化學(xué)藥品雜質(zhì)譜控制的現(xiàn)狀與展望（上：理論篇）

對藥物雜質(zhì)譜 (impurity profile) 的控制是保證藥品安全性的重要環(huán)節(jié),，也是目前國內(nèi)新藥研發(fā)的關(guān)鍵制約因素。

與雜質(zhì)譜控制相關(guān)的關(guān)鍵技術(shù)問題可概括為：復(fù)雜體系樣本的分離分析,、微量組分的結(jié)構(gòu)分析和微量組分的毒性評價三個方面,。

理想的“雜質(zhì)譜控制 (impurity profiling)”理念應(yīng)針對藥品中的每一個雜質(zhì)，依據(jù)其生理活性制定相應(yīng)的質(zhì)控限度,。

在國家重大新藥創(chuàng)制等項目的支持下,，近年來國內(nèi)雜質(zhì)譜控制技術(shù)得以迅速發(fā)展。作者曾對 2010～2015 年間化學(xué)藥品雜質(zhì)譜的研究進(jìn)展進(jìn)行過綜述,，本文綜述了 2015年以來化學(xué)藥品雜質(zhì)譜研究的進(jìn)展,。

人用藥品注冊技術(shù)要求國際協(xié)調(diào)會 (ICH) 在制訂的原料藥、制劑雜質(zhì)研究指導(dǎo)原則 (ICH Q3A,，ICH Q3B),，殘留溶劑研究指導(dǎo)原則 (ICH Q3C) 和元素雜質(zhì)研究指導(dǎo)原則 (ICH Q3D) 的基礎(chǔ)上，2014年又頒布了基因毒性雜質(zhì)研究指導(dǎo)原則 [Assessment and Control of DNA Reactive (Mutagenic) Impurities in Pharmaceu‐ ticals to limit Potential Carcinogenic Risk,，ICH M7(R1)]，進(jìn)一步指導(dǎo)創(chuàng)新化學(xué)藥研發(fā)中的雜質(zhì)研究,。

雖然ICH的指導(dǎo)原則對新藥注冊時藥品中的各類雜質(zhì)有了明確的要求,，但如何將指導(dǎo)原則與具體的研發(fā)實(shí)踐相結(jié)合仍有諸多問題需要探討。

藥品中的雜質(zhì)可能來源于原料合成中的起始物,、溶劑,、催化劑、中間體,、副產(chǎn)物等工藝過程,，也可能在制劑生產(chǎn)、貯存和使用過程中產(chǎn)生,。

從藥品的研發(fā)至產(chǎn)品上市通常要經(jīng)歷較長的時間,，不同研發(fā)階段的關(guān)注重點(diǎn)應(yīng)有所不同，且人們對產(chǎn)品中雜質(zhì)的認(rèn)識也是伴隨著對產(chǎn)品工藝,、生產(chǎn),、貯存的不斷認(rèn)知而深入了解。

然而,，目前僅美國食品藥品監(jiān)督管理局 (FDA) 和歐洲藥品管理局 (EMA) 針對新藥不同研發(fā)階段雜質(zhì)研究的關(guān)注點(diǎn)進(jìn)行過原則性討論,。

Olsen 等對此進(jìn)行了綜述。

對于工藝雜質(zhì),，應(yīng)在原料合成階段重點(diǎn)關(guān)注產(chǎn)品中可能出現(xiàn)的各類潛在雜質(zhì),；

當(dāng)最終合成路線確定后應(yīng)重點(diǎn)分析雜質(zhì)的去除途徑，確定生產(chǎn)過程中的關(guān)鍵質(zhì)控點(diǎn),；

隨著工藝過程的不斷成熟,，再開展未知雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)確認(rèn)工作,，并開發(fā)新的分析方法確定是否有潛在雜質(zhì)的存在。

對于手性雜質(zhì),，通常需從合成工藝的角度控制各類手性異構(gòu)體的產(chǎn)生,。

在新藥研發(fā)的早期，雜質(zhì)的水平與產(chǎn)品的毒理學(xué)安全性評價結(jié)果相匹配,；

當(dāng)新藥進(jìn)入臨床研究階段,，產(chǎn)品中的雜質(zhì)限度可以按 ICH 的要求進(jìn)行控制，也可以基于臨床暴露劑量和毒理學(xué)結(jié)果適度調(diào)整,；

有時根據(jù)內(nèi)控的安全警戒線,，雜質(zhì)的鑒別閾值和界定閾值可以調(diào)整至 ICH Q3 的 3 倍，并隨著臨床暴露劑量的變化進(jìn)行相應(yīng)的調(diào)整,；

當(dāng)進(jìn)入III期臨床時,，產(chǎn)品應(yīng)符合ICH的要求。

ICH M7 (R1) 對藥品中的基因毒性雜質(zhì) (muta‐ genic impurities,，MIs) 已經(jīng)有明確的控制要求,，依據(jù)毒理學(xué)關(guān)注閾值 (TTC)，最大的日攝入量為1.5 μg,。

最初人們普遍認(rèn)為在臨床試驗(yàn)階段也需要將 MIs 控制 在 TTC 水平,，但 TTC 是基于“終身暴露時間 (life time exposure)”(通常為 75 年) 設(shè)定的，而早期臨床研究的暴露時間通常<30天,。

業(yè)界很快就認(rèn)識到這一規(guī)定缺乏科學(xué)性,，并提出分階段達(dá)到 TTC 的建議。

盡管 ICH M7 (R1) 已經(jīng)允許在周期較短的臨床試驗(yàn)中對 MIs的控制可適度放寬,，但這一選項并未被充分利用,，而更多的是選擇默認(rèn)的TTC限度。這也不同程度的制約了新藥研發(fā)的進(jìn)程,。

雜質(zhì)界定 (qualification) 是雜質(zhì)譜控制的關(guān)鍵環(huán)節(jié),。由于缺少有效的界定方法，通常建議在允許的情況下應(yīng)盡可能地控制雜質(zhì)水平以符合ICH的要求,。應(yīng)特別關(guān)注文獻(xiàn)中是否已有足夠的數(shù)據(jù)證明已知雜質(zhì)的安全性,。

對特定的雜質(zhì)是否需要進(jìn)行界定，不僅取決于患者每日的攝入劑量,，而且還與藥品的適應(yīng)癥,、給藥途徑、服用時間等因素有關(guān),。

雖然在新藥研發(fā)中對雜質(zhì)進(jìn)行充分的研究是藥品注冊的基本要求,，但對已知和潛在雜質(zhì)的界定應(yīng)分階段進(jìn)行。

Hussain等從確?；颊甙踩慕嵌?，提出了新藥研發(fā)中進(jìn)行雜質(zhì)界定的決策樹 (圖 1)：

① 力爭將雜質(zhì)水平控制在 ICH 的各種閾值以下,；② 對含量大于鑒別限的雜質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定，根據(jù)文獻(xiàn)結(jié)果判斷其可能的臨床風(fēng)險,；③ 對含量大于界定限的雜質(zhì),，評估其導(dǎo)致臨床中發(fā)生不良反應(yīng)的可能；④ 對含量大于鑒定限的雜質(zhì),，應(yīng)根據(jù)ICH M7 的要求進(jìn)行基因毒性的評估,。

各種烷基磺酸酯類雜質(zhì)目前普遍被各國監(jiān)管部門認(rèn)為是磺酸鹽類藥物中的潛在基因毒性雜質(zhì)，推測其在合成過程中與乙醇等低級醇發(fā)生酯化反應(yīng)產(chǎn)生,，因而要求企業(yè)必須對產(chǎn)品中是否可能殘留有相應(yīng)的烷基酯進(jìn)行全面驗(yàn)證,。

然而Snodin等依據(jù)烷基磺酸酯的反應(yīng)機(jī)制和實(shí)驗(yàn)證據(jù)，認(rèn)為合成工藝中形成的磺酸酯 不可能達(dá)到具有顯著毒理學(xué)意義水平：

