這幾天科學(xué)界最大的新聞非諾貝爾獎(jiǎng)莫屬了,。諾貝爾獎(jiǎng)是對(duì)科研工作者學(xué)術(shù)成就的最大認(rèn)可,。2008年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)授予了在綠色熒光蛋白(GFP)研究和應(yīng)用方面做出突出貢獻(xiàn)的科學(xué)家。自從GFP蛋白從水母中分離到后,，就已經(jīng)廣泛用于特定蛋白的標(biāo)記和示蹤,。近年來(lái)隨著分子生物學(xué)、有機(jī)化學(xué)以及材料科學(xué)等學(xué)科的進(jìn)展，科學(xué)家們又獲得了多種新型的熒光蛋白（表1）,，使用這些熒光蛋白標(biāo)志物,，我們可以在細(xì)胞水平或動(dòng)物體內(nèi)研究目的基因表達(dá)，蛋白質(zhì)運(yùn)輸以及各種細(xì)胞內(nèi)動(dòng)態(tài)的生物化學(xué)信號(hào)通路等,。

表1. 常用熒光蛋白的物理屬性.

數(shù)據(jù)來(lái)源于 Journal of Cell Science.

基因修飾小鼠是目前研究人類基因功能最重要的模式生物,，通過(guò)基因敲入的方式，將外源的熒光蛋白表達(dá)元件（示蹤基因）敲入到小鼠內(nèi)源基因中,，即可以對(duì)目的基因進(jìn)行標(biāo)記和示蹤,。根據(jù)不同的研究目的，可分為以下三種情況：

一,、用于蛋白的亞細(xì)胞定位研究

將示蹤基因敲入到小鼠內(nèi)源基因的或5'端或3'端,，且與內(nèi)源基因融合表達(dá)，可以確定內(nèi)源蛋白的亞細(xì)胞定位（如圖1所示）,。熒光標(biāo)簽插入位置的決定因素：1. 已有文獻(xiàn)的報(bào)道,，首先考慮已有的參考模型；2. N端或C端有無(wú)蛋白修飾,，避免插入的位置進(jìn)行蛋白翻譯后的修飾,；3. 離主要功能域遠(yuǎn)的N端或C端，確保蛋白正常功能的行使,?？傊?，熒光標(biāo)簽插入的位置應(yīng)盡量避免影響蛋白的正常功能。

圖1. 用于蛋白亞細(xì)胞定位研究的小鼠模型構(gòu)建示意圖,。

應(yīng)用舉例：

2019年2月份,，國(guó)際學(xué)術(shù)期刊PLoS Genetics在線發(fā)表了中國(guó)科學(xué)院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所張雷和周斌研究組的最新合作研究成果“VGLL4 plays a critical role in heart valve development and homeostasis” [1],。此研究揭示了Vgll4基因在心臟瓣膜發(fā)育中以及出生后穩(wěn)態(tài)維持過(guò)程中具有重要的功能。南模生物為該研究構(gòu)建了Vgll4-EGFP小鼠模型,。

研究人員首先通過(guò)構(gòu)建Vgll4基因全身敲除小鼠發(fā)現(xiàn)Vgll4基因敲除后小鼠大部分會(huì)出生前死亡,，而部分存活的小鼠體型偏小、有嚴(yán)重的心肌肥大,，還伴有心臟血液回流以及心臟瓣膜異常增厚等癥狀,。隨后作者通過(guò)構(gòu)建Vgll4-EGFP熒光示蹤小鼠觀察Vgll4基因的表達(dá)時(shí)間及亞細(xì)胞定位（如圖2所示），發(fā)現(xiàn)Vgll4基因從胚胎期的13.5天開(kāi)始表達(dá)在小鼠主動(dòng)脈瓣,、肺動(dòng)脈瓣間充質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞核中,，并持續(xù)表達(dá)在成體心臟動(dòng)脈瓣膜的間充質(zhì)細(xì)胞中，這些結(jié)果表明VGLL4可能在心臟瓣膜發(fā)育和出生后穩(wěn)態(tài)維持過(guò)程中具有重要的生理功能,。該研究首次闡明了作為Hippo信號(hào)通路拮抗劑的VGLL4在心臟瓣膜發(fā)育以及穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)過(guò)程中的重要功能,，為心臟瓣膜疾病的預(yù)防和治療提供新靶點(diǎn)。

圖2. Vgll4-GFP融合蛋白的亞細(xì)胞定位檢測(cè)。 胚胎期13.5天,，Vgll4基因開(kāi)始大量表達(dá)于小鼠主動(dòng)脈瓣,、肺動(dòng)脈瓣間充質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞核中，此后一直表達(dá)在成體心臟動(dòng)脈瓣膜的間充質(zhì)細(xì)胞中,。

二,、用于蛋白的表達(dá)譜研究

常見(jiàn)的有兩種方式。第一種方式是,，將熒光示蹤基因通過(guò)2A（自剪切多肽）或IRES（內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)序列）敲入到小鼠內(nèi)源基因的3'端,，對(duì)內(nèi)源基因表達(dá)進(jìn)行示蹤（如圖3所示）；第二種方式是,，將熒光基因敲入到小鼠內(nèi)源基因的5'端,，通過(guò)終止序列polyA與內(nèi)源基因連接，可以實(shí)現(xiàn)內(nèi)源基因的替代表達(dá),，通過(guò)觀察熒光示蹤基因的表達(dá)了解內(nèi)源性蛋白的表達(dá)情況,，例如：是否表達(dá)、表達(dá)量,、表達(dá)組織分布等等,。

