耐膽鹽革蘭陰性菌的檢查

  該檢查項(xiàng)下收載了"定性試驗(yàn)"和"定量試驗(yàn)"兩部分內(nèi)容,，若標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定為 “不得檢出耐膽鹽革蘭陰性菌”則選擇"定性試驗(yàn)"檢驗(yàn)，若標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定為"膽鹽革蘭陰性茵應(yīng)小于10n cfu /g(ml) ",，則選擇"定量試驗(yàn)"檢驗(yàn),。

  耐膽鹽革蘭陰性菌的檢驗(yàn)流程如下:

  樣品制備成1: 10的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（TSB）供試液后，在20 - 25℃預(yù)培養(yǎng)不超過(guò)2小時(shí)使細(xì)菌蘇但不增殖,，再進(jìn)行選擇性增菌,，最后通過(guò)VRBG篩耐膽鹽革蘭陰性菌。

  美同藥典36規(guī)定TSB供試液的預(yù)培養(yǎng)時(shí)間為2- 5小時(shí),。劉洪祥等通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明,，大腸埃希菌,、銅綠假單胞菌,、阪崎腸桿菌和沙門菌在TSB中，微生物數(shù)量在2- 5小時(shí)呈增殖趨勢(shì),。因此,，建議減少預(yù)培時(shí)間以控制菌體增殖，降低定量試驗(yàn)的偏差,，中國(guó)藥典2015年版中規(guī)定預(yù)培不超過(guò)2小時(shí) ,。這也是中國(guó)藥典與國(guó)外藥典在技術(shù)要求上的差異之一。

  腸道增菌液體培養(yǎng)基( EE )對(duì)革蘭陰性菌具有良好的選擇性,，經(jīng)EE選擇性增菌后革蘭陽(yáng)性菌應(yīng)不長(zhǎng),，故若在隨后的紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂(VRBG)上無(wú)菌生長(zhǎng)，則表明樣品中未污染有耐膽鹽革蘭陰性菌,。盡管藥典未明確說(shuō)明VRBG培養(yǎng)基的抑菌能力,，但該培養(yǎng)基通過(guò)脫氧膽酸鈉和結(jié)晶紫等成分仍對(duì)革蘭陽(yáng)性菌具有較強(qiáng)的抑制能力。因此,，VRBG瓊脂上有菌生長(zhǎng),，且經(jīng)革蘭染色判斷為革蘭陰性菌，則表明樣品已被耐膽鹽革蘭陰性菌污染;若為革蘭陽(yáng)性菌,，則反映培養(yǎng)體系的選擇性抑菌能力不足,。

大腸埃希菌的檢查

各國(guó)藥典均采用選擇性培養(yǎng)篩選大腸埃希菌

2015年版藥典選擇麥康凱液體 (MacB) 作為選擇性增菌培養(yǎng)基，向其中添加結(jié) 晶紫后得到麥康凱瓊脂 (MacA)進(jìn)一步增強(qiáng)了其選擇性,。麥康凱液體培養(yǎng)溫度 為42-44℃,，是區(qū)分大腸埃希菌和其他大腸菌群的關(guān)鍵條件 ,。

中國(guó)藥典2015年版在選擇性增菌之前，增加了TSB增菌過(guò)程,，其基本流程見(jiàn)下表,。首先制備供試液，如1:10供試液,，即取10 ml (相當(dāng)于1g )樣品至100ml TSB中增菌培養(yǎng)(下面第一方框中的N =100ml),，通常要求N應(yīng)大于10倍接種量。

沙門菌的檢查

沙菌屬是腸桿菌科的重要致病菌屬，該檢查項(xiàng)要求微生物鑒別到"屬"水平,。沙門菌,、耐膽鹽革蘭陰性菌和大腸埃希菌這三個(gè)檢查項(xiàng)目主要針對(duì)口服制劑包括化學(xué)藥品、中藥或相關(guān)的原輔料,。沙門菌屬具有較強(qiáng)的致病性,，在食品微生物污染的溯源分析中對(duì)沙門菌的菌株分型已有廣泛的研究。

2015年版藥典和前幾版藥典對(duì)沙門菌的檢測(cè)程序基本一致,，均包括增菌,、選擇性增菌和分離培養(yǎng)三個(gè)步驟，但采用的培養(yǎng)基不同,。TSB替代了營(yíng)養(yǎng)肉湯用于增菌培養(yǎng),，RV沙門菌增商液體替代了TTB用于選擇性增菌，木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂(XLD)替代了DHL或SS瓊脂用于沙門菌的分離確認(rèn),，其基本流程見(jiàn)圖,。

其中選擇適宜體積的TSB成功增菌是檢測(cè)的關(guān)鍵。此外,，對(duì)于分離到的疑似菌株,，應(yīng)綜合利用通則9204微生物鑒定指導(dǎo)原則的相關(guān)技術(shù)進(jìn)行判斷。