從熱力學(xué)角度,，磺酸鹽在醇中的酯化反應(yīng)極難發(fā)生,，需在強(qiáng)酸性條件下才能發(fā)生少量的轉(zhuǎn)化；在乙醇溶劑中,，加入與藥物堿基等摩爾的磺酸根后,，二者即刻成鹽，進(jìn)而阻止了磺酸酯的形成,；雖然合成中更易形成氯代烷烴,，但氯代烷烴極易被清除，且其在生物體內(nèi)的烷基化作用較磺酸酯弱很多,。

根據(jù)現(xiàn)有的毒理學(xué)數(shù)據(jù)和 ICH M7(R1) 的規(guī) 定,，采用磺酸酯的安全限量控制氯代烷烴也是不科學(xué)的,。因此,，監(jiān)管部門對磺酸鹽相關(guān)工藝管理方式的科學(xué)性應(yīng)重新進(jìn)行評估。

抗體偶聯(lián)藥物 (antibody-drug conjugates,，ADCs) 作為一種新興的藥物,，目前 ICH Q3A、Q3B和 Q6B (質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)：生物技術(shù)產(chǎn)品/生物制品的試驗(yàn)程序和驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn)) 的相關(guān)規(guī)定均不能完全滿足對其中小分子雜質(zhì)的控制要求,。

國際藥物研發(fā)創(chuàng)新與質(zhì)量聯(lián)盟 (The Inter‐ national Consortium for Innovation and Quality in Phar‐ maceutical Development,，IQ) 成立專門的工作組 (IWG) 對該問題進(jìn)行討論?；陲L(fēng)險評估的方法,，基于 ADCs 中小分子雜質(zhì)的分子量、與蛋白載體的結(jié)合特 性,、ADC的給藥濃度和給藥方式等,，提出了 ADC中小分子雜質(zhì)的安全性評估策略和構(gòu)建 ADC 質(zhì)量控制體系的方案。

ADCs中的小分子雜質(zhì)不管是否已與蛋白載體結(jié)合均應(yīng)進(jìn)行控制,；通過對 ADC 結(jié)合工藝的控制,，減少雜質(zhì)與載體蛋白的結(jié)合,；通過對后續(xù)純化工藝的控制，保證對游離雜質(zhì)及藥物的有效去除,，使之滿足 ICH Q3A 的一般要求,；通過 ADC 藥物穩(wěn)定性的評估，預(yù)測制劑中游離小分子雜質(zhì)是否能滿足 ICH Q3B 的要求,。

評價結(jié)果提示,，ADC中的小分子雜質(zhì)含量通常非常低，基本不會導(dǎo)致臨床安全風(fēng)險,。

對仿制藥技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)的協(xié)調(diào)是藥物研發(fā)的另一熱點(diǎn),。

2018年10月18日美國 FDA向ICH提議協(xié)調(diào)全球仿制藥審評標(biāo)準(zhǔn)：以提高全球仿制藥質(zhì)量的一致性；提高監(jiān)管監(jiān)督效率并降低監(jiān)管成本,；擴(kuò)大全球仿制藥市場規(guī)模,，通過競爭降低仿制藥研發(fā)的成本，最終使患者受益,。

2019 年 2 月 6 日,，ICH 發(fā)布了對此問題的思考：認(rèn)為雖然許多ICH指南適用于仿制藥，但建立協(xié)調(diào)一致的仿制藥注冊標(biāo)準(zhǔn)具有重要意義,，并將在 2019 年組建仿制藥討論組 (Informal Generic Drug Discus‐ sion Group,，IGDG) 對其可行性進(jìn)行評估。

2015年8月18日,，國務(wù)院印發(fā)的《關(guān)于改革藥品醫(yī)療器械審評審批制度的意見》,，將“提高仿制藥質(zhì)量，加快仿制藥質(zhì)量一致性評價”作為我國改革藥品審評審批制度的五大目標(biāo)之一,；

以2016年3月5日國務(wù)院辦公廳發(fā)布的《關(guān)于開展仿制藥質(zhì)量和療效一致性評價的意見》為節(jié)點(diǎn),，國內(nèi)以生物等效為目標(biāo)的口服制劑一致性評價工作蓬勃開展；

2017年 12月,，CDE一致性評價辦公室又發(fā)布 了《已上市化學(xué)仿制藥 (注射劑) 一致性評價技術(shù)要求 (征求意見稿)》,，揭開了注射劑仿制藥一致性評價的大幕。

雜質(zhì)研究一直是仿制藥一致性評價中審評的重點(diǎn),。

鑒于仿制藥與參比制劑生產(chǎn)工藝的差異,，二者的雜質(zhì)譜可能不完全相同。

雖然按新仿制藥的一般要求,，對參比制劑中不存在的“新雜質(zhì)”原則上要按照 ICH的要求進(jìn)行控制,，對各國藥典已經(jīng)收載的“已知雜質(zhì)”原則上要進(jìn)行鑒別與比較。

但進(jìn)行一致性評價的國產(chǎn)制劑通常在臨床中已應(yīng)用了較長時間,，歷年的藥物不良反應(yīng)信息可以在一定程度上揭示仿制藥的安全信息,。如何基于風(fēng)險控制理念，形成我國仿制藥一致性評價中的雜質(zhì)評估/控制策略，是業(yè)界和監(jiān)管部門面臨的新挑戰(zhàn),。

伴隨著對原料藥和制劑中各種工藝雜質(zhì) (包括基因毒性雜質(zhì)) 和降解產(chǎn)物監(jiān)管要求的不斷提高,，對痕量水平雜質(zhì)的表征和分析在藥物雜質(zhì)譜分析中越來越受到重視。

各類分析儀器的發(fā)展,，特別是GC-MS,、LCMS、CE-MS,、SFC-MS,、LC-NMR、CE-NMR,、LC-FTMS 等聯(lián)用技術(shù)的發(fā)展,，可實(shí)現(xiàn)在線對含量在～0.1%水平的雜質(zhì)進(jìn)行快速分析。

近年來,，對已知雜質(zhì)的快速識別策略已經(jīng)相當(dāng)完善,；利用在線或離線的 HPLCMS和/或HPLC-NMR技術(shù)，或樣品不經(jīng)分離直接進(jìn)行NMR分析并結(jié)合光譜分析,，對未知雜質(zhì)和降解物快速進(jìn)行結(jié)構(gòu)確認(rèn)也取得較大進(jìn)展,；基因毒性雜質(zhì) (MIs) 和手性藥物對映體的分析檢查也受到高度重視。

1 MIs分析

Teasdale等對 ICH M7實(shí)施以來 MIs 的分析進(jìn)展進(jìn)行了系統(tǒng)的綜述：新的分析方法更注重對一類而不是單一的 MIs 進(jìn)行分析,，方法開發(fā)除要求具有更高的靈敏度和專屬性外,，還應(yīng)盡量減少基質(zhì)效應(yīng)的干擾。

氣相色譜法 (GC) 是分析具揮發(fā)性 MIs 的 首選方法,，高效液相色譜法 (HPLC) 用于對非揮發(fā)性 MIs 的分析,；可以通過衍生化等方法改善 MIs 的揮發(fā)性和穩(wěn)定性；采用頂空進(jìn)樣方式可以有效避免基質(zhì)效應(yīng),，使得更易方法開發(fā),。

已有綜述詳細(xì)論述了系統(tǒng)分析 MIs 的一般策略與方法。

Sun 等基于 MIs 的揮發(fā)性,，從避免基質(zhì)干擾的角度提出了選擇 MIs 分析方法的決策樹 (圖2),，并用于探討穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)中易形成基因毒性雜質(zhì)的常見降解途徑,，用以指導(dǎo)藥物的研發(fā)與審批,。

HILIC (親水相互作用色譜法) 作為其他色譜技術(shù)特別是GC的互補(bǔ)方法，常用于替代GC對極性 MIs進(jìn)行分析,。

采用 HILIC-UV法測定達(dá)伐吡啶 (dalfampridine) 中5種潛在的芳香胺類MIs,，其中，色譜柱的選擇是關(guān)鍵：

Zorbax硅膠柱 (5 μm) 能給出理想的分析結(jié)果,，其他 HILIC 柱如兩性柱 (ZIC-HILIC 柱) 或腈基柱 (nitrile-HILIC 柱) 的峰形較差,，離子對試劑可導(dǎo)致方法的回收率變差；而C8或C18色譜系統(tǒng)的選擇性較差,。

