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國內(nèi)發(fā)表在Jounal of Medical Virology的一篇文章,，探討了快速IgM-IgG聯(lián)合抗體檢測在SARS-CoV-2感染診斷中的發(fā)展及臨床應(yīng)用。 檢測原理/方法： Figure 1: Schematic illustration of rapid SARS-CoV-2 IgM-IgG combined antibody 結(jié)果： Table 1. The detection sensitivity and specificity of SARS-CoV-2 IgG-IgM combined antibody reagent. 在525例病例,，其中397由臨床確診（包括PCR）的陽性患者,，128例陰性患者，進行檢測,，結(jié)果為：在397確診轉(zhuǎn)載中,，352例檢測陽性（敏感度為88.66%），128例陰性患者中,，12例檢測陽性（特異性為90.33%）,，并且在397例確診患者中有256例均有IgGH和IgM抗體（64.48%）。說明抗體的檢測可以有效地彌補核酸檢測漏檢的風(fēng)險,，發(fā)揮其在新型冠狀肺炎（COVID-19）的及時診治及防控中的作用,。 但臨床現(xiàn)也有反映出現(xiàn)了較多的假陽性，困擾臨床決策,。2019-nCoV特異IgM和IgG抗體檢測出現(xiàn)假陽性的原因是什么,？如何最大程度的識別假陽性并避免假陽性對臨床的誤導(dǎo)？以及在臨床應(yīng)用中,，究竟要如何去用才能最有效地發(fā)揮其對2019-nCoV感染的診斷和防控價值,？是一個必須要直接面對并且無法回避的。 01 2019-nCoV特異IgM和IgG抗體的診斷意義 從機體對病原體的體液免疫應(yīng)答來看,，病原體的特定蛋白如2019-nCoV的S蛋白和N蛋白等會刺激免疫系統(tǒng)引起抗體應(yīng)答,，最早出現(xiàn)的抗體是IgM及其后的IgA抗體，然后是IgG抗體,，從急性感染的一般過程,，當(dāng)IgG抗體出現(xiàn)后，濃度會持續(xù)增高,，IgM則持續(xù)降低,，直至消失,，IgG抗體會較長時間存在。因此,，特異IgM和IgG抗體是一對出現(xiàn)有序,，此消彼長的一個關(guān)系。所以我們曾提出,，正確地利用及觀察IgM/IgG的動態(tài)變化（如圖1）,，有助于在病毒核酸檢測這個臨床診斷“金標(biāo)準(zhǔn)”失效后（因病程、標(biāo)本采集等所致的假陰性）的2019-nCoV感染的診斷,。 那為什么一定要是動態(tài)的,，而不能是靜態(tài)的檢測一次呢？這是由免疫檢測的特性所決定的,，也就是抗體檢測會因為臨床標(biāo)本中的一些干擾物質(zhì)的存在而出現(xiàn)假陽性結(jié)果,。也許有同道要問，那為什么我們檢測乙型肝炎病毒（HBV）,、丙型肝炎病毒（HCV）和人類免疫缺陷病毒（HIV）等則可以靜態(tài)只檢測一次呢,？其實也不是一次，這些病毒感染主要為慢性感染,，無法如上述急性感染那樣去動態(tài)觀察確認(rèn)，只能是通過如下辦法確證：如HBV有多個標(biāo)志物（如“兩對半”）,，可相互確認(rèn),，出現(xiàn)罕見的單獨HBsAg陽性，則有中和實驗確證,；抗-HCV和抗-HIV陽性,，也必須經(jīng)過確證實驗如病毒核酸檢測或免疫印跡實驗后，才能報出陽性結(jié)果,。 圖1. IgM/IgG用于判斷急性或近期感染的動態(tài)檢測及判斷方法 02 IgM和IgG抗體檢測假陽性的原因以及如何最大程度的避免,？ 