻H2和CH3中的熒光信號(hào)幾乎消失（圖3a和b）,。這說(shuō)明H₂S水平降低極大地抑制了磷酸酶的活性,，證實(shí)了H₂S作為活化劑可維持細(xì)胞內(nèi)磷酸酶的正常活性,。作者進(jìn)一步用不同劑量的H₂S處理HeLa細(xì)胞,，然后加入10 μM探針孵育，發(fā)現(xiàn)隨著H₂S的增加,，CH1的熒光信號(hào)逐漸增強(qiáng),，而CH2和CH3的熒光信號(hào)越來(lái)越弱（圖3c和d）。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,，當(dāng)H₂S水平偏離細(xì)胞內(nèi)正常水平時(shí),，磷酸酶活性顯著降低,。

（來(lái)源：Angew. Chem. Int. Ed.）

總而言之，作者設(shè)計(jì)合成了一個(gè)雙響應(yīng)的熒光探針N₃-CR-PO₄,，其在H₂S和磷酸酶的作用下分別產(chǎn)生兩種可區(qū)分的熒光信號(hào),。作者結(jié)合FRET作用,，建立了三通道成像,，用于檢測(cè)活細(xì)胞中的H₂S水平和磷酸酶活性，并闡明磷酸酶活性與H₂S水平的相關(guān)性,。該探針在探索生物體酶活性調(diào)節(jié)機(jī)制方面具有重要的參考價(jià)值,。