4.雙酶切克隆產(chǎn)物和空載

（膠回收后PCR產(chǎn)物和空載體同時分別進(jìn)行雙酶切，雙酶切體系可參考限制性內(nèi)切酶的商家說明書,，如NEB或TaKaRa,，需要注意的是內(nèi)切酶都有對應(yīng)的反應(yīng)Buffer，如果使用不合適可產(chǎn)生型號活性,，所以在酶切位點選擇是也要參考這方面的因素進(jìn)行綜合選擇,，如下為TaKaRa給出的雙酶切內(nèi)切酶配對Buffer表（部分），如要完整表單可在TaKaRa官網(wǎng)下載或留言）

5.酶切產(chǎn)物的回收

（此處膠回收的流程同前,，在進(jìn)行凝膠電泳時需注意,，最好同時將未進(jìn)行酶切的質(zhì)粒空載同時進(jìn)行跑膠比較,，理論上環(huán)狀質(zhì)粒（未酶切）比線性質(zhì)粒（經(jīng)過酶切）跑的快,，因為質(zhì)粒分子量一般都比較大（>2kb），所以電泳時可多跑幾分鐘使得這樣的差異盡可能擴大,，易于比較觀察,，以充分確定酶切有效。）

6.酶切產(chǎn)物的連接

（連接體系一般為10-25ul，16℃連接過夜（有部分商業(yè)化的試劑盒可16℃連接30min即可）,，金屬浴和PCR儀均可,，不建議使用水浴，溫度不穩(wěn)定,。）

7.質(zhì)粒轉(zhuǎn)化

（根據(jù)實驗?zāi)康倪x用合適的感受態(tài)細(xì)胞,，如后續(xù)要提取質(zhì)粒進(jìn)行下游轉(zhuǎn)染或其他實驗，采用DH5α感受態(tài)細(xì)胞即可,，如果后續(xù)需要大量表達(dá)插入基因的目的蛋白,，則采用BL21感受態(tài)細(xì)胞即可，不同感受態(tài)細(xì)胞的功能不同,，需注意區(qū)分,；轉(zhuǎn)化采用熱激法，冰上30min使質(zhì)粒附著于感受態(tài)細(xì)胞表面,，然后42℃ 90s熱激使質(zhì)粒進(jìn)入細(xì)胞內(nèi),，切記時間不可過長，然后在立即置于冰上5min左右,。）

8. 轉(zhuǎn)化后搖菌

（轉(zhuǎn)化后的菌液于超凈工作臺中加1ml LB培養(yǎng)基，然后置于搖床37℃搖菌,，一般轉(zhuǎn)速為120-150轉(zhuǎn)/min,，時間一般為45-60min。）

9. 涂板培養(yǎng)

（搖菌后的菌液在超凈工作臺中在預(yù)先準(zhǔn)備好的平板上進(jìn)行涂板,，需要注意的是：A平板配置時加入的抗生素需與轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒的抗生素抗性匹配,；B平板可以在涂板前30-60min放于37℃培養(yǎng)箱預(yù)熱，一方面有利于涂板后菌落的生長,，另一方面有利于蒸發(fā)掉剛從冰箱中拿出的平板上的水蒸氣,；C涂板時建議少量使用菌液，可結(jié)合此前膠回收的條帶亮度考慮,，一般取幾十微升涂板即可,，且最好采用化波浪線的涂板方式，以防止菌落連成片而無法挑取單克隆,。）

10.挑克隆及PCR鑒定

（一般挑取3-5個單克隆即可,，克隆挑取盡量選擇大小均勻（不要太大也不要太小）的單克??；如后續(xù)要經(jīng)過PCR鑒定且基因較難克隆可以挑取10個左右經(jīng)過PCR鑒定篩選；PCR鑒定理論上可以使用克隆引物進(jìn)行鑒定,，但最好設(shè)計專門的鑒定引物（如有后續(xù)做qPCR的定量引物可直接使用）,，更嚴(yán)格一點也可采用上游的鑒定引物（目的序列上）和測序用通用引物下游引物（載體序列上）進(jìn)行搭配使用鑒定；PCR鑒定時嚴(yán)格設(shè)置對照組,，且盡量降低PCR循環(huán)數(shù)25左右為宜,，不可太高,，否則很可能會有假陽性結(jié)果出現(xiàn)。）

11.測序

（一代測序服務(wù)的公司比較多,，像南京金斯瑞,、上海生工等均提供該服務(wù)，價格一般為16-20元/反應(yīng),，一般一個反應(yīng)可測到1kb左右的序列長度,，除去引物端序列和末尾的100bp左右的序列存在測序不準(zhǔn)確的情況，一個反應(yīng)可以測出大約800bp準(zhǔn)確的序列,，如果目的片段<800bp,，測1個反應(yīng)即可；如果在800-1600bp之間可正反向各測1個反應(yīng)即可,；如果>1600bp,，則最少需要測3個反應(yīng)，中間至少需要設(shè)計一次walking引物,，測序公司會自己設(shè)計合成,，你只需要承擔(dān)費用即可。）