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Western Blot（WB）可以說(shuō)是生物學(xué)方向的同學(xué)最...最基本的實(shí)驗(yàn)技能了,，在之前我們講到過(guò)WB的實(shí)驗(yàn)步驟零基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)| Western blot操作流程也有提到過(guò)WB的結(jié)果作圖如何通過(guò)PPT來(lái)實(shí)現(xiàn)ppt做SCI論文圖⑥——WB電泳圖,。
但經(jīng)常性的，WB的實(shí)驗(yàn)結(jié)果中的條帶會(huì)出現(xiàn)各種稀奇古怪,。 原因：比較多,，如果單純一張沒(méi)有任何顯色的X光片，最可能是一抗加成其他抗體，或者二抗種屬加錯(cuò)了,，比如兔的加成鼠的,。解決辦法：仔細(xì)檢查抗體是否加錯(cuò)，確認(rèn)轉(zhuǎn)膜沒(méi)有問(wèn)題,。經(jīng)驗(yàn)：上面的圖片展示的是一點(diǎn)信號(hào)都沒(méi)有,，如果是這樣大部分情況是抗體加錯(cuò)了。如果中間出現(xiàn)了細(xì)微的條帶,，可能原因是蛋白上樣量太少,，一抗?jié)舛冗^(guò)低，ECL發(fā)光液失效,。另外如果轉(zhuǎn)膜出現(xiàn)了問(wèn)題,，比如膜放反了，自然是一個(gè)白片,。原因：封閉不夠好,，一抗?jié)舛雀撸茨r(shí)間和次數(shù)不夠解決辦法：降低一抗?jié)舛?，增加洗膜時(shí)間和次數(shù),。經(jīng)驗(yàn)：高背景可能是WB中最常見(jiàn)出現(xiàn)的問(wèn)題，目的條帶單一清晰,，但是其他地方又彌漫性較為均一的背景（比較連續(xù)的）,。其實(shí)只要我們注意操作規(guī)范，不偷工減料就很容易避免,，洗膜按照規(guī)定來(lái)5min*5次或者10min*3次,，不要改成5min*3次，或者10min*2次,。經(jīng)驗(yàn)：此種情況絕大多數(shù)是因?yàn)橐豢共缓?，你無(wú)法判斷那一條是目的條帶。如果實(shí)在沒(méi)有更好的抗體,，建議采用陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照來(lái)確定上述哪個(gè)條帶是目的條帶。當(dāng)然這種情況下有一種很小幾率的可能是一抗?jié)舛忍咭鸬姆翘禺愋越Y(jié)合,。4. 條帶中出現(xiàn)邊緣規(guī)則的白圈解決辦法：轉(zhuǎn)膜前去掉膜和膠之間的氣泡經(jīng)驗(yàn)：我們常常將電轉(zhuǎn)液倒入一個(gè)盤子里，倒入的液體不能太多也不能太少,，最好的高度是與放上第一層濾紙齊平,，然后往濾紙上澆點(diǎn)轉(zhuǎn)膜液，把電泳膠用清水清洗下,，將電泳膠平鋪到濾紙上,，仔細(xì)檢查濾紙與膠之間是否有氣泡，可以左右前后觀察，不同方向觀察之后確認(rèn)無(wú)氣泡,，然后再往膠上面澆點(diǎn)電轉(zhuǎn)液,，用兩只手的拇指和食指輕輕夾住PVDF膜的兩側(cè)中間，使膜成U型,，然后將U型的底部接觸膠的中間,，慢慢往兩邊放下膜，這樣一般氣泡很少,。然后上層濾紙同樣用U型的放置方法,，用玻璃棒稍微貼實(shí)下，然后蓋上海綿,。注意不要來(lái)回趕氣泡,，這樣反而會(huì)帶入氣泡。原因：中心部位高濃度HRP把底物消耗過(guò)快,，中間部位底物消耗結(jié)束之后就不發(fā)光了經(jīng)驗(yàn)：如果你足夠迅速,，可以在中間部位底物消耗之前就把X光片給定影出來(lái),，但是時(shí)間很難把握，建議還是從降低蛋白量,，降低一抗二抗?jié)舛热胧帧?/span>原因：膜上其他部位與一抗或者二抗非特異性結(jié)合
解決辦法：封閉牛奶一定要純,，封閉結(jié)束之后要洗經(jīng)驗(yàn)：我們常常是等到要封閉的時(shí)候發(fā)現(xiàn)沒(méi)有牛奶，然后匆匆忙忙用PBST/TBST配置,，配的匆忙的時(shí)候往往不管是否已經(jīng)完全溶解,，如果沒(méi)有完全溶解的情況下加牛奶倒膜上，會(huì)導(dǎo)致很多不溶性顆粒附著在膜上,，這就會(huì)導(dǎo)致發(fā)光時(shí)候膜上的黑點(diǎn),。所以牛奶溶解之后，最好靜止一下,，然后輕輕地吸取上層牛奶進(jìn)行封閉,，封閉結(jié)束之后一定要洗三遍之后再加一抗。
