微生物群是免疫防御的原動(dòng)力,，但是防止感染的特定共生微生物的特性尚不清楚。相對(duì)的,，病原體如何與其他微生物群落競(jìng)爭(zhēng)以建立其宿主生態(tài)位也鮮為人知,。

鑒定對(duì)病原體有保護(hù)作用的微生物群成員可以提供一種治療對(duì)當(dāng)前抗菌治療有耐藥性的感染的替代方法。

在這些抗藥性微生物中,，腸桿菌科是最大的臨床問(wèn)題,。而腸桿菌科中的肺炎克雷伯菌對(duì)人類(lèi)健康構(gòu)成最緊迫的威脅,，因?yàn)樵S多菌株對(duì)多種抗生素耐藥，毒性很強(qiáng),，在成人和嬰兒中都會(huì)引起疾病,，并且很容易在宿主之間傳播。

因此,，預(yù)防肺炎克雷伯菌的定殖和傳播顯得至關(guān)重要,。

該研究發(fā)現(xiàn)，成熟的微生物群推動(dòng)了不同免疫防御程序的發(fā)展,，從而在上呼吸道和腸道限制肺炎克雷伯氏菌在這些生態(tài)位內(nèi)的定植,。

腸道免疫保護(hù)取決于擬桿菌、白細(xì)胞介素IL-36信號(hào)和巨噬細(xì)胞的發(fā)育,。擬桿菌的這種作用需要其保守的共生定植因子的多糖利用位點(diǎn),。相反，在上呼吸道,，變形菌門(mén)通過(guò)IL-17A增強(qiáng)免疫力,，但是肺炎克雷伯氏菌通過(guò)包囊IL-17A來(lái)克服這些防御進(jìn)而有效定植。

最終發(fā)現(xiàn)肺炎克雷伯氏菌的宿主間傳播主要發(fā)生在其腸道貯存器中,，而產(chǎn)生共生定植因子的擬桿菌足以通過(guò)IL-36阻止宿主之間的傳播,。

首先我們先來(lái)看看，肺炎克雷伯菌這種菌在人群中的分布情況究竟是怎樣的,？

我們從谷禾健康2019年近期檢測(cè)人群腸道菌群樣本抽取1.3萬(wàn)例樣本,，人群共計(jì)13358人，涵蓋0~103歲人群,。

其中肺炎克雷伯氏菌豐度占比超過(guò)1%的人群有3765例,，占比28.2%。

由于肺炎克雷伯菌在嬰兒和成人中引起疾病,，研究人員希望研究在整個(gè)生命過(guò)程中微生物群介導(dǎo)的對(duì)肺炎克雷伯菌定植的防御能力的發(fā)展,。為此,，耗盡了新生和成年小鼠中的微生物群。

為了研究肺炎克雷伯菌在上呼吸道的定殖作用,，研究人員使用了一個(gè)小的接種量,，并且沒(méi)有麻醉小鼠進(jìn)行鼻內(nèi)接種。這種方法意味著細(xì)菌保留在鼻腔和鼻咽,，并不會(huì)到達(dá)肺,。

在新生小鼠中，肺炎克雷伯菌可能在上呼吸道和腸道都定居,，這不受微生物群耗竭的影響（圖1a–c）,。同樣，在成年上呼吸道中,，對(duì)照動(dòng)物和消耗微生物的動(dòng)物中肺炎克雷伯菌的定殖水平相似（圖1d–f）,。相比之下，在成年腸道中,，肺炎克雷伯菌只有在微生物群枯竭后才能建立可檢測(cè)的定植（圖1g–j）,。

持續(xù)的廣譜抗生素治療（圖1g-j）或臨床上相關(guān)的短期抗生素治療方案，消除了微生物群介導(dǎo)的防御,。將成年菌群而非新生兒菌群轉(zhuǎn)移至新生小鼠,，以保護(hù)其免受肺炎克雷伯菌的腸道定殖（圖1k–m）。