特異IgM和IgG免疫測定假陽性通常有以下兩個方面的原因，一是試劑盒陽性判斷值（Cut-off value）的設(shè)定,，一些處于陽性判斷值附近的弱陽性結(jié)果,，很可能是假陽性；其二是患者標(biāo)本中存在導(dǎo)至免疫測定假陽性的內(nèi)源性或外源性干擾物質(zhì),。 （一）陽性判斷值的設(shè)定 膠體金試紙條檢測是通過肉眼觀察顏色有否來判斷陽性和陰性,，不存在陽性判斷值的問題，但會存在不同檢測者判斷的差異,?；瘜W(xué)發(fā)光免疫試驗（CLIA）和酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）則需要設(shè)定陽性判斷值，其較好的做法是通過測定大量的陰性人群（可數(shù)千份）和一定數(shù)量（可數(shù)百份）的已知陽性人群標(biāo)本,，會得到如圖2的一個分布,，采用接受機工作特性（Receiver Operating characteristic,，ROC）曲線或其他統(tǒng)計學(xué)方法得到的陽性判斷值，通常為假陽性和假陰性均較低且達到平衡狀態(tài)時的測定信號如OD值或發(fā)光值,。因此,，不可避免處于其周邊陽性一側(cè)的結(jié)果，會有一部分弱陽性其實際為假陽性,。 圖2 依據(jù)陰性和陽性人群檢測值的分布確定陽性判斷值 （二）干擾物質(zhì) 1,、內(nèi)源性：內(nèi)源性干擾物質(zhì)一般包括類風(fēng)濕因子、嗜異性抗體,、補體,、因使用鼠抗體治療或診斷誘導(dǎo)的抗鼠Ig 抗體等。在日常的臨床血清（漿）標(biāo)本中,，有相當(dāng)比例的標(biāo)本不同程度的含有上述各種干擾物質(zhì),，從而可能導(dǎo)至測定結(jié)果的假陽性。 （1）類風(fēng)濕因子（Rheumatoid factors,，RF） 在類風(fēng)濕患者,、其他疾病以及正常人血清中，常含有較高或不同濃度的RF,，其通常為IgM型,，亦有IgG和IgA型，RF具有與變性IgG產(chǎn)生非特異結(jié)合的特點,，因此在免疫測定中,，其可與固相上包被的特異抗體IgG以及隨后加入的標(biāo)記的特異抗體IgG結(jié)合，從而出現(xiàn)假陽性結(jié)果,。尤其是在捕獲法IgM型特異抗體的測定中表現(xiàn)最為明顯,，因為此時固相包被的抗體為抗人μ鏈抗體，IgM型RF的存在可使其大量結(jié)合于固相,。 為避免RF的干擾,，通常可采取以下措施： 1）稀釋標(biāo)本,。這在判斷急性病原體感染的特異IgM抗體檢測等尤為有用,。因為急性感染時，血循環(huán)中特異的IgM抗體滴度通常很高,，而RF滴度通常相對要低很多,。因此，在測定前對標(biāo)本進行稀釋,，特異的IgM因高滴度仍可檢出,，而非特異的RF則會因為稀釋變成很低的滴度，從而不影響測定,。 2）改變酶標(biāo)抗體,。由于RF結(jié)合的是IgG的Fc片段,，如果將標(biāo)記抗體的Fc片段酶切去除，僅留下具有特異結(jié)合功能的F(ab’)2部分用于標(biāo)記,，則在測定中即可避免RF的干擾,。 3）標(biāo)本中RF用變性IgG預(yù)先封閉。將經(jīng)熱變性（63℃,，10 min）的動物如兔,、羊等的IgG加入到標(biāo)本稀釋液中。此外,，在測定特異IgM時,，也可使用抗人IgG去除臨床標(biāo)本中RF和IgG。 4）測定時,，可在標(biāo)本中加入一定濃度的尿素,，其可以解離低親合力結(jié)合的RF和IgG，因而可以去除RF的干擾,。 （2）嗜異性抗體（Heterophilicantibodies） 人類血清中可能會含有抗嚙齒類動物（如鼠,、馬、羊等）的抗體,，即天然嗜異性抗體,。