圖3. 用于蛋白表達(dá)譜研究的小鼠模型構(gòu)建示意圖。

應(yīng)用舉例：

2018年10月份,，EBioMedicine在線發(fā)表了中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院營(yíng)養(yǎng)與健康院所丁秋蓉研究組和上海中藥大學(xué)勞遠(yuǎn)至研究組的合作研究成果“Screening of FDA-approved drugs identifies sutent as a modulator of UCP1 expression in brown adipose tissue” [2],。該研究通過(guò)大規(guī)模化合物體內(nèi)篩選發(fā)現(xiàn)sutent可作為褐色脂肪組織（Brown Adipose Tissue, BAT）的激活劑,，是治療肥胖及脂肪肝等相關(guān)代謝型疾病的潛在藥物,。南模生物為該研究提供了Ucp1-2A-GFP小鼠模型。

為尋找激活褐色脂肪細(xì)胞的小分子物質(zhì),，研究人員在褐色脂肪成熟標(biāo)志物解偶聯(lián)蛋白(UCP1)終止密碼子前定點(diǎn)敲入綠色熒光蛋白(GFP)表達(dá)框,，建立了成熟褐色脂肪組織細(xì)胞熒光示蹤的小鼠模型（如圖4所示）。隨后作者喂食熒光示蹤小鼠1000余種臨床用藥通過(guò)觀察熒光強(qiáng)度來(lái)檢測(cè)體內(nèi)Ucp1基因的表達(dá)水平,，結(jié)果發(fā)現(xiàn)sutent能顯著促進(jìn)褐色脂肪細(xì)胞中UCP1的表達(dá),。本研究結(jié)合熒光標(biāo)記的基因示蹤小鼠模型和大規(guī)模化合物篩選,，建立了一個(gè)篩選調(diào)控褐色脂肪組織細(xì)胞激活劑的高效實(shí)驗(yàn)體系,，也為肥胖及相關(guān)代謝型疾病研究提供了新的思路。

圖4. Ucp1-2A-GFP熒光示蹤小鼠的構(gòu)建及褐色脂肪組織熒光強(qiáng)度的檢測(cè),。在褐色脂肪成熟標(biāo)志物解偶聯(lián)蛋白(UCP1)終止密碼子前定點(diǎn)敲入綠色熒光蛋白(GFP)表達(dá)框,，建立成熟褐色脂肪組織細(xì)胞熒光示蹤的小鼠模型。

三,、用于細(xì)胞的譜系示蹤研究

利用Rosa26-LSL-reporter示蹤小鼠,，與特定細(xì)胞標(biāo)記基因敲入Cre的工具小鼠交配，在子代小鼠中特定類型細(xì)胞被永久標(biāo)記上報(bào)告基因熒光（如圖5所示），通過(guò)觀察這些被標(biāo)記上的熒光信號(hào)可以追蹤某類特定細(xì)胞及其后代所有細(xì)胞的增殖,、分化以及遷移等活動(dòng),，為研究細(xì)胞命運(yùn)及譜系提供有力手段。

圖5. 用于細(xì)胞譜系示蹤研究的小鼠模型構(gòu)建示意圖,。

應(yīng)用舉例：

2019年2月份,，國(guó)際學(xué)術(shù)期刊Nature Genetics在線發(fā)表了中國(guó)科學(xué)院科學(xué)家團(tuán)隊(duì)—生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所周斌研究組、季紅斌研究組以及中科院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院彭廣敦研究組的合作科研成果 “Lung regeneration by multi-potent stem cells residing at the bronchioalveolar duct junction” [3],。該研究利用雙同源重組系統(tǒng)（Cre-loxP和Dre-rox）發(fā)現(xiàn)位于支氣管肺泡交界處的BASCs（肺支氣管肺泡干細(xì)胞）具有多種肺上皮細(xì)胞分化的潛能,，并結(jié)合多種小鼠損傷模型揭示了這群干細(xì)胞在體內(nèi)具有再生肺臟的能力，為肺臟的修復(fù)和再生研究提供了新的研究方向及理論基礎(chǔ),。南模生物為該研究提供了R26-RSR-LSL-tdTomato 和 Scgb1a1-CreER（CC10-CreER）小鼠模型,。

研究人員利用基于Cre-loxP和Dre-rox雙同源重組的報(bào)告基因小鼠R26-RSR -LSL-tdTomato，并結(jié)合能特異性標(biāo)記CC10+細(xì)胞的Scgb1a1-CreER小鼠和特異性標(biāo)記SPC+細(xì)胞的Sftpc-DreER小鼠,，通過(guò)交配獲得Scgb1a1-CreER;Sftpc –DreER ; R26-RSR-LSL-tdTomato（BASCs tracer）三基因型小鼠來(lái)特異性標(biāo)記CC10+SPC+BASCs,。通過(guò)體內(nèi)驗(yàn)證，此策略能特異性地標(biāo)記示蹤BASCs,。

圖3. 基于雙同源重組系統(tǒng)的BASCs遺傳譜系示蹤,。利用基于Cre-loxP和Dre-rox雙同源重組的報(bào)告基因小鼠R26-RSR-LSL-tdTomato特異性標(biāo)記CC10+SPC+BASCs。