?主要內(nèi)容：

?一,、分析方法的驗(yàn)證與確認(rèn)概述

?二,、分析方法的驗(yàn)證和確認(rèn)的區(qū)別與聯(lián)系

?三、分析方法的驗(yàn)證與確認(rèn)在實(shí)踐中的具體應(yīng)用

?四,、不同的檢驗(yàn)項(xiàng)目在進(jìn)行分析方法驗(yàn)證或分析方法確認(rèn)時(shí)須進(jìn)行的驗(yàn)證或確認(rèn)內(nèi)容參考

?五,、注意事項(xiàng)

一、分析方法的驗(yàn)證與確認(rèn)概述

任何分析測(cè)試的目的都是為了獲得穩(wěn)定,、可靠和準(zhǔn)確的數(shù)據(jù),。在藥品的生產(chǎn)過程中，從原料,、中間體到成品都需要檢驗(yàn),，檢驗(yàn)的結(jié)果既是過程受控的依據(jù)，也是評(píng)價(jià)產(chǎn)品質(zhì)量的重要手段,。而分析方法的驗(yàn)證與確認(rèn)結(jié)果可以用于判斷分析結(jié)果的質(zhì)量,、可靠性和一致性，這也是所有分析質(zhì)量管理體系不可分割的一部分,。

許多法規(guī)和質(zhì)量管理標(biāo)準(zhǔn)也要求實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行分析方法驗(yàn)證,。

相關(guān)法規(guī)的要求：

·美國(guó)食品藥品管理局（USFDA）制定了兩個(gè)行業(yè)指南，分別是分析方法驗(yàn)證和是生物分析方法驗(yàn)證,。

·ICH（人用藥品注冊(cè)技術(shù)要求國(guó)際協(xié)調(diào)會(huì)議）出版了兩個(gè)方法驗(yàn)證指南,。Q2A給出了驗(yàn)證中必須考慮的8種驗(yàn)證參數(shù)的術(shù)語(yǔ)和定義。Q2B中包含了方法學(xué)內(nèi)容，但是同時(shí)聲明允許一定的靈活性：“申請(qǐng)人有責(zé)任選擇最適合其產(chǎn)品的驗(yàn)證步驟和方法,?！?span>

·EURACHEM出版了方法驗(yàn)證的詳細(xì)指南，分析方法的適用性方法驗(yàn)證及相關(guān)主題的實(shí)驗(yàn)室指南,。這是最詳盡的官方指南,，包含了方法驗(yàn)證的理論和實(shí)踐。

相關(guān)法規(guī)的要求：

我國(guó)2010版GMP第二百二十三條也明確規(guī)定：符合下列情形之一的,，應(yīng)當(dāng)對(duì)檢驗(yàn)方法進(jìn)行驗(yàn)證：

1,、采用新的檢驗(yàn)方法；

2,、檢驗(yàn)方法需變更的,；

3、采用《中華人民共和國(guó)藥典》及其他法定標(biāo)準(zhǔn)未收載的檢驗(yàn)方法,；

4,、法規(guī)規(guī)定的其他需要驗(yàn)證的檢驗(yàn)方法對(duì)不需要進(jìn)行驗(yàn)證的檢驗(yàn)方法，企業(yè)應(yīng)當(dāng)對(duì)檢驗(yàn)方法進(jìn)行確認(rèn),，以確保檢驗(yàn)數(shù)據(jù)準(zhǔn)確,、可靠。

二,、分析方法的驗(yàn)證和確認(rèn)  的區(qū)別與聯(lián)系

對(duì)于分析方法的驗(yàn)證和確認(rèn),，存在很多有關(guān)這兩個(gè)術(shù)語(yǔ)的討論，它們也經(jīng)常被交叉互用,。USP32通則<1225>和<1226>中解釋了這兩個(gè)術(shù)語(yǔ)的差異,。通則<1225>的標(biāo)題是：“法定方法的驗(yàn)證”。它闡述了分析方法的驗(yàn)證,，包括從建立方法開始的所有驗(yàn)證參數(shù),，結(jié)果得到某一特定樣品的驗(yàn)證方法,。這一過程建議用于內(nèi)部制定方法的驗(yàn)證,。通則<1226>題為“法定方法的確認(rèn)”。它建議在應(yīng)用法定方法時(shí),，應(yīng)證明實(shí)驗(yàn)室有能力成功應(yīng)用該方法,。在方法轉(zhuǎn)移時(shí)，接受方法的實(shí)驗(yàn)室也應(yīng)進(jìn)行方法確認(rèn),。