利用ZIC-pHILIC親水作用色譜柱,，采用CAD 或 NQAD 檢測器,，在含 TFA 流動相中可對 12 種不具紫外吸收的堿性 MIs 包括已知致癌物肼 (hydrazine) 進(jìn)行測定。

Denton 等利用 HILIC 實(shí)現(xiàn)了對微量氯丙二醛(2-chloromalonaldehyde) 的分析 ,。Dou?a 等利用 HILIC-MS 方法分析沃替西汀 (vortioxetine) 中微量的二 (2-氯乙基) 胺 [2-chloro-N-(2-chloroethyl) ethanamine],。

衍生化技術(shù)可以進(jìn)一步提高 MIs 分析的靈敏度。

Grinberg等在乙腈中以吡啶為衍生化試劑,，對美托洛爾起始原料中的硫酸二甲酯 (dimethyl sulfate,，DMS) 進(jìn)行衍生化處理，分析衍生化產(chǎn)物 N-甲基吡啶,；采用HILIC-ESI-MS的SIM檢測模式,，DMS的線性范圍為 0.05～10 ppm，LOD 和 LOQ 分別為 0.4 和 1 ppm,；

利用新型的衍生化試劑 BPPC [butyl-1-(pyri‐ dine-4-yl) piperidine-4-carboxylate],，采用HILIC-MS/MS 方法，可作為 API 中烷基鹵化物和烷基磺酸鹽的常規(guī)分析方法或篩查方法,，前者的檢測水平為0.1 ppm,，后者 為1 ppm，且方法不易受基質(zhì)的干擾,。

離子色譜法雖然常作為GC-MS或HPLC-MS的輔助技術(shù),，用于分析強(qiáng)極性的 MIs 如烷基氯化物 (alkyl chlorides)、肼等,，但近年來的進(jìn)展較小,。

Frenzel等對離子色譜分析中常用的膜凈化方法進(jìn)行了綜述；采用在線固相萃取技術(shù),，測定甲磺酸雷沙吉蘭中的痕量羥胺：樣品溶液中的甲磺酸雷沙吉蘭被截留在 IonPac CG12A 固相萃取柱上,，羥胺進(jìn)入色譜測定單元 (CG12A 保護(hù)柱、CS12A 分析柱,、安培檢測器),；方法的 LOD和LOQ分別為0.02和0.04 μg·mL-1。

超臨界色譜 (SFC) 也常作為 HPLC 的互補(bǔ)方法,。

Lesellier 和 West對近年來SFC的技術(shù)進(jìn)展進(jìn)行了綜述,。以超臨界二氧化碳為流動相，甲醇為極性改性劑,，采用兩種不同的苯基柱 (Synergi polar RP和Cosmosil 5PBB),，比較 SFC 對多環(huán)芳烴 (PAHs) 分離的選擇性：

發(fā)現(xiàn) PAHs 在 SFC 和 HPLC 中的保留行為不同；改性劑甲醇的濃度對 MIs 在 Synergi polar RP 柱的分離影響較大,，但對 Cosmosil 柱的分離影響較小,。比較 SFC-ELSD 和 HPLC-ELSD 分析 PVC 塑料中的塑化劑 (ATBC、 DEHA、DEHT,、TOTM),，SFC-ELSD 的靈敏度更高，但 HPLC-ELSD的精密性更好,。

毛細(xì)管電泳 (CE) 及電色譜技術(shù)對極性樣品具有良好的分離選擇性,，雖然其靈敏度較低，通常不宜用于 MIs分析,；但 CE 的載樣量高,，間接紫外檢測的檢測限可達(dá)2～3 ppm；作為HPLC 的互補(bǔ)分離技術(shù),，在分析原料藥中磺酸基,、肼/烷基胺、 疊氮化物,、硫酸二甲酯和氯乙酰等PMIs中均有應(yīng)用,。

硼酸及相關(guān)酯類作為新的 MIs，主要在一些高效偶聯(lián)反應(yīng)如鈴木-宮浦 (Suzuki-Miyaura) 反應(yīng)中產(chǎn)生,。由于硼酸類 MIs 可以通過對硼元素的測定,，再通過化學(xué)計量關(guān)系得到其含量，因此,，利用 ICP-MS和硼靶對樣品中的殘留硼進(jìn)行測定,，不僅靈敏度高 (LOQ為 0.8 ppm，限度值為40 ppm),，選擇性好,，且可避免常見的基質(zhì)干擾。

Patel 等對該方法的參數(shù)設(shè)置及優(yōu)化中常見的問題進(jìn)行了綜述,。對烷化劑類MIs的測定常采用 GC-MS 或 HPLC-MS (經(jīng)衍生化處理) 方法,，但鑒于 ICP對硫和鹵素元素的測定已達(dá)到ppb級，這為烷化劑的分析提供了新的解決方案,。

利用 HPLC-ICP-MS 分析烷基化劑 4-氯-1-丁醇,，采用 3-碘苯甲酰試劑進(jìn)行衍生化，方法的 LOD 和 LOQ 分別為 0.2 和 0.5 ppm,，線性范圍 (μg·g-1 API) 為0.5～50 ppm,，1～50 ppm的準(zhǔn)確性為 95.1%～?114.7%，重復(fù)性 (RSD) 為 6.2% ,。

采用相同的方法測定烷化劑苯肼可得到相似的結(jié)果,，如采用三碘代衍生物試劑,，可提高方法的靈敏度,，LOD 和LOQ分別為0.06和0.2 ppm。

2 元素雜質(zhì)分析

各類元素雜質(zhì)可能在藥品生產(chǎn)的諸環(huán)節(jié)中被無意引入終產(chǎn)品對患者造成危害。

ICH Q3D 建議對藥品中的元素雜質(zhì)應(yīng)進(jìn)行定性和定量限制,，藥品中各類元素雜質(zhì)的可接受的每日接觸量 (per‐ missible daily exposure,，PDE) 限度與給藥途徑有關(guān)，USP在新頒布的通則中對藥品中的24個元素雜質(zhì)提出了明確的質(zhì)控要求 (表1),，目前國內(nèi)藥物研發(fā)的相關(guān)法規(guī)政策也正逐漸向ICH靠攏,。

通常藥品終產(chǎn)品中殘存的痕量或超痕量的Ir、Os,、 Pd,、Pt、Rh 和 Ru 等元素雜質(zhì),，可能與原料合成中使用的催化劑有關(guān),；

Cd、Hg,、Ni,、Pb等元素雜質(zhì)可能通過生產(chǎn)中的水和溶劑、合成試劑,、輔料 (穩(wěn)定劑,、填充劑、粘合劑,、顏料,、香料和涂料) 等途徑污染藥物；

而 Cr,、Cu,、 Mo、Ni,、V 等元素雜質(zhì)可能與制造過程中產(chǎn)品與混合罐,、過濾器、填充線,、包裝容器等表面的接觸污染產(chǎn)品,。

Jenke 等對由藥品生產(chǎn)和包裝環(huán)節(jié)引入元素雜質(zhì)的風(fēng)險進(jìn)行了綜述。與藥物接觸的各類生產(chǎn)線,、包裝容器等材料,，與藥品接觸時通常只有微量的元素實(shí)體可轉(zhuǎn)移至藥品中。因此,，雖然某些元素雜質(zhì)在自然環(huán)境中普遍存在,，但經(jīng)制藥過程和包裝材料引入藥品的風(fēng)險并不高。

電感耦合等離子體-質(zhì)譜法 (ICP-MS) 是目前測定元素雜質(zhì)的最常用手段,，其次是電感耦合等離子體原 子發(fā)射光譜法 (ICP-AES),，它們均可在多類樣品基質(zhì)中同時檢測多種元素雜質(zhì),；