成人腸道菌群具有廣泛的保護(hù)性,，可通過(guò)臨床分離株產(chǎn)生肺炎克雷伯菌,，產(chǎn)生OXA-48碳青霉烯酶（圖1g），流行性肺炎克雷伯菌 ST258（圖1l）和近緣擬肺炎克雷伯菌亞種（圖1j）,。

在任一生態(tài)位定居期間均未觀察到體重減輕,，支持我們正在對(duì)無(wú)癥狀定殖進(jìn)行建模的概念。這些數(shù)據(jù)表明,，成年菌群的發(fā)育產(chǎn)生了足以阻斷肺炎克雷伯菌在腸道內(nèi)而不是上呼吸道定居的屏障,。

下文將圍繞這3個(gè)問(wèn)題展開(kāi)實(shí)驗(yàn)與探討,。

為了回答第一個(gè)問(wèn)題,，成人腸道菌群中的哪些菌阻止肺炎克雷伯菌的定殖,，其機(jī)制是什么？

研究人員對(duì)新生小鼠和成年小鼠腸道菌群進(jìn)行了測(cè)序,，以確定這些允許和抑制微生物群落的各自組成,。新生小鼠腸道菌群主要是來(lái)自厚壁菌門(mén)，尤其是乳桿菌科的成員（圖2a,，b）,。相比之下，成年小鼠腸道菌群主要由擬桿菌門(mén)（擬桿菌門(mén)）和厚壁菌（梭狀芽胞桿菌和乳桿菌）的共生菌組成,，而放線菌門(mén)和變形菌門(mén)只占共生菌的一小部分（圖2a,，b）。

研究人員發(fā)現(xiàn)只有擬桿菌能促進(jìn)肺炎克雷伯菌從腸道的清除,，無(wú)論是在肺炎克雷伯菌定植之前還是之后(Fig. 2c–k),。擬桿菌在抗生素治療（圖2d-f，i,，j）和無(wú)菌小鼠（圖2g）中都具有保護(hù)作用,，這與使用不同成分的共生體一致。

證實(shí)施用代表性的共生菌群的小鼠的腸道菌群由該菌群占主導(dǎo)地位,，并且每個(gè)菌群的定植水平相似,。

圖 非抗生素處理、抗生素處理和共生聯(lián)合體接種小鼠糞便中的細(xì)菌負(fù)荷和組成

此外,，還發(fā)現(xiàn)擬桿菌屬特別保護(hù)新生小鼠免受肺炎克雷伯菌的腸道定植（圖2k）,，這支持了這種共生體的發(fā)展可以保護(hù)成年小鼠免受肺炎克雷伯菌的侵害。

圖2：腸內(nèi)的擬桿菌屬可以預(yù)防肺炎克雷伯菌的定殖,。

所有的統(tǒng)計(jì)比較都是用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)和Dunn對(duì)多重比較的修正進(jìn)行的,。水平線表示中值。

接下來(lái)，研究人員想確定擬桿菌的保護(hù)作用是否需要宿主免疫,。因此,，在肺炎克雷伯氏菌定植之前，將微生物群轉(zhuǎn)移到施用了免疫抑制性地塞米松或媒介物對(duì)照的微生物群缺失小鼠中。地塞米松消除了微生物群對(duì)肺炎克雷伯菌定殖的抑制作用（參見(jiàn)圖3a,，b）,，表明該保護(hù)作用需要免疫信號(hào)。

此外,，研究人員發(fā)現(xiàn)地塞米松對(duì)未經(jīng)抗生素治療的小鼠的治療,，使這些正常耐藥的小鼠容易被肺炎克雷伯氏菌定殖。同樣,，擬桿菌屬賦予的保護(hù)作用需要免疫信號(hào)傳導(dǎo),。

為了確保地塞米松對(duì)免疫系統(tǒng)起作用而不是破壞微生物群，研究人員將微生物群從地塞米松或媒介物對(duì)照治療的小鼠轉(zhuǎn)移至微生物群枯竭的小鼠,，然后研究了對(duì)肺炎克雷伯菌定植的抑制作用,。這兩個(gè)微生物群均提供了針對(duì)肺炎克雷伯菌定殖的同等保護(hù)作用。由此證明地塞米松不能消除微生物菌群的保護(hù)性優(yōu)勢(shì),，而是抑制微生物菌群對(duì)免疫系統(tǒng)的刺激作用,。