驗(yàn)證分析方法的目的是證明“預(yù)期目標(biāo)的適用性”,。分析測(cè)量的目的是產(chǎn)生準(zhǔn)確可靠的數(shù)據(jù)。只有方法驗(yàn)證無法保證這一目標(biāo)的實(shí)現(xiàn),，但是應(yīng)當(dāng)將其作為分析測(cè)量質(zhì)量保證體系的一部分,。USP通則<1058>分析儀器確認(rèn)中明確提出了這一點(diǎn)。該通則開頭部分討論了實(shí)驗(yàn)室數(shù)

據(jù)質(zhì)量的不同要素的重要性，其中還解釋了為何系統(tǒng)適用性試驗(yàn)或質(zhì)量控制圖的分析不足以確保分析檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確可靠,，儀器確認(rèn)和方

法驗(yàn)證同樣重要,。

從以上可以看出，分析方法的驗(yàn)證與確認(rèn)是不可分割的,，確認(rèn)是驗(yàn)證的一部分,，它們本質(zhì)上是相同的概念，具體來說分析方法的驗(yàn)證是證明檢驗(yàn)方法或操作規(guī)程能達(dá)到預(yù)期結(jié)果的一系列活動(dòng),，分析方法的確認(rèn)是證明檢驗(yàn)設(shè)備能正確運(yùn)行并可達(dá)到預(yù)期結(jié)果的一系列活動(dòng),。

三、分析方法的驗(yàn)證與確認(rèn)在實(shí)踐中的具體應(yīng)用

1,、什么情況下進(jìn)行分析方法的驗(yàn)證,？

（1）新藥申報(bào)時(shí)，藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中分析方法必須驗(yàn)證,；

（2）藥物生產(chǎn)工藝變更,、制劑的組分變更、原分析方法進(jìn)行修訂時(shí),，則質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法必須進(jìn)行驗(yàn)證2010版藥典中分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則只規(guī)定了項(xiàng)目和基本方法而沒有合格標(biāo)準(zhǔn):附錄XIXA,；中國(guó)GMP(2010版))非常關(guān)注驗(yàn)證的過程,題分析方法驗(yàn)證不完善是常見的問題。

2,、分析方法驗(yàn)證成功的前提條件：

（1）儀器已經(jīng)確認(rèn),、校正并在有效期內(nèi)

（2）經(jīng)過培訓(xùn)的人員

（3）可靠穩(wěn)定的對(duì)照品

（4）可靠穩(wěn)定的實(shí)驗(yàn)試劑

（5）確認(rèn)受試溶液的穩(wěn)定性，在規(guī)定時(shí)間內(nèi)無降解,。

3,、分析方法學(xué)驗(yàn)證所要求驗(yàn)證的內(nèi)容：

（1）含量的測(cè)定（GC或HPLC方法驗(yàn)證）

（2）雜質(zhì)的含量測(cè)定（GC或HPLC方法驗(yàn)證）

（3）藥物的定性鑒定

（4）藥物的含量均勻度測(cè)定

（5）藥物的微生物檢測(cè)

（6）藥物的細(xì)菌內(nèi)毒素的檢測(cè)

4、新申報(bào)產(chǎn)品的GC或HPLC方法驗(yàn)證

4.1選擇性（或?qū)傩裕?span>

選擇適當(dāng)?shù)膬x器,、相應(yīng)條件,、試劑（包括儀器型號(hào)、GC或HPLC色譜柱,，流動(dòng)相配比等）,，使原料藥生產(chǎn)工藝中可能存在的雜質(zhì)（包括原料，中間體,，前體及降解產(chǎn)物）或制劑生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的雜質(zhì)能與主峰較好地分開,，并確保主成份峰中沒有其他干擾物質(zhì)峰存在，對(duì)其檢驗(yàn)的專屬性進(jìn)行評(píng)價(jià)和確認(rèn),。