原因：蛋白量太大,，一抗?jié)舛群蜁r(shí)間太長(zhǎng) 解決辦法：根據(jù)情況調(diào)整蛋白量,，同時(shí)一抗?jié)舛群蜁r(shí)間也可以縮短。經(jīng)驗(yàn)：這種情況很容易出現(xiàn),，因?yàn)楹芏嘣蚨伎赡軐?dǎo)致這一個(gè)結(jié)果,。一般來(lái)說(shuō)，蛋白量都是我們經(jīng)過(guò)很多次摸索得出的最適蛋白量,，因此不太可能是蛋白量過(guò)多引起的,。最有可能的是因?yàn)橐豢節(jié)舛忍?，作用時(shí)間太長(zhǎng)引起的。另外洗一抗和洗二抗千萬(wàn)不要偷工減漏,，建議5min*5次,，不要但是洗這么多次就把抗體和蛋白洗掉了，你又不是拿刀在上面刮,，真正的抗原抗體的結(jié)合是通過(guò)這種方式洗不掉的,。
原因：熒光強(qiáng)度比較高，在壓片時(shí),，放好之后不小心又輕微移動(dòng)了一段距離 解決辦法：X光片放上去之后,，就不要?jiǎng)恿耍词狗磐崃艘矝](méi)關(guān)系,。經(jīng)驗(yàn)：有的時(shí)候出現(xiàn)重新剛好在上下位置,，并且重影會(huì)相對(duì)弱一些，不要誤以為抗體識(shí)別了該蛋白的另外一種異構(gòu)形式,。
原因：膜可能曾經(jīng)干過(guò) 解決辦法：在每一步的操作過(guò)程中,，都需要注意不要讓膜干經(jīng)驗(yàn)：在封閉的時(shí)候，洗一抗,，洗二抗,，以及發(fā)光的時(shí)候都時(shí)刻需要注意蛋白面不要風(fēng)干，風(fēng)干之后結(jié)果很可能就是這個(gè)樣子,。注意與高背景區(qū)別,。
原因：SDSPAGE膠中存在氣泡或者某不溶性顆粒 解決辦法：配膠過(guò)程中要小心，使用無(wú)雜質(zhì)的液體,。經(jīng)驗(yàn)：很多實(shí)驗(yàn)室中使用的不是最新的設(shè)備,，比如配膠用的海綿墊，如果用了很多年之后,，會(huì)從下面往上面漏小氣泡,，當(dāng)氣泡足夠小并且膠快凝固的時(shí)候，走到中間的小氣泡就停留在膠內(nèi),，并會(huì)影響到后面的跑膠,。另外配膠用的水，SDS,，Tris緩沖液要注意不要有雜質(zhì),。
原因：配置膠有問(wèn)題 解決辦法：把膠配好，不合格的膠堅(jiān)決不用經(jīng)驗(yàn)：出現(xiàn)啞鈴最大的可能是膠沒(méi)有配置好,，膠凝固后不均一，不知道大家有沒(méi)有出現(xiàn)如下的配膠情況,，下圖中示意拔完梳子之后的結(jié)果,，如果你拔完梳子之后出現(xiàn)圖中下面部分的樣子,，多半會(huì)出現(xiàn)啞鈴狀。另外還有一種可能是樣品中含有太多雜質(zhì),，沒(méi)有離心下來(lái),，然后雜質(zhì)沉積在孔的中間，蛋白自然被推擠到兩邊,。
原因：電泳電流不均一 經(jīng)驗(yàn)：一般我們使用的是10孔的的膠，如果你上樣剛好10個(gè)孔,，那么最兩頭的兩個(gè)孔肯定會(huì)歪曲,。另外上樣最好在膠的中間，這樣電場(chǎng)均一,。
（1）蛋白分子量偏高或者偏低,。可能是膠的濃度與目的蛋白的濃度不對(duì)應(yīng),，比如說(shuō)100KD的蛋白你用12%的膠跑,，或者說(shuō)20KD的蛋白你用6%的膠跑。（2）蛋白質(zhì)降解,。蛋白質(zhì)降解后很可能會(huì)在比原來(lái)位置低的地方出現(xiàn)主帶,，然后會(huì)出現(xiàn)一些其他帶，最主要特點(diǎn)是所有的條帶比正常的都低,，并且條帶模糊不清晰,。 （3）所有條帶連成一片沒(méi)有間隔。原因最可能是上樣量過(guò)多,，其次是樣品彌散（比如電泳長(zhǎng)時(shí)間停止樣品彌散）,。 14. 電泳過(guò)程中出現(xiàn)現(xiàn)象及問(wèn)題（1）整個(gè)條帶呈 “ ︶ ” 狀：凝膠冷卻不均一，電泳槽老化,。（2）整個(gè)條帶呈“ ︵ ”： 凝膠左右兩頭沒(méi)有凝固好（5）溴酚藍(lán)很粗：濃縮膠濃縮效果不好，可能是濃縮膠太短,，或者是濃縮膠配錯(cuò),。（6）在分離膠中跑不動(dòng)：Tris-Cl PH值不對(duì)，或者忘記加SDS
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