當(dāng)僅對一種或幾種特定元素雜質(zhì)如Hg、As和Cr進(jìn)行測定時,，傳統(tǒng)的原子吸收光譜法 (AAS) 也可得到理想的分析結(jié)果,。

Li等綜述了 31種 190個藥用輔料樣品元素雜質(zhì)的檢測方法及測定結(jié)果，ICP-MS特別適用于對日攝入量高的注射劑和吸入制劑中微量元素雜質(zhì)的測定,，定量精密度 (RSD) 小于 4.5%,；ICP-OES 的操作較簡單且具有較快的分析速度，通?？捎糜谠牧虾涂诜苿┲械脑仉s質(zhì)分析,；兩種分析技術(shù)的測定結(jié)果均可滿足 USP 通則的要求。

Menoutis 等采用超聲霧化 (UN) 軸向電感耦合等離子原子發(fā)射光譜法 (ICP-AES) 測定微量的一類和二類元素雜質(zhì),，較常規(guī)ICP-MS分析具有更低的檢出限,。

采用微波輔助消解 (MWAD) 技術(shù)對樣品進(jìn)行前處理是元素雜質(zhì)分析的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。USP通則給出了兩種通用方法,，分別用于ICP-AES分析和ICP-MS 分析,。

Jin對元素雜質(zhì)分析樣本前處理中的常見污染途徑進(jìn)行了綜述，對實(shí)驗(yàn)室環(huán)境,、試劑和器皿的控制是保證測定結(jié)果準(zhǔn)確的關(guān)鍵,。

Muller等通過比較濃硝酸、王水 (aqua regia) 和逆王水 (inverse aqua regia) 對 4 種原料藥的微波消解效率,，發(fā)現(xiàn)硝酸和逆王水較理想,，前者可有效消解500 mg樣品，后者適用于250 mg 以下樣品的消解,，所有的測定元素 (除 Os元素易形成 OsO4影響回收外) 均有較好的回收率 (91%～109%),；

da Silva 等利用逆王水建立了適用于采用 ICP-OES 和ICP-MS快速分析As、Cd,、Hg,、Pb 的簡單微波輔助消解方法；Paskiet等比較了多種對合成橡膠中元素雜質(zhì)的提取方法,。

3 浸出物/萃取物分析

藥品中的浸出物一般認(rèn)為是在常規(guī)或加速條件下,，從與藥物接觸的實(shí)體 (包裝材料、注射器,、輸液管等) 中遷移至藥品中的化學(xué)物質(zhì),；對藥品中各類浸出物的分析屬于雜質(zhì)譜分析的一部分。

而萃取物一般認(rèn)為是在實(shí)驗(yàn)室受控萃取研究中從試驗(yàn)品釋放到萃取介質(zhì)中的化學(xué)物質(zhì),。

萃取物包括各類揮發(fā)性,、半揮發(fā)性、非揮發(fā)性的有機(jī)和無機(jī)化合物,，開展受控萃取研究是希望了解藥品真實(shí)的浸出物譜,，進(jìn)而評估各類浸出物的安全風(fēng)險,。

理想的情況是按照質(zhì)量源于設(shè)計 (quality by design，QbD) 的理念,，依據(jù)藥品的組成,、包裝系統(tǒng)的組成與型狀,、與藥物的接觸情況等,，評估得到在生產(chǎn)及貯存過程藥品中浸出物的安全空間；Jenke以塑料包裝的注射液為例,，論證了該理念的可行性,。

從藥用聚合物材料萃取物中鑒定出的 540 余種化合物的毒理學(xué)信息包括未觀察到作用的水平 (no observed effect levels，NOELs),、未觀察到有害作用的水平 (no observed adverse effect levels,，NOAELs)、公布的最低中毒劑量 (lowest published toxic dose,，TDLOs) 等毒理學(xué)終點(diǎn)指標(biāo)已被匯總,，可用于浸出物的風(fēng)險評估 ；

由一個非營利性聯(lián)合體-產(chǎn)品質(zhì)量研究所 (PQRI) 設(shè)立的浸出物/萃取物工作小組,，對藥品研發(fā)過程中與 浸出物/萃取物有關(guān)的科學(xué)和管理問題進(jìn)行了探討,，目前已在浸出物/萃取物分析的標(biāo)準(zhǔn)化工作程序和安全閾值等方面達(dá)成共識，且分別用于對口腔吸入劑,、鼻腔 制劑,、注射劑、眼用制劑中的浸出物的風(fēng)險評估,。

采用水和有機(jī)萃取溶劑對生產(chǎn)注射劑包裝袋的 21 種常用聚丙烯樹脂進(jìn)行萃取研究,，并根據(jù)萃取物譜評估其對注射劑長期、大劑量治療時的潛在風(fēng)險,。

雖然由于處方工藝的差異,，在不同萃取條件下不同的聚丙烯樹脂的有機(jī)萃取物譜差異較大，但依據(jù)特定的萃取成分如抗氧劑等可將其分為不同的組,，同組樣品的萃取物譜具有相似性,；大多數(shù)萃取液中元素雜質(zhì) (鋁、 硅,、堿金屬和堿土金屬) 的量均較低,。

浸出物/萃取物分析的另一關(guān)鍵點(diǎn)是如何保證所有浸出/萃取出的物質(zhì)都得到檢出。

色譜法是常用的分析方法,。

Jenke 等采用互補(bǔ)的色譜系統(tǒng)如 GC 和 HPLC結(jié)合多種檢測方式,，分析藥物包裝、生產(chǎn)和釋藥系統(tǒng)等常用的塑料材料中的萃取物譜,，為防止色譜分析中遺漏了某些萃取物,，利用總有機(jī)碳含量 (TOC) 測 定法評估對各類水提物 (包括緩沖液提取物) 分析結(jié)果的完整性,，并在對無菌濾器水提物等的分析中得到了較好的應(yīng)用。

對提取物中不適合用 GC進(jìn)行分析的非揮發(fā)性及熱不穩(wěn)定化合物,，在由大氣化學(xué)電離質(zhì)譜結(jié)合紫外檢測器組成的 UPLC 系統(tǒng)中,，22 min 即可實(shí)現(xiàn)對多種常見提取物中的代表性化合物混合物進(jìn)行充分的分離與檢測，在對實(shí)際萃取樣品進(jìn)行分析時,，即使分析對象是不相容的有機(jī)萃取液,，也不會對色譜系統(tǒng)產(chǎn)生顯著影響。

通過模擬浸出 (遷移) 試驗(yàn) (由低密度聚乙烯瓶,、 聚丙烯瓶蓋和膠塞等組成,、萃取溶劑分別為 pH 2.5的緩沖溶液、pH 9.5 的緩沖溶液和體積比 1∶1 的異丙醇/ 水),，揭示注射劑和滴眼劑包材的浸出物譜,。

包材的萃取物譜與包材的化學(xué)組成與結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，且受萃取介質(zhì)和具體浸出物化學(xué)性質(zhì)的影響,；雖然藥物與包材直接接觸可能加速某些浸出物的遷移,，但并不是發(fā)生遷移和浸出的先決條件。

膠塞中的析出物與頭孢菌素相互作用,，導(dǎo)致貯存過程中藥品溶解時逐漸變渾濁 是國內(nèi)突出的質(zhì)量問題 ,。

利用 GC-MS 建立的膠塞揮發(fā)性成分分析數(shù)據(jù)庫，不僅可以快速分析常用膠塞中的主要揮發(fā)性遷移物,，還可以快速確認(rèn)易與頭孢菌素相互作用的遷移物,；結(jié)合模擬吸附試驗(yàn)，可形成有效的頭孢菌素-膠塞相容性試驗(yàn)策略,，進(jìn)而針對性地建立膠塞質(zhì)控方法,。