可接受的標(biāo)準(zhǔn)為：空白對(duì)照應(yīng)無干擾,，雜質(zhì)峰與主峰應(yīng)能完全分離，分離度不得小于1.5,。

4.2精密度

4.2.1系統(tǒng)精密度

通過對(duì)單個(gè)測(cè)定值與平均值之間的偏差程度來衡量系統(tǒng)的誤差,。對(duì)同一均勻的樣品溶液或標(biāo)準(zhǔn)品溶液,，連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣六次，記錄每次進(jìn)樣后各組分的響應(yīng),，峰面積或峰高,，計(jì)算各響應(yīng)值與平均值之間的偏差——相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD。

可接受的標(biāo)準(zhǔn)為：RSD??2.0%,。

4.2.2方法精密度

通過測(cè)定樣品含量與真值（平均值）的偏差程度來衡量樣品制備過程（包括稱量,，稀釋）中的誤差。分別對(duì)同一批號(hào)的樣品稱量六次,，按含量測(cè)定方法測(cè)定其含量,，計(jì)算每一單一含量與平均含量之間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD。

可接受的標(biāo)準(zhǔn)為：除另有規(guī)定外通RSD不大于2.0%,。

4.2.3中間精密度

4.2.3.1按驗(yàn)證確定的方法,，同一人用同一儀器檢測(cè)三批樣品，每間隔24小時(shí)以上,，測(cè)定一次,，共測(cè)定33次。

4.2.3.2由兩人使用不同的儀器分別檢測(cè)同三批樣品,。

可接受的標(biāo)準(zhǔn)為：相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差均應(yīng)不大于2.0%,。

4.3方法的線性范圍

4.3.1在含量測(cè)定濃度的80～120%選擇五個(gè)不同的濃度點(diǎn)，每一個(gè)濃度需測(cè)定二次,，記錄各對(duì)應(yīng)濃度下的相應(yīng)響應(yīng)值（峰高,，峰面積或峰

面積的比值），以衡量樣品量與檢測(cè)器響應(yīng)間的線性對(duì)應(yīng)關(guān)系,。

4.3.2可接受標(biāo)準(zhǔn)：相關(guān)系數(shù)rr≥0.999

4.3.3在HPLC法有關(guān)物質(zhì)測(cè)定時(shí),，測(cè)定濃度從總雜質(zhì)120%至LOQ（定量限）濃度選取五個(gè)點(diǎn)，每個(gè)濃度點(diǎn)測(cè)定二次,。GC法殘留溶劑測(cè)定時(shí),，測(cè)定濃度從殘留溶劑限度的120%至LOQ濃度選取五個(gè)點(diǎn)，每個(gè)濃度點(diǎn)測(cè)定二次,。

可接受標(biāo)準(zhǔn)：相關(guān)系數(shù)rr≥0.990

4.4方法的準(zhǔn)確度

衡量該方法的實(shí)測(cè)結(jié)果與真實(shí)值的吻合程度,，即方法的回收率。

4.4.1含量方法的準(zhǔn)確度：取已知濃度的樣品（濃度范圍為含量測(cè)定濃度的80%,、100%,、120%）各三份,，每份進(jìn)樣測(cè)定三次,，計(jì)算該方

法的百分回收率。

可接受標(biāo)準(zhǔn)：回收率在98％～102％之間

4.4.2用HPLC法進(jìn)行有關(guān)物質(zhì)測(cè)定準(zhǔn)確度試驗(yàn)：一般要求根據(jù)有關(guān)物質(zhì)的定量限與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中該雜質(zhì)的限度分別配制三個(gè)濃度的供試品溶液各三份（例如某雜質(zhì)的限度為0.2%,，則可分別配制該雜質(zhì)濃度為0.1％,、0.2％和0.3％的雜質(zhì)溶液），分別測(cè)定其含量，將實(shí)測(cè)值與理論值比較,，計(jì)算回收率,，并計(jì)算99個(gè)回收率數(shù)據(jù)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差（RSD）。