有研究表明，天然的嗜異性抗體（IgG）可分為兩類,，一類（85%的假陽性由其引起）可結(jié)合于山羊,、小鼠、大鼠,、馬和牛IgG的Fab區(qū)域，但不與兔IgG的Fab區(qū)結(jié)合,。另一類（15%的假陽性由其引起）可結(jié)合于小鼠,、馬、牛和兔IgG的FC區(qū)表位,，但不與山羊和大鼠IgG的FC區(qū)表位結(jié)合,。嗜異性抗體可通過交聯(lián)固相和標(biāo)記的單抗或多抗而出現(xiàn)假陽性反應(yīng)。 由嗜異性抗體引起的干擾可通過下述方法避免： 1）使用特異的兔F(ab’)2片段作為固相或測定標(biāo)記抗體,。 2）在標(biāo)本或標(biāo)本稀釋液中加入過量的動物Ig,，封閉可能存在的嗜異性抗體。但加入量不足或亞類不同時無效,。 （3）補體 在固相免疫測定中,，來自哺乳動物的固相特異抗體和標(biāo)記二抗均可以激活人補體系統(tǒng)。因為其在固相吸附及結(jié)合過程中,，抗體分子發(fā)生變構(gòu),， Fc段的補體C1q結(jié)合位點被暴露出來,，這樣C1q就成為一個中介物將二者交聯(lián)起來，從而出現(xiàn)假陽性結(jié)果,。由補體引起的干擾可采用56℃30 min加熱可使標(biāo)本中的補體C1q滅活,。但實施前，一定要有實驗證明這種滅活不會影響特定試劑的檢測結(jié)果,。 （4）因使用鼠抗體治療或診斷誘導(dǎo)的抗鼠Ig抗體 在臨床上,，有可能使用鼠源性單克隆抗體進行靶向治療，及使用放射性核素標(biāo)記鼠源性單克隆抗體進行影像診斷等,，均有可能使相應(yīng)患者體內(nèi)產(chǎn)生抗鼠抗體,。這種抗鼠抗體對使用鼠源性單克隆抗體的免疫測定，可產(chǎn)生假陽性結(jié)果,。 由抗鼠抗體引起的干擾可通過下述方法避免： 1）使用特異的抗體F(ab’)2片段作為固相或測定酶標(biāo)抗體,。 2）在標(biāo)本或標(biāo)本稀釋液中加入過量的鼠Ig，封閉可能存在的抗鼠抗體,。 （5）溶菌酶 溶菌酶可與等電點較低的蛋白有強的結(jié)合能力,。免疫球蛋白等電點約為5，因此,，在免疫測定中,，溶菌酶可在包被的IgG和標(biāo)記的IgG間形成橋接，從而導(dǎo)至假陽性,。Cu2+離子和卵白蛋白可有效地封閉溶菌酶,，防止其聯(lián)接IgG。 2,、外源性：外源性干擾物質(zhì)包括標(biāo)本溶血,、標(biāo)本被細菌污染、標(biāo)本貯存時間過長和標(biāo)本凝固不全等,。 （1）標(biāo)本溶血 要注意避免出現(xiàn)嚴(yán)重溶血,。血紅蛋白的血紅素基團有類似過氧化物的活性，因此,，在以辣根過氧化物酶（HRP）為標(biāo)記酶的ELISA和CLIA中,，如血清標(biāo)本中血紅蛋白濃度較高，則其在溫育過程中會吸附于固相,，從而與后面加入的HRP底物反應(yīng)顯色或發(fā)光,，導(dǎo)至假陽性。 （2）標(biāo)本貯存時間過長 標(biāo)本在2~8℃下保存時間過長,，IgG可聚合成多聚體,，在間接法免疫測定中會導(dǎo)至本底過深、甚至造成假陽性。 參考資料： 1,、Development and Clinical Application of A Rapid IgM-IgG Combined Antibody Test for SARS-CoV-2 Infection Diagnosis. 2020 Feb 27. doi: 10.1002/jmv.25727,； 3,、國家衛(wèi)生健康委臨床檢驗中心； |
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