然后，研究人員試圖確定將擬桿菌屬的作用轉(zhuǎn)化為對(duì)肺炎克雷伯菌定植的抗性的免疫因子,。在腸道中,，從新生小鼠到成年的轉(zhuǎn)變以許多細(xì)胞因子的穩(wěn)態(tài)表達(dá)增加為標(biāo)志，這些因子對(duì)維持宿主與微生物的動(dòng)態(tài)平衡很重要,。

為了確定擬桿菌的保護(hù)作用是否受這些細(xì)胞因子的驅(qū)動(dòng),，他們?nèi)∠思?xì)胞因子的信號(hào)傳導(dǎo)，該信號(hào)的穩(wěn)定表達(dá)從新生小鼠到成年小鼠均以微生物群依賴性方式增加,。

圖3 擬桿菌通過(guò)IL-36信號(hào)和巨噬細(xì)胞保護(hù)肺炎克雷伯菌在腸道的定植,。

水平線表示中值，誤差線為s.d.

用針對(duì)IL-36受體（IL-36R）信號(hào)的抗體治療,，但不針對(duì)IL-17A或干擾素（IFN）-γ的抗體治療后,，擬桿菌屬對(duì)肺炎克雷伯菌的腸道菌落保護(hù)被取消（圖3a-e）。支持IL-36的作用,，重組IL-36γ處理可促進(jìn)腸道肺炎克雷伯菌的清除（圖3f–h），而微生物群落衰竭的動(dòng)物中腸道IL-36γ的產(chǎn)生可通過(guò)擬桿菌特異恢復(fù)（圖3i）

利用脂質(zhì)體氯膦酸鹽處理耗盡這些細(xì)胞來(lái)研究它們對(duì)肺炎克雷伯菌的保護(hù)作用,。巨噬細(xì)胞耗竭后,，擬桿菌不能預(yù)防肺炎克雷伯菌或調(diào)節(jié)IL-36γ（圖3j–m）。相反,，嗜中性粒細(xì)胞耗盡后,，擬桿菌仍具有保護(hù)作用。

圖 變形菌在定植過(guò)程中恢復(fù)了上氣道的穩(wěn)態(tài)IL-17A生成和肺炎克雷伯菌誘導(dǎo)的上氣道TNF生成

此外,，在用氯膦酸鹽處理的小鼠中,，IL-36R信號(hào)的破壞不會(huì)增加肺炎克雷伯菌的定殖，這表明IL-36和巨噬細(xì)胞沿一條共同途徑起作用（圖3n）,。

為了了解IL-36如何通過(guò)巨噬細(xì)胞控制腸道中的肺炎克雷伯菌水平,，研究人員調(diào)查了IL-36是否促進(jìn)了這些細(xì)胞的殺菌活性,。然后發(fā)現(xiàn)IL-36γ刺激促進(jìn)巨噬細(xì)胞殺死肺炎克雷伯菌的多種菌株。

接下來(lái),，研究人員想了解抗肺炎克雷伯菌定殖所需的擬桿菌屬中的因素,。調(diào)節(jié)腸道免疫力的常見(jiàn)方法是與宿主粘膜緊密接觸以發(fā)揮其作用。擬桿菌內(nèi)高度保守的是莢膜多糖產(chǎn)生位點(diǎn)CCFs,，這促進(jìn)了擬桿菌與腸黏膜的關(guān)聯(lián),。