該項(xiàng)目的可接受的標(biāo)準(zhǔn)為：各濃度下的平均回收率均應(yīng)在80%--120%之間,，如雜質(zhì)的濃度為定量限,，則該濃度下的平均回收率可放寬至70%--130%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差應(yīng)不大于10%

4.4.3 GC法殘留溶劑準(zhǔn)確度試驗(yàn),，取殘留溶劑限度的LOQ,、50%、100%,、120%四個(gè)濃度點(diǎn)（也可根據(jù)產(chǎn)品質(zhì)量情況選擇其他點(diǎn)）溶液,，若樣品測(cè)定濃度值低于限度值的10%時(shí)，應(yīng)增加測(cè)定限度的10%的濃度點(diǎn)溶液,。加入樣品中,，每個(gè)濃度點(diǎn)測(cè)定三次，計(jì)算扣除樣品濃度后的百分回收率,。

4.5最低檢測(cè)限

4.5.1儀器能檢測(cè)到樣品中各組分的最低檢測(cè)濃度,，不需定量。

4.5.2操作  在儀器系統(tǒng)性實(shí)驗(yàn)符合檢測(cè)要求的條件下,，測(cè)定三次空白樣品,，洗脫時(shí)間需用覆蓋整個(gè)樣品中所有組分的流出。計(jì)算平均噪聲水平,。根據(jù)產(chǎn)品檢驗(yàn)規(guī)程規(guī)定的檢測(cè)濃度配制梯度濃度,，單針進(jìn)樣。當(dāng)信噪比為3.0±1.0,，確定該濃度為待確定的最小檢測(cè)限,。將該濃度溶液重復(fù)進(jìn)樣三次，若三次所得圖譜的信噪比均為3.0±1.0,，則確定該濃度為最小檢測(cè)限,。

4.6最小定量限

能夠重復(fù)的、準(zhǔn)確的測(cè)量峰面積（相當(dāng)于供分析物）的進(jìn)樣量,。峰高等于噪聲高的10.0±1.0,。

4.6.2操作：按檢測(cè)限方法測(cè)定儀器的平均噪聲，按最小檢測(cè)限操作方法操作,，將按信噪比為10.0±1.0的濃度定為最小定量限,。

4.7方法耐用性（僅在新申報(bào)產(chǎn)品的方法的第一次驗(yàn)證時(shí)進(jìn)行）HPLC法，方法耐用性要求進(jìn)行改變流動(dòng)相比例和流動(dòng)相PH值的測(cè)試,，主要考察原料藥生產(chǎn)工藝中可能存在的雜質(zhì)（包括原料中間體,、前體及降解產(chǎn)物）與成品主峰的分離度達(dá)到要求,，并確保成品主峰中沒有

干擾峰存在，同時(shí)觀察雜質(zhì)峰的出峰順序是否發(fā)生變化,。GC法,，方法耐用性要求進(jìn)行改變柱溫和載氣流速測(cè)試，主要考察所有殘留溶劑峰之間的分離度是否仍達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)要求,。

4.8溶液穩(wěn)定性

HPLC法,，將配制好的溶液每隔半小時(shí)進(jìn)樣一次，連續(xù)進(jìn)樣55次（即放置兩小時(shí)）,，比較含量和有關(guān)物質(zhì)的變化,。

可接受的標(biāo)準(zhǔn)為：主成分的含量變化的絕對(duì)值應(yīng)不大于2.0%，雜質(zhì)含量的絕對(duì)值在±0.1％以內(nèi),，并不得出現(xiàn)新的大于報(bào)告限度的雜質(zhì),。

5藥典、客戶提供的檢驗(yàn)方法的轉(zhuǎn)移應(yīng)用確認(rèn)