4 AQbD 理念及應(yīng)用

風(fēng)險管理理念與質(zhì)量保證體系的緊密結(jié)合是保證藥品質(zhì)量的重要環(huán)節(jié)。

雜質(zhì)譜控制過程中,，保證雜質(zhì)質(zhì)控分析方法在整個藥品生命周期都具有良好的專屬性和敏感性,。

分析方法質(zhì)量源于設(shè)計 (analytical quality by design，AQbD) 理念作為 一種面向風(fēng)險管理的方法論,，近年來在建立雜質(zhì)譜分析方法時被廣泛接受,。

與傳統(tǒng)的質(zhì)量源于檢測 (quality by testing，QbT) 方法相比較,，其根據(jù)分析目標(biāo)的變 化范圍 (analytical target profile,，ATP)，利用實(shí)驗(yàn)設(shè)計 (design of experiment,，DoE) 的方法,，同時考慮管理與分析方法的風(fēng)險來確定設(shè)計空間 (design space，DS),，可最大程度的保證方法的有效性 ,。

采用 AQbD理念建立的分析方法,，由于允許實(shí)驗(yàn)參數(shù)在操作設(shè)計區(qū)域 (method operable design region，MODR) 內(nèi)變化,，方法具有更好的粗放性,，可減少實(shí)驗(yàn)中的超出趨勢結(jié)果 (out of trend，OOT) 和超出標(biāo)準(zhǔn)結(jié)果 (out of specifica‐ tion,，OOS),；

同時，由于可最大限度地減少在方法轉(zhuǎn)移 (transfer),、性能確認(rèn) (verification) 和方法變更中的工作量,，有助于降低對分析方法生命周期管理包括方法設(shè)計,、方法開發(fā)和方法驗(yàn)證 (儀器的檢定,、持續(xù)的方 法性能驗(yàn)證和方法轉(zhuǎn)移) 的成本。

Dispas等對近年來 AQbD在雜質(zhì)譜分析中的應(yīng)用進(jìn)展進(jìn)行了綜述,。在基于AQbD理念的HPLC方法開發(fā)中,，化學(xué)計量學(xué)方法在確定適宜的設(shè)計方案篩選關(guān)鍵影響因子，建立定量關(guān)系模型確定方法的操作空間等方面,，發(fā)揮著越來越重要的作用 (圖3) ,。

對利用 HPLC-MS/MS 等聯(lián)用技術(shù)建立的可同時測定幾十至幾百種目標(biāo)分析物的分析方法，如對殘留農(nóng)藥等的測定,，按傳統(tǒng)的方法驗(yàn)證要求,，通常需要采用標(biāo)準(zhǔn)加入法對定量準(zhǔn)確性等參數(shù)進(jìn)行驗(yàn)證。

該驗(yàn)證程序不僅費(fèi)時,、費(fèi)力,；且當(dāng)目標(biāo)分析物變化如增加了新的控制對象時，需重新對方法進(jìn)行驗(yàn)證,；實(shí)驗(yàn)中如對照品的加入量不適宜,，還可能得到不正確的驗(yàn)證結(jié)果。

Alladio等利用化學(xué)計量學(xué)方法,，建立了對新目標(biāo)分析物的保留時間,、基質(zhì)效應(yīng)、回收率,、LOD 和 LOQ 進(jìn)行預(yù)測的偏最小二乘法模型,，用于評價已有方法對新目標(biāo)分析物的分析能力，并取得了預(yù)期的評價效果,。

利用定量結(jié)構(gòu)-保留關(guān)系 (QSRR) 不僅可以預(yù)測分析物的保留時間,，且有助于對其分離機(jī)制的了解。對未知組分保留值的預(yù)測可以幫助選擇分析方法,，減少方法開發(fā)的時間,。

Amos等對建立QSRR模型的方法,、關(guān)鍵點(diǎn)和預(yù)測精度等進(jìn)行了綜述。根據(jù)溶質(zhì)的色譜相 似度指數(shù) (chromatographic similarity index) 建立局部 QSRR 模型可準(zhǔn)確預(yù)測溶質(zhì)的保留值,。

比較 4 種常用的評價 QSRR 模型預(yù)測準(zhǔn)確性的表征方法,，認(rèn)為預(yù)測均方根誤差百分比 (RMSEP) 是對 QSRR 模型預(yù)測能力的最佳估計值。

利用定量結(jié)構(gòu)-保留關(guān)系 (QSRR) 模型,，通過預(yù)測分析物在 5種不同 HILIC固定相上的保留值,，可以幫助選擇最適宜分離的固定相。

利用定量結(jié)構(gòu)-保留關(guān)系 (QSRR) 結(jié)合疏水消除模型 (HSM),，預(yù)測分析物在反相液相色譜系統(tǒng) (RPLC) 中的保留值,，可以預(yù)測藥物雜質(zhì)是否與藥物活性成分 (API) 的共洗脫。

當(dāng)缺乏雜質(zhì)對照品,，無法判斷一個新建立的色譜方法是否可以對藥物中所有的已知雜質(zhì) 都能檢出時,，利用QSRR模型，通過預(yù)測已知雜質(zhì)的保留時間,，可以幫助判斷方法對已知雜質(zhì)的檢出能力,，并可以預(yù)測新雜質(zhì)的色譜行為。

5 其他

選擇適宜的色譜柱依然是藥物雜質(zhì)譜分析的熱點(diǎn),。

不同色譜柱的選擇性差異,，常導(dǎo)致無法重現(xiàn)文獻(xiàn)甚至藥典中收載的成熟的雜質(zhì)分析方法。因此,，如何快速尋找到性能適宜的色譜柱常成為實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵,。

基于疏水消除模型的色譜柱表征體系已在色譜柱的選擇包括選擇相似或互補(bǔ)的色譜柱、選擇最佳分離色譜柱中廣泛應(yīng)用,，并推動了色譜柱選擇模式的發(fā)展,。

基于疏水消除模型，發(fā)現(xiàn)影響 β-內(nèi)酰胺類抗生素難分離雜質(zhì)對分離的關(guān)鍵色譜柱參數(shù)是柱參數(shù) A,，并提出了參數(shù) A 的最佳區(qū)間,。

以克拉霉素雜質(zhì)分析為例，選擇適用于分離難分離雜質(zhì)對的色譜柱,，提出了應(yīng)用疏水消除模型針對特定分析方選擇最佳色譜柱的策略,。

上述研究體現(xiàn)了色譜柱選擇理論在實(shí)用化方面取得的進(jìn)展，而通過分子模擬方法如分子動力學(xué)或蒙特卡羅方法,，最大化地減少實(shí)驗(yàn)篩選過程是色譜柱選擇應(yīng)用研究的目標(biāo),。

藥物雜質(zhì)譜分析中的另一關(guān)鍵點(diǎn)是對雜質(zhì)的檢測與定量。

在對各類不具有UV吸收的樣品的分析中,，基于氣溶膠 (aerosol-based) 檢測的各類通用性檢測器特別是電噴霧檢測器 (charged aerosol detectors,，CAD) 和電化學(xué)檢測器發(fā)揮著越來越重要的作用。

雖然CAD檢測器被普遍認(rèn)為是一種質(zhì)量型檢測器，可以在沒有對照品的情況下實(shí)現(xiàn)對溶質(zhì)絕對含量的準(zhǔn)確估計,，然而對50種具有廣泛物理化學(xué)性質(zhì)的化合物的HPLC-CAD 測定結(jié)果表明,，相對于傳統(tǒng)的質(zhì)量校正定量方法，通過估計檢測顆粒的相對表面積進(jìn)行校正,，可得到更準(zhǔn)確的定量結(jié)果,，特別是可以明顯提高對密度較高溶質(zhì)定量的準(zhǔn)確性 (與NMR定量的平均誤差為5.8%) 。

在雜質(zhì)譜分析中利用雜質(zhì)對照品進(jìn)行定性與定量分析是最理想的方案,，在藥典等質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中,，雜質(zhì)對照品的使用也越來越普遍。與此同時,，對雜質(zhì)對照品的制備,、供應(yīng)等全生命周期的管理要求也越來越嚴(yán)格。