圖4 擬桿菌需要它們的ccf來(lái)防止肺炎克雷伯菌在腸內(nèi)的定植。

研究人員測(cè)試了假單胞菌抑制肺炎克雷伯菌定植所需的CCF的假設(shè),。與此一致,，具有完整的CCF系統(tǒng)的擬桿菌屬或單個(gè)擬桿菌屬物種可以預(yù)防肺炎克雷伯菌的細(xì)菌定植和主要腸道IL-36γ的產(chǎn)生，但是在沒(méi)有CCF的情況下會(huì)消失,，并且可以通過(guò)CCF的互補(bǔ)來(lái)重新建立（圖4a–g）,。

與設(shè)想的在粘膜定植中的作用相一致，發(fā)現(xiàn)CCF促進(jìn)了擬桿菌與粘膜的締合（圖4h）,，但是在存在或不存在CCF的情況下,，糞便中的擬桿菌水平是相等的（圖4i）。

以上,，數(shù)據(jù)支持這樣一個(gè)模型,，其中產(chǎn)生細(xì)菌CCF的擬桿菌屬成員與粘膜屏障結(jié)合，在腸內(nèi)形成免疫屏障,，從而防止肺炎克雷伯菌通過(guò)IL-36和巨噬細(xì)胞定居,。

接著回答第二個(gè)問(wèn)題：哪些因素可使肺炎克雷伯菌成功與上呼吸道菌群競(jìng)爭(zhēng),，從而定居于這一生態(tài)位？

為此,，研究人員檢查了肺炎克雷伯菌包封的作用,。傳統(tǒng)上，包囊被視為一種毒性決定因素,。然而,，莢膜多糖的產(chǎn)生是常見(jiàn)的病原體和非病原體。特別是在上呼吸道中,。

在具有微生物群的成年小鼠中,，我們發(fā)現(xiàn)包封的肺炎克雷伯菌定植上呼吸道水平高于等基因的未包封的肺炎克雷伯氏菌突變體，并且,，通過(guò)未封裝的突變體的互補(bǔ),，恢復(fù)了抵抗微生物群介導(dǎo)的防御的能力（圖5a，b）。

包囊化的這種優(yōu)勢(shì)在微生物群落缺乏的動(dòng)物中消失了,，在這些動(dòng)物中,，包囊化和未包囊化的肺炎克雷伯菌定殖到相似的水平（圖5a，b）,。

圖5 變形菌通過(guò)IL-17A啟動(dòng)上呼吸道防御,，但包封可以使肺炎克雷伯菌克服這些防御。

下一步,，研究人員確定包封是否允許肺炎克雷伯菌抵抗上呼吸道內(nèi)的直接微生物競(jìng)爭(zhēng),，或通過(guò)免疫系統(tǒng)間接影響微生物群。為了解決這一問(wèn)題,，他們將微生物群轉(zhuǎn)移回經(jīng)地塞米松或載體控制治療的微生物群衰竭的動(dòng)物,，然后再經(jīng)鼻腔給藥肺炎克雷伯菌。

微生物群轉(zhuǎn)移減少未包封肺炎克雷伯菌在載體對(duì)照中的上呼吸道定植,，但地塞米松治療的動(dòng)物卻沒(méi)有,，這支持了微生物群通過(guò)免疫信號(hào)增強(qiáng)上呼吸道防御的觀點(diǎn)。與此相符的是,，在微生物群落衰竭的動(dòng)物中,，肺炎克雷伯氏菌在上呼吸道定植期間誘導(dǎo)的先天細(xì)胞因子產(chǎn)生（腫瘤壞死因子-α）減少，并通過(guò)免疫信號(hào)通過(guò)微生物群轉(zhuǎn)移而恢復(fù),。

圖 微生物群?jiǎn)?dòng)上呼吸道免疫,，但封裝使肺炎克雷伯菌克服這些防御

研究人員確認(rèn)，微生物群轉(zhuǎn)移后上呼吸道共生細(xì)菌的水平在媒介物和地塞米松治療的小鼠之間是相同的,，且微生物群的轉(zhuǎn)移沒(méi)有導(dǎo)致共生接種到肺中,。

與腸道類(lèi)似，上呼吸道的微生物防御啟動(dòng)是成年動(dòng)物所特有的,，因?yàn)榉庋b和未封裝的肺炎克雷伯菌都將新生的上呼吸道定居到相似的水平,，并在缺乏微生物群和對(duì)照的動(dòng)物中引起了同等的先天細(xì)胞因子反應(yīng)。