RV和XLD不能耐受高溫,，因此配制滅菌時(shí)應(yīng)嚴(yán)控配制條件。RV培養(yǎng)基通過(guò)氯化鎂和孔雀綠的共同作用,，可一程度上抑制革蘭陽(yáng)性菌,、大腸桿菌,、痢疾桿菌和傷寒桿菌的生長(zhǎng)。與上述控制麥康凱液體的抑制抑菌能力要求相似,，在測(cè)試RV培養(yǎng)基的抑制能力時(shí),，實(shí)驗(yàn)室可通過(guò)細(xì)化金黃色葡萄球菌的接種上限，保證實(shí)驗(yàn)室的標(biāo)準(zhǔn)化操作水平,。此外,，各國(guó)藥典收載的RV配方中均含有六水合氯化鎂(MgCl_2.6H₂O，分子量203.3 ),，而常見(jiàn)市售的RV配方中常用氯化鎂(MgCl,，分子量95.2)，相同當(dāng)量的兩種物質(zhì)的質(zhì)量相差近一倍,。因此在選擇培養(yǎng)基時(shí),，應(yīng)結(jié)合藥典培養(yǎng)基處方對(duì)商品培養(yǎng)基的處方進(jìn)行確認(rèn)。干粉培養(yǎng)基的生產(chǎn)過(guò)程中,，六水合氯化鎂不易與其他成分混合均勻,，因此大多培養(yǎng)基處方中選用無(wú)水氯化鎂,，但無(wú)水氯化鎂極具引濕性,，因此生產(chǎn)、貯存,、包裝都應(yīng)保證培養(yǎng)基粉末處于較低的濕度環(huán)境,。

銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌的檢查

銅綠假單胞菌是假單胞菌屬的革蘭陰性桿菌，金黃色葡萄球菌是葡萄球菌屬的革蘭陽(yáng)性球菌,。該檢查項(xiàng)要求微生物鑒別到"種"水平,。盡管兩者在微生物分類學(xué)上相去甚遠(yuǎn)，但都是外傷感染的重要病原菌,，因此這兩個(gè)項(xiàng)目是外用制劑的必需質(zhì)控項(xiàng)目,。

這兩個(gè)項(xiàng)目的檢測(cè)程序基本相同，分為TSB增菌和瓊脂劃線分離兩個(gè)步驟(圖8-4 ),，選擇造宜體積的TSB成功增菌是檢測(cè)的關(guān)鍵,。與大腸埃希菌和沙門菌的檢測(cè)程序不同，該兩項(xiàng)檢測(cè)項(xiàng)目中沒(méi)有選擇性增菌的步驟,，因此對(duì)溴化十六烷基三甲銨瓊脂和甘露醇氯化鈉瓊脂的選擇性有較高的要求,。

銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)流程

梭菌的檢查

梭菌（Clostridium）為厭氧或微需氧的芽孢桿菌，該檢查項(xiàng)要求微生物鑒別到"屬"水平,。大多數(shù)梭菌的形態(tài)者都復(fù)雜多變,，即使是同一菌株其形態(tài)也并非恒定,，甚至每次培養(yǎng)都有可能變化，因此按菌體形態(tài)進(jìn)行分類較為困難,。

梭菌屬細(xì)菌芽孢體對(duì)外界的抵抗力強(qiáng),，耐高溫耐干燥，對(duì)新霉素,、卡拉霉素,、慶大霉素等抗生素不敏感。因此檢查時(shí),，將TSB置80℃加熱10分鐘后,，以殺死可能存在的雜菌繁殖體，使梭菌具有生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì),；或在哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基中加入慶大霉素,，抑制雜菌，利于梭菌的分離培養(yǎng),。2015年版藥典和前幾版藥典對(duì)梭菌的檢測(cè)程序基本一致,，均設(shè)置了熱處理、選擇性增菌和分離培養(yǎng)三個(gè)步驟,，但在梭菌增菌肉湯體積的設(shè)置上有所不同,。

梭菌檢驗(yàn)流程

梭菌檢驗(yàn)中使用的兩個(gè)培養(yǎng)基均為營(yíng)養(yǎng)豐富的培養(yǎng)體系,，對(duì)梭菌的生長(zhǎng)并不是必要條件，較少的氧氣環(huán)境才是生抱梭菌生長(zhǎng)的重要前提,。

白色念珠菌的檢查

白色念珠菌,，學(xué)名白假絲酵母，該菌屬于真菌門,，假絲酵母菌屬,，對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求不高,，最適生長(zhǎng)條件pH4.0-6.0,，可在一般細(xì)菌培養(yǎng)基上生長(zhǎng),，菌落形態(tài)因培養(yǎng)基的不同變化很大。該檢查項(xiàng)要求微生物鑒別到"屬"水平,。

假絲酵母菌數(shù)是一種條件致病菌,，可引起淺部念珠菌和深部念珠菌病，其中白色念珠菌的致病力最強(qiáng)，其他常見(jiàn)的致病菌有克魯斯假絲酵母,、光滑假絲酵母等,。隨著光譜抗生素、皮質(zhì)類固醇激素和免疫制劑的廣泛應(yīng)用,，病原菌和宿主之間的關(guān)系不斷發(fā)展變化,，體內(nèi)環(huán)境平衡紊亂、菌群失調(diào),，致內(nèi)臟真菌感染的病例日漸增多,，其中尤以念珠菌主要為白色念珠菌感染的發(fā)病率最高。

該項(xiàng)目的檢測(cè)程序2015年版藥典基本與2010年版藥典相同,。采用沙氏葡萄糖液體( SDB)作為增菌培養(yǎng)體系,，再劃線接種至沙氏葡萄糖瓊脂(SDA)進(jìn)行確認(rèn)。兩種培養(yǎng)基都含有較高的葡萄糖,，pH也較用于細(xì)菌生長(zhǎng)的培養(yǎng)基低,，滿足真菌生長(zhǎng)的條件。在對(duì)白色念珠菌的鑒別中,，常易與其他酵母菌混淆,。