化學(xué)藥品雜質(zhì)譜控制的現(xiàn)狀與展望（下：應(yīng)用篇）

藥物中的雜質(zhì)包括工藝雜質(zhì)和降解雜質(zhì),。

基于藥物的結(jié)構(gòu),、來源、工藝等特點(diǎn),，從整體上思考一類藥物的雜質(zhì)譜分析策略,，是雜質(zhì)譜控制的一個飛躍,，對產(chǎn)品的質(zhì)量控制具有更實(shí)際的意義,。

1 雜質(zhì)譜分析方法

如何明確藥品中的雜質(zhì)組成進(jìn)而建立適宜的分析方法是雜質(zhì)譜分析首先需要解決的問題。

在國內(nèi)根據(jù)特定品種在藥典標(biāo)準(zhǔn)中收載的具體雜質(zhì)結(jié)構(gòu),，結(jié)合文獻(xiàn)報道結(jié)果,，對已有雜質(zhì)譜分析方法進(jìn)行改進(jìn)與優(yōu)化，依然具有較好的實(shí)用性,。

如對塞來昔布,、鹽酸西那卡塞、桿菌肽原料藥,、克霉唑乳膏和復(fù)方依折麥布瑞舒伐他汀鈣片有關(guān)物質(zhì) HPLC分析方法的改進(jìn)等,。而根據(jù)原料合成及制劑工藝的特點(diǎn)，建立適宜的雜質(zhì)譜分析方法,，對生產(chǎn)工藝進(jìn)行評價與控制則成為新的熱點(diǎn),。

如對安塞曲匹、富馬酸沃諾拉贊,、呋布西林鈉原料及鹽酸伐地那非口腔崩解片有關(guān)物質(zhì)的分析等,。

藥物穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)作為確定藥物中降解雜質(zhì)的重要環(huán)節(jié)，強(qiáng)制降解試驗(yàn)作為預(yù)測藥物長期穩(wěn)定性的重要工具,，可以了解藥品的可能降解途徑和降解產(chǎn)物等,，進(jìn)而指導(dǎo)建立雜質(zhì)譜分析方法。

通過對穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)方案的合理設(shè)計，不僅可以評價藥物處方的合理性,，確定產(chǎn)品的有效期,、復(fù)驗(yàn)期和貯存條件等，滿足監(jiān)管的需要,，且穩(wěn)定性試驗(yàn)中產(chǎn)生的降解雜質(zhì)還可以用于驗(yàn)證雜質(zhì)譜分析方法的有效性,。

如通過對氨曲南穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)中 3 個新未知降解雜質(zhì)的鑒定，建立了新的雜質(zhì)控制方法 ,。利用強(qiáng)制降解試驗(yàn)還有助于在雜質(zhì)譜分析中對雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)進(jìn)行確認(rèn),，如利用強(qiáng)制降解試驗(yàn)分析利奈唑胺片、頭孢拉定二水合物,、紫杉醇及其注射液的雜質(zhì)譜等,。

此外，通過對不同廠家生產(chǎn)的注射用頭孢西丁鈉雜質(zhì)譜及雜質(zhì)降解途徑異同的分析,，并結(jié)合強(qiáng)力破壞試驗(yàn)對樣品中主要雜質(zhì)的來源和降解途徑進(jìn)行研究,，可以更全面地了解產(chǎn)品的特性，進(jìn)而完善藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn),。

在國家評價性抽驗(yàn)中,，通過對市場中不同企業(yè)相同產(chǎn)品的雜質(zhì)譜的系統(tǒng)比較，可以較好地掌握同品種藥品制劑中雜質(zhì)譜的組成等信息,，進(jìn)而建立理想的雜質(zhì)譜分析方法,。

如對多肽類藥物醋酸奧曲肽原料及其制劑 、半合成抗生素依托紅霉素片與醋酸麥迪霉素顆粒劑,、化學(xué)藥口服制劑普伐他汀鈉及其制劑 ,、纈沙坦膠囊、非甾體抗炎藥酮咯酸氨丁三醇注射液,、順鉑注射劑和利多卡因氣霧劑等有關(guān)物質(zhì)分析方法的建立,；而采用試驗(yàn)設(shè)計理念對復(fù)雜成分的樣品如丙酸交沙霉素進(jìn)行方法優(yōu)化，可獲得更理想的分離結(jié)果,。

而對不同企業(yè)產(chǎn)品雜質(zhì)譜的比較,，可用以評價產(chǎn)品質(zhì)量的差異，揭示生產(chǎn)工藝與雜質(zhì)譜的相關(guān)性,。

如對硫酸依替米星,、注射用磺芐西林鈉、和注射用頭孢西丁鈉等的質(zhì)量評價,。

將雜質(zhì)譜分析與生產(chǎn)過程相關(guān)聯(lián),，則可以更好地理解生產(chǎn)工藝與雜質(zhì)譜的關(guān)系，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)地對關(guān)鍵生產(chǎn)工藝的控制,。

如阿莫西林克拉維酸鉀片劑雜質(zhì)譜分析結(jié)果揭示,，制劑過程中阿莫西林三水合物的脫水與阿莫西林閉環(huán)二聚體的產(chǎn)生呈正相關(guān)；

頭孢拉定顆粒雜質(zhì)譜分析結(jié)果揭示，對制粒前溫濕度的控制是工藝控制的關(guān)鍵,；

注射用鹽酸甲氯芬酯雜質(zhì)譜分析結(jié)果揭示,，雜質(zhì) A 為水解雜質(zhì)，主要由制劑冷凍干燥過程引入,，雜質(zhì)B和雜質(zhì)C為醇解雜質(zhì),，主要由原料藥合成工藝引入，與工藝中使用的低級醇類有關(guān),。

而注射用氨芐西林鈉氯唑西林鈉雜質(zhì)譜的差異主要與氨芐西林鈉原料的生產(chǎn)工藝有關(guān),，冷凍干燥工藝的氨芐西林鈉原料較溶媒結(jié)晶工藝產(chǎn)品更不穩(wěn)定，制劑更易受溫度等環(huán)境因素的影響,。

選擇適宜的手性色譜柱常規(guī) HPLC 方法,，對實(shí)際產(chǎn)品中的手性雜質(zhì)進(jìn)行分析，依然是藥品質(zhì)量控制的常用方法,。

如采用硅膠表面涂布直鏈淀粉-三 (3,5-二 甲苯基氨基甲酸酯) 為填充劑的手性色譜柱,，對替格瑞洛中異構(gòu)體雜質(zhì)、枸櫞酸托法替尼原料及片劑中對映異構(gòu)體雜質(zhì)的測定等,。

然而采用超臨界流體色譜法對藥物中對映異構(gòu)體的分析是近年來的研究熱點(diǎn),。

如對1,4-二氫吡啶類鈣拮抗劑 (尼索地平、西尼地 平,、普拉地平,、阿折地平、鹽酸馬尼地平) 的手性拆分,，對依折麥布及其R-對映體的手性拆分等,。

對多肽類藥物的雜質(zhì)控制研究也受到關(guān)注。

如以多肽合成中的中間體,、潛在副產(chǎn)物和降解產(chǎn)物等為研究對象，建立醋酸亮丙瑞林 (一種合成的線性九肽) 有關(guān)物質(zhì)分析方法,；采用 LC-MS 分析鮭降鈣素注射液中的降解雜質(zhì),；采用離子色譜對糖肽類藥物中游離糖含量的分析等。

對氨基酸類,、糖類和酯類等結(jié)構(gòu)相對簡單且不具有 UV 吸收的藥物/輔料的雜質(zhì)分析研究的進(jìn)展較緩慢,，雖然有采用超臨界流體色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)定性分析中/長鏈結(jié)構(gòu)甘油三酯組成的報道，但主要研究仍采用 HPLC 紫外末端檢測.