從新生到成年的轉(zhuǎn)變伴隨著依賴于微生物群的上呼吸道多種細(xì)胞因子穩(wěn)態(tài)表達(dá)的增加,，因此,，研究人員取消了這些細(xì)胞因子的信號(hào)傳導(dǎo)，以了解成年微生物群是否需要它們才能在上呼吸道發(fā)揮其免疫調(diào)節(jié)作用,。

IL-17A的破壞,，而不是IFN-γ或IL-36R信號(hào)的破壞，抑制了微生物群介導(dǎo)的未包囊但未包囊的肺炎克雷伯菌從上呼吸道的清除（圖5c–f）,。

此外，用重組IL-17A處理足以促進(jìn)未包封的肺炎克雷伯菌的清除（圖5g,，h）,。小鼠上呼吸道菌群包括的菌來(lái)自放線菌門(mén)，擬桿菌，厚壁菌門(mén)和變形菌,。

在這些共生體中,，發(fā)現(xiàn)變形菌通過(guò)IL-17A信號(hào)（圖5i-l）特異性地增強(qiáng)了抗生素治療和無(wú)菌小鼠上呼吸道對(duì)未包被肺炎克雷伯菌的清除。變形菌還恢復(fù)了上呼吸道的穩(wěn)態(tài)IL-17A生成和肺炎克雷伯菌定植誘導(dǎo)的細(xì)胞因子生成,。

研究人員證實(shí),，給代表性共生體注射的小鼠上呼吸道微生物群主要由該共生體控制，并且每個(gè)共生體的定殖情況相似,。

這些數(shù)據(jù)支持一種模型,，通過(guò)該模型，變形菌可以在成年上呼吸道引發(fā)IL-17A依賴性免疫防御程序,。但是,，包囊可以使肺炎克雷伯菌經(jīng)受住這些防御，從而成功地建立定植,。

然后回答第三個(gè)問(wèn)題：在不同的粘膜貯庫(kù)中,，微生物群和肺炎克雷伯菌之間的競(jìng)爭(zhēng)如何影響這種傳染性病原體在宿主之間的傳播,？

為了了解防止肺炎克雷伯菌在腸道定植的成人微生物群的發(fā)育如何影響傳播，研究人員采取以下措施：

首先,，將已建立腸道肺炎克雷伯菌定殖的成年小鼠與抗生素治療或非抗生素治療的小鼠接觸,，共同飼養(yǎng)?？股刂委煹某赡杲佑|小鼠都獲得了肺炎克雷伯菌,，但對(duì)未經(jīng)抗生素治療的成年接觸小鼠的傳播有限。

研究人員再次確認(rèn)從成年接觸小鼠分離出的肺炎克雷伯菌的抗生素耐藥譜與接種到索引小鼠中的肺炎克雷伯菌的抗生素耐藥譜相匹配,，確認(rèn)從接觸小鼠分離出的肺炎克雷伯菌來(lái)自索引動(dòng)物,。

圖 接觸小鼠肺炎克雷伯菌的耐藥譜與對(duì)照小鼠肺炎克雷伯菌的耐藥譜一致

其次，在共寄居之前,，將保護(hù)性擬桿菌屬共接種到肺炎克雷伯菌定殖的新生指數(shù)小鼠和幼稚的新生接觸小鼠中,。這足以阻止宿主之間的肺炎克雷伯菌傳播。為了檢查傳播是否需要與動(dòng)物直接接觸,，將成年接觸者關(guān)在先前裝有腸道定殖的索引小鼠的籠子中,。盡管在飼養(yǎng)前已從籠子中取出所有的索引小鼠和糞便材料，但所有接觸的小鼠都被肺炎克雷伯菌定殖,，這表明傳播不需要?jiǎng)游镏g或同食性的直接接觸,。