對(duì)新產(chǎn)品的方法驗(yàn)證通常在產(chǎn)品開發(fā)階段完成,；大規(guī)模生產(chǎn)后的驗(yàn)證通常包括方法確認(rèn)移和方法轉(zhuǎn)移,。分析方法確認(rèn)是指當(dāng)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)或藥典標(biāo)準(zhǔn)已經(jīng)變化時(shí)在本實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行的對(duì)所涉及產(chǎn)品是否適用的確認(rèn)實(shí)驗(yàn)。確認(rèn)之前應(yīng)對(duì)新舊方法進(jìn)行核對(duì),，標(biāo)明所有變更細(xì)節(jié)檢驗(yàn)樣品的信息（批號(hào),、規(guī)格),變更項(xiàng)目的接收標(biāo)準(zhǔn)確認(rèn)試驗(yàn)的樣品通常包括正常產(chǎn)品、穩(wěn)定性產(chǎn)品,。方法轉(zhuǎn)移指檢驗(yàn)方法由轉(zhuǎn)移方轉(zhuǎn)移至接驗(yàn)收方時(shí)進(jìn)行的實(shí)驗(yàn),。

5.1方法選擇性

選擇適當(dāng)?shù)膬x器、試劑（包括儀器型號(hào),、

GC或HPLC色譜柱,，流動(dòng)相配比等）使原料藥生

產(chǎn)工藝中可能存在的雜質(zhì)（包括原料，中間體,，

前體及降解產(chǎn)物）與成品較好地分開,，并確保

成品峰中沒有其他干擾物質(zhì)峰存在。

5.2系統(tǒng)適應(yīng)性

按藥典方法及客戶方法規(guī)定操作,。

5.3系統(tǒng)精密度,、最小檢測(cè)限、最小定量限,、耐用性,、溶液穩(wěn)定性等分別按4.2.1、4.5,、4.6,、4.7及4.8操作。

5.4樣品對(duì)比檢驗(yàn)：對(duì)公司自我生產(chǎn)的三批產(chǎn)品與轉(zhuǎn)讓方生產(chǎn)的產(chǎn)品最少一批同條件下進(jìn)行檢驗(yàn),，應(yīng)均符合相應(yīng)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求,。

四,、不同的檢驗(yàn)項(xiàng)目在進(jìn)行分析方法驗(yàn)證或分析方法確認(rèn)時(shí)須進(jìn)行的驗(yàn)證或確認(rèn)內(nèi)容參考下表：

四,、不同的檢驗(yàn)項(xiàng)目在進(jìn)行分析方法驗(yàn)證或分析方法確認(rèn)時(shí)須進(jìn)行的驗(yàn)證或確認(rèn)內(nèi)容總結(jié)

（1）鑒別試驗(yàn)除專屬性,、耐用性外，其它都不要求,。

（2）含量測(cè)定方法驗(yàn)證除檢測(cè)限,、定量限外，其它都要求做,，確認(rèn)主要要考察方法的耐用性,，精密度和專屬性可示情況而定。

（3）雜質(zhì)的限度檢查方法的驗(yàn)證與確認(rèn)除專屬性,、檢測(cè)限,、耐用性外，其它都不要求

（4）雜質(zhì)的定量測(cè)定方法驗(yàn)證除檢測(cè)限外,，其它都要求,，其確認(rèn)也要考察專屬性、精密度,、LOQ,、耐用性等。

五,、注意事項(xiàng)

5.1在分析方法驗(yàn)證前,，應(yīng)確保分析儀器設(shè)備經(jīng)過確認(rèn)并處于其校驗(yàn)有效期內(nèi)。

5.2試驗(yàn)過程應(yīng)詳細(xì)記錄,包括色譜條件,，樣品,、對(duì)照品、所用試劑的來源,，含量,，稱量值,稀釋過程,簡(jiǎn)要操作方法,儀器型號(hào)，計(jì)算公

式及結(jié)果,，必要的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)等,。

5.3已驗(yàn)證過的分析方法的任何修改都應(yīng)當(dāng)保存完整的記錄，包括修改的原因和相關(guān)數(shù)據(jù)說明,，用來證明該修改后的方法和規(guī)定的方法同

樣準(zhǔn)確可靠,。