如測定門冬氨酸鉀鎂注射液中門冬氨酸的有關(guān)物質(zhì),、鹽酸氨基葡萄糖的有關(guān)物質(zhì)等,；如引入新分離機(jī)制的色譜系統(tǒng)如 HILIC 等，結(jié)合新型的檢測器如CAD,、NQAD等,，有望促進(jìn)該領(lǐng)域的發(fā)展。

對 β-內(nèi)酰胺抗生素中聚合物的分析，目前中國藥典收載的 Sephadex-G10 凝膠色譜系統(tǒng)已經(jīng)無法滿足現(xiàn)代質(zhì)控的需要,，而基于高效凝膠色譜技術(shù)方法的專屬性也越來越受到挑戰(zhàn),。

由于二維色譜技術(shù)的發(fā)展，利用柱切換技術(shù)可以方便地將凝膠色譜系統(tǒng)中的色譜峰在常規(guī) HPLC 色譜系統(tǒng)中進(jìn)行定位,，結(jié)合 LCMS技術(shù)即可在雜質(zhì)分析方法中將聚合物雜質(zhì)作為特定雜質(zhì)進(jìn)行控制,，這也將成為控制β-內(nèi)酰胺抗生素聚合物的發(fā)展方向。

2 微量雜質(zhì)結(jié)構(gòu)解析

采用 LC-MS 技術(shù)對產(chǎn)品中的工藝雜質(zhì)和降解產(chǎn)物等微量成分的結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行分析,，依然是目前識別雜質(zhì)結(jié)構(gòu)的主要方法,，對同系物藥物及雜質(zhì)裂解規(guī)律的探討有助于對雜質(zhì)的識別。

而 NMR 技術(shù)及聯(lián)用技術(shù)在雜質(zhì)定性分析中的應(yīng)用也越來越廣泛,。

國內(nèi)近年來在對結(jié)構(gòu)復(fù)雜且存在手性中心的未知雜質(zhì)進(jìn)行鑒別時,，普遍采用制備分離，再利用各種波譜技術(shù)對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行推測的策略,。如對鹽酸多西環(huán)素和利福拉齊雜質(zhì)等的鑒別,。

而利用高分辨質(zhì)譜，根據(jù)一級,、二級質(zhì)譜裂解規(guī)律推測化學(xué)藥品中雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)已逐漸成為主流,。

如對尼麥角林、碘海醇中有關(guān)物質(zhì) O-烷基化合物和 N-烷基化合物的準(zhǔn)確分子量和結(jié)構(gòu)推測,，采用電噴霧離子化正負(fù) 2種離子模式鑒定達(dá)比加群酯中間體和瑞舒伐他汀中間體中的雜質(zhì),，采用飛行時間質(zhì)譜推測佐匹克隆、鹽酸左西替利嗪片中的雜質(zhì)結(jié)構(gòu),；采用高分辨飛行時間質(zhì)譜分析氯沙坦鉀和創(chuàng)新藥物艾托莫德中的未知雜質(zhì),。

二維液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)則解決了色譜流動相不適宜直接用于質(zhì)譜分析的難題。如用于分析來氟米特片的雜質(zhì)譜和對咪達(dá)唑侖注射液中雜質(zhì)結(jié)構(gòu)的解析等,。

3 微量/痕量雜質(zhì)分析

對微量毒性雜質(zhì)和 MIs 的分析近年來的發(fā)展較快,。

沈雨婷等采用UPLC-MS/ MS 方法，測定了鹽酸哌替啶原料及注射液中的神經(jīng)毒性雜質(zhì) 1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶,；欒紹嶸等利用離子色譜安培法檢測維生素 B6 與 2-噻吩 乙酸中的氰化物,；周婷等利用乙醇衍生頂空氣相色譜法測定氫氯噻嗪原料藥中微量甲醛和甲酸的含量；采用HPLC柱前衍生化法測定聚山梨酯類輔料中醛類物質(zhì),。

對 MIs 的檢測是當(dāng)前國內(nèi)的熱點(diǎn),。

劉曉丹等對 MIs 在醫(yī)藥工業(yè)中的可能來源等進(jìn)行了分析；張霽等對藥物研發(fā)中 MIs 的控制策略與方法進(jìn)行了綜述,；劉雪薇等綜述了藥物中磺酸酯類MIs的研究進(jìn)展,；謝含儀等對MIs分析方法和前處理技術(shù)的研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述。

雖然采用 HPLC-UV 方法有時可滿足 MIs 常規(guī)質(zhì)控的要求,，如對利伐沙班,、間苯三酚中苯胺類 MIs的分析等,，

但為提高方法的靈敏度與準(zhǔn)確性，更多的是采用 HPLC-MS 和 HPLC-MS/MS 方法,，如對酒石酸伐尼克蘭和氟胞嘧啶中痕量苯胺類MIs的測定,；對硫酸氫氯吡格雷和草酸右旋西酞普蘭中甲苯磺酸酯類MIs的測定；對奧拉帕尼中氨基甲酸酯類 MIs的測定,；對阿哌沙班中的 3-嗎啉基-1-[4-(5-氯戊酰胺基)苯基]-5,6-二氫吡啶-2(1H)- 酮 (2),、卡非佐米中的 (2S)-2-氨基-4-甲基-1-[(2R)-2- 甲基環(huán)氧乙烷基]-1-戊酮 (3)等 MIs 的測定。

然而,，如何將針對具體品種的測定方法形成通用的檢測/篩查平臺是亟待思考的問題,。

在元素雜質(zhì)分析方面，徐文峰等綜述了電感耦合等離子質(zhì)譜 (ICP-MS) 在藥物分析中的應(yīng)用,。采用微波消解-ICP-MS 法,，可對蚓激酶 、鹽酸安舒法辛緩釋片中的多種有害元素同時進(jìn)行測定,。

ICP-MS 法還可同時測定玻璃類藥包材中的多種遷移離子,，有助于開展相容性及對玻璃藥包材的質(zhì)控。如注射用泮托拉唑鈉在低硼硅玻璃管制注射劑瓶中,，經(jīng)強(qiáng)降解試驗(yàn),、加速試驗(yàn)和長期試驗(yàn)后，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)品中的硅,、鈣有上升趨勢,，鋁、硼也有一定程度的上升,，鎂,、鎘、鉛,、砷,、銻遷移數(shù)值略有波動，但均明顯低于 PDE 值要求,；

采用 4% 的醋酸溶液對玻璃藥包材進(jìn)行浸提,，測定浸提液中的 11 種元素雜質(zhì)，發(fā)現(xiàn)鋁的浸出量較高,，澄清劑氧化鈰應(yīng)用廣泛，建議對鋁,、鈰的浸出量作為玻璃藥包材的檢測指標(biāo),。

在對各類藥品包裝材料中浸出物/遷移物的分析方面，系統(tǒng)的研究尚較少見,。

付蒙等采用 GC-MS 分析鹵化丁基膠塞中的揮發(fā)性成分和可提取物信息,，認(rèn)為揮發(fā)性成分中的寡聚物和抗氧劑可以反映生膠的種類與來源,，環(huán)硅氧烷類化合物可以體現(xiàn)不同膠塞的硅化工藝差異，其他揮發(fā)性成分如飽和烷烴類與膠塞具體配方有關(guān),，可提取物成分中的S8,，可用于部分硫化體系的識別。

其他較多的研究集中在對各類殘留物,、添加劑,，特別是抗氧劑遷移量的檢測上。

如采用 GCMS/MS 測定一次性使用輸液器產(chǎn)品中增塑劑偏苯三酸三辛酯 (TOTM) 的溶出量,、采用 LC-MS/MS測定鍍膜膠塞中全氟辛基磺酸 (PFOS) 和全氟辛酸 (PFOA) 的遷移,、采用 GC 測定膠塞環(huán)硅氧烷類化合物的遷移及對三層共擠輸液用袋、塑料輸液包裝材料與容器,、藥用丁基膠塞中的各類抗氧劑等的測定,。