第三，在共寄居之前,，將保護(hù)性的擬桿菌共生體口服到肺炎克雷伯菌定植的成年指數(shù)小鼠和未經(jīng)抗生素處理的成年接觸小鼠體內(nèi),。發(fā)現(xiàn)擬桿菌特異性足以阻斷肺炎克雷伯菌在宿主間的傳播,。在IL-36信號(hào)的破壞或沒(méi)有CCF的情況下，擬桿菌的抑制作用喪失了,。

綜上所述,，這些數(shù)據(jù)表明擬桿菌對(duì)肺炎克雷伯菌定植的保護(hù)作用限制了其在人群中的傳播。研究人員質(zhì)疑擬桿菌對(duì)肺炎克雷伯菌傳播的抑制作用是否是由于擬桿菌減少了從指數(shù)動(dòng)物身上脫落的肺炎克雷伯菌,，或是在接觸動(dòng)物身上建立了針對(duì)肺炎克雷伯菌的保護(hù)屏障,。

為了回答這個(gè)問(wèn)題，擬桿菌只給肺炎克雷伯菌定植的索引小鼠或單純接觸者,。發(fā)現(xiàn),，這兩種方法都減少了肺炎克雷伯菌的傳播，但將擬桿菌引入接觸者比將擬桿菌引入索引小鼠的效果更為有效,，證明擬桿菌控制傳播的關(guān)鍵點(diǎn)是加強(qiáng)免疫屏障以防止肺炎克雷伯菌在新宿主中的建立,。總之,，數(shù)據(jù)顯示,，產(chǎn)生CCF的擬桿菌抑制了肺炎克雷伯菌在人群中的傳播。

在本文開(kāi)頭部分,，我們已經(jīng)看到從谷禾健康2019年樣本中抽取樣本的實(shí)際分布情況：

其中肺炎克雷伯氏菌豐度占比超過(guò)1%的人群有3765例,，占比28.2%。

為了解感染攜帶肺炎克雷伯氏菌的人群和不攜帶人群的菌群構(gòu)成,，尤其是論文中擬桿菌對(duì)于肺炎克雷伯氏菌感染的防控作用在真實(shí)人類(lèi)群體中的情況,，我們將根據(jù)肺炎克雷伯氏菌的占比豐度分為兩類(lèi)人群。

其中肺炎克雷伯氏菌占比豐度5~50%的人群作為腸道感染攜帶者（1629例）,，占比<1%的人群（9593例）作為對(duì)照,。

提取擬桿菌門(mén)和厚壁菌門(mén)的比例進(jìn)行比較，結(jié)果如下：

肺炎克雷伯氏菌腸道感染人群菌群構(gòu)成

可以看到兩組人群的擬桿菌門(mén)的豐度水平確實(shí)存在差異,，未感染人群的擬桿菌門(mén)比例相對(duì)更高,，統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)是極顯著。

論文的研究發(fā)現(xiàn)在人類(lèi)群體中應(yīng)該存在一定的作用,，但是感染人群其擬桿菌并不是極低,。

進(jìn)一步使用MaAslin2進(jìn)行檢驗(yàn)肺炎克雷伯氏菌與其他菌屬，結(jié)果如下：

發(fā)現(xiàn)和預(yù)期的不太一樣,，擬桿菌與肺炎克雷伯菌的豐度水平之間顯示是正相關(guān),，唾液乳桿菌和棲糞桿菌與其是顯著負(fù)相關(guān),，另外其他病原菌與其負(fù)相關(guān)。

總之,，論文的研究發(fā)現(xiàn)在人類(lèi)群體中應(yīng)該存在一定的作用，但是大樣本人群腸道菌群檢測(cè)結(jié)果分析表明單純的擬桿菌存在并不能完全抵御肺炎克雷伯氏菌的定植和傳播,。

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參 考 文 獻(xiàn)

Sequeira, R.P., McDonald, J.A.K., Marchesi, J.R. et al. Commensal Bacteroidetes protect against Klebsiella pneumoniae colonization and transmission through IL-36 signalling. Nat Microbiol (2020)