而利用 GC-MS 法在鹽酸金霉素眼膏中發(fā)現(xiàn)多種多環(huán)芳烴和多種鄰苯二甲酸酯，提示對凡士林輔料中的各類遷移物的控制勢在必行,。

4 雜質(zhì)的毒性評估

對化學(xué)藥品中毒性雜質(zhì)的識別和判定一直是雜質(zhì)安全性評價和限度控制的難點(diǎn),。

根據(jù)化學(xué)藥品雜質(zhì)毒性的性質(zhì)，目前可將其分為3類：MIs,，普通毒性雜質(zhì)和普通雜質(zhì),。

對MIs，使用雜質(zhì)純品,，利用體外細(xì)菌致突變試驗(yàn) (Ames 試驗(yàn)) 對其進(jìn)行評估是理想的方法,，

但鑒于實(shí)際應(yīng)用中的困難，F(xiàn)DA 和歐洲藥品管理局 (EMA) 等提出,，在對雜質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定的基礎(chǔ)上,，可利用定量結(jié)構(gòu)-活性關(guān)系 (QSAR) 模型，首先通過計算機(jī)預(yù)測雜質(zhì)是否具有“警示結(jié)構(gòu)”,；

如果計算機(jī)預(yù)測該雜質(zhì)不具有“警示結(jié)構(gòu)”,，則可判斷該雜質(zhì)不具有基因毒性；如果判斷該雜質(zhì)具有“警示結(jié)構(gòu)”,，則可通過 Ames實(shí)驗(yàn)進(jìn)行試驗(yàn)確認(rèn),，若 Ames實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陽性，該雜質(zhì)按 MIs控制,；若為陰性,，則判斷其不具有基因毒性。

對非遺傳毒性雜質(zhì),，通常希望對其是否具有特定的毒性作用進(jìn)行進(jìn)一步的評估,，以便在雜質(zhì)譜控制中確定是否將其作為特定的毒性雜質(zhì)進(jìn)行控制。

利用計算機(jī) (in silico) 預(yù)測雜質(zhì)與 API 的 ADMET 特性的差異,，對雜質(zhì)的毒性作用進(jìn)行評估是一種快速有效的方法,，如對羅氟司特 (roflumilast),、鹽酸頭孢替胺 (cefotiam hydrochloride)諸降解雜質(zhì)的評估。

近年來中國食品藥品檢定研究院與中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所合作,，完善了斑馬魚藥物雜質(zhì)毒性評價平臺：

利用 LC-MS/MS 定量測定頭孢菌素在斑馬魚體內(nèi)的吸收情況,，并進(jìn)一步通過 QSAR 方法，建立了斑馬魚體內(nèi)吸收與藥物結(jié)構(gòu)之間的定量關(guān)系模型,，預(yù)測其他頭孢菌素及雜質(zhì)在斑馬魚體內(nèi)的吸收情況,；

利用胚胎毒性試驗(yàn)中的致畸率、致死率表征雜質(zhì)的急性毒性,，利用毒性表型的差異說明雜質(zhì)毒性反應(yīng)的差異,；

利用幼魚運(yùn)動行為 (游動距離、游動速度,、對光刺激的反應(yīng)) 的改變,，表征雜質(zhì)對機(jī)體神經(jīng)系統(tǒng)的作用；以幼魚心跳速率的改變,，結(jié)合對心臟發(fā)育畸形的觀測,，或成魚心電圖的改變表征雜質(zhì)對心臟功能的影響；

在此基礎(chǔ)上總結(jié)出頭孢菌素結(jié)構(gòu)與急性毒性,、神經(jīng)毒性,、心臟毒性等的關(guān)系，成功地對國家創(chuàng)新藥物頭孢嗪咪鈉中雜質(zhì)的毒性進(jìn)行了預(yù)測,，形成了系統(tǒng)地對頭孢菌素雜質(zhì)毒性評價的策略與方法,。此外，完成了對喹諾酮類藥物結(jié)構(gòu)與神經(jīng)毒性等關(guān)系的探討,。

在此基礎(chǔ)上,，又將系統(tǒng)毒理學(xué)研究的策略和方法應(yīng)用到對雜質(zhì)的毒性評價中：通過生物信息學(xué)方法，篩選藥物與雜質(zhì)的差異表達(dá)基因 (DEGs) 和差異共表達(dá)基因 (CDEGs),；

構(gòu)建藥物-基因,、藥物-信號通路分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，探討特定的靶器官毒性及作用機(jī)制,；

構(gòu)建蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò),，尋找藥物毒性作用的可能靶分子；

利用同源建模和分子對接技術(shù),，預(yù)測和模擬雜質(zhì)與靶分子之間的相互作用,。

完成了對C-7位含有氨噻肟結(jié)構(gòu)的頭孢菌素結(jié)構(gòu)與神經(jīng)毒性、心臟毒性的關(guān)系探討,，C-3 位含有巰甲基四氮唑結(jié)構(gòu)的頭孢菌素結(jié)構(gòu)與胚胎毒性等的關(guān)系探討,；利用轉(zhuǎn)錄組技術(shù)結(jié)合拉曼成像，對頭孢哌酮雜質(zhì)的靶器官進(jìn)行 了評價,；

利用分子對接技術(shù),，對鹽酸頭孢替胺熱異構(gòu)化產(chǎn)生的兩個同分異構(gòu)體與HAS1靶蛋白的相互作用進(jìn)行評價，進(jìn)而預(yù)測它們的毒性效應(yīng),。

為雜質(zhì)譜 控制中評估藥物雜質(zhì)的毒性作用,，進(jìn)而制定合理的雜 質(zhì)限度提供了解決方案。

從藥品注冊的角度,，關(guān)注雜質(zhì)對藥物安全性的影響依然是當(dāng)前的重點(diǎn),。

鑒于對 MIs的關(guān)注，有必要對老品種原料藥按照新的法規(guī)要求重新開展穩(wěn)定性研究,，對其中的降解雜質(zhì)特別是揮發(fā)性降解雜質(zhì)開展毒性評估,，這對當(dāng)前正在進(jìn)行的藥品一致性評價工作具有一定的指導(dǎo)作用。

然而,，由于每一種 API 的合成平均需要6步反應(yīng),，每一條合成路線平均需要用到4種反應(yīng) 中間體；

在合成的最后步驟,，烷基鹵化物,、酰氯 (acid chlorides)、芳香胺和邁克爾受體 (Michael acceptors) 是常用的4種反應(yīng)中間體,，對API中可能存在的MIs進(jìn)行評估與合理的控制,，而非一味地要求其不存在應(yīng)是最適宜的質(zhì)控策略。

在對藥物降解產(chǎn)物進(jìn)行基因毒性風(fēng)險評估時,，也不應(yīng)僅根據(jù)計算機(jī)和/或基于理論預(yù)測的結(jié)果對許多尚未得到實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的假設(shè)降解產(chǎn)物進(jìn)行調(diào)查,，而應(yīng)當(dāng)重點(diǎn)關(guān)注那些在強(qiáng)制降解試驗(yàn)、加速或長期穩(wěn)定性研究中觀察到的降解途徑和主要降解產(chǎn)物,；

然而,，目前對如何判斷、預(yù)測和處理合成工藝中形成的MIs,，雖然已經(jīng)有許多個案報道,，如對替尼類藥物中的N-氧化物、硝基苯類物質(zhì)催化氧化還原反應(yīng)及副反應(yīng)的控制,、對過渡金屬雜質(zhì)的處理等,，依然沒有形成較統(tǒng)一的策略和方法，這已成為限制國內(nèi)對MIs控制的瓶頸,。

鑒于藥物雜質(zhì)的毒性反應(yīng)被認(rèn)為與干擾機(jī)體的正常反應(yīng)通路 (pathway) 有明確的因果關(guān)系,，使得利用體外模型在分子水平上探討化合物的毒性反應(yīng)機(jī)制，進(jìn)而外推其可能在機(jī)體中的不良反應(yīng)成為可能,，并有望成為監(jiān)管機(jī)構(gòu)進(jìn)行風(fēng)險評估的新的實(shí)用工具,。

這也將有望解決如何將藥物/雜質(zhì)毒理學(xué)信息與藥物臨床不良反應(yīng)相關(guān)聯(lián)，如何將不良反應(yīng)信息與產(chǎn)品質(zhì)量相關(guān)聯(lián)等一直困惑雜質(zhì)譜控制的難題,。