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基金項目：北京市朝陽區(qū)科技計劃（CYSF172502） 膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎(knee osteoarthritis, KOA) 是以關(guān)節(jié)的疼痛、僵硬腫脹,，甚至功能喪失為臨床表現(xiàn)的一種慢性退行性疾病,，其危險因素包括老年、肥胖,、創(chuàng)傷,、過度使用及遺傳易感性等。我國目前骨關(guān)節(jié)炎總患病率已達到27.18%,，其中KOA的患病率約為18%,，并且女性KOA患病率顯著高于男性。該疾病為患者帶來了極大的痛苦和不便,，嚴重降低其生活質(zhì)量,，因此，防治KOA是社會必要的需求,，具有重要的社會價值,。大多數(shù)研究認為醫(yī)用臭氧關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射治療KOA療效顯著，且治療時間為4周,，但未有研究表明是否治療時間越長,，其治療效果越好。目前,，國內(nèi)外文獻中未見通過對臭氧治療不同時間進行分組治療KOA的研究,。本實驗通過擬用不同治療療程的醫(yī)用臭氧關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射對KOA家兔進行干預,，觀察不同治療時間醫(yī)用臭氧關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射治療KOA，對關(guān)節(jié)液中SOD及關(guān)節(jié)軟骨的影響,，探討臭氧治療時間與KOA療效的關(guān)系,。 方法 1. 實驗動物及分組 30只健康新西蘭實驗家兔（普通級），體重2.0~2.5 kg,。進入實驗室后適應性喂養(yǎng)3天,，單籠單兔喂養(yǎng)，保持室溫23~25℃,，相對濕度40%~60%,，通風。利用抽簽法將家兔隨機分為正常組對照組(N),、模型組對照組(M),、2周臭氧治療組(O3-2),、4周臭氧治療組(O3-4),、6周臭氧治療組(O3-6)，每組6只,。 2. 實驗儀器 臭氧治療儀,；兔子雙足平衡支撐力測量儀；超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase, SOD）試劑盒,。 3. 實驗方法 N組正常飼養(yǎng),，不做模型手術(shù)；M組,、O3-2組,、O3-4組及O3-6組采用經(jīng)典Hulth改良法制作KOA模型：麻醉后，于兔左側(cè)膝關(guān)節(jié)中內(nèi)側(cè)做長約1cm的縱行皮膚切口,，摘除內(nèi)側(cè)半月板,、切斷內(nèi)側(cè)副韌帶及前交叉韌帶。術(shù)中避免損傷關(guān)節(jié)軟骨面,，術(shù)后連續(xù)三天抗生素抗感染治療,，術(shù)后一周開始驅(qū)趕動物活動30min，連續(xù)12周,。3個月后O3-2組,、O3-4組及O3-6組兔左膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射20μg/ml臭氧，每次2mL,，每周1次,，分別注射2周、4周及6周,。 4. 取材 N組與M組3個月后麻醉藥物過量處死家兔,，O3-2組,、O3-4組及O3-6組分別于末次治療后3天處死。處死后,，抽取1mL生理鹽水注入家兔左膝關(guān)節(jié)腔,，充分活動膝關(guān)節(jié)后抽取關(guān)節(jié)灌洗液，測定SOD OD值,。再解剖左膝關(guān)節(jié),，首先觀察軟骨形態(tài)學變化，然后切開取股骨內(nèi)側(cè)髁軟骨及軟骨下骨,，標本進行固定,、脫鈣、石蠟包埋及切片后,，行HE及甲苯胺藍(Toluidine blue, TB)染色,，并且行Mankin's評分。 5. 檢測和評價兔膝關(guān)節(jié)功能變化 每次取材前觀察并記錄局部疼痛刺激反應,、步態(tài)改變,、關(guān)節(jié)活動度、關(guān)節(jié)腫脹程度,。用“測定雙足平衡設(shè)備”檢測臭氧治療前（即第一次注射臭氧前）與治療后（即處死前）兔雙側(cè)后足分別承重情況,。 6. 病理觀察及Mankin's評分 每份關(guān)節(jié)灌洗液稀釋后，分別采用黃嘌呤氧化酶法測定 SOD OD 值,，根據(jù)試劑盒提供的說明書進行操作,。 肉眼觀察關(guān)節(jié)軟骨表面是否光滑，有無糜爛,、潰瘍及骨贅形成,；HE染色觀察軟骨表面是否光滑，軟骨細胞排列是否規(guī)則,、軟骨細胞數(shù)量變化,、軟骨表層纖維成分變化、潮線是否完整等,；TB 染色觀察ECM的著色深淺,。使用Mankin's評分評估軟骨損傷情況，分數(shù)越高說明軟骨損傷越重,。 7. Elisa 法檢測關(guān)節(jié)液 SOD 的表達 每份關(guān)節(jié)灌洗液稀釋后,，分別采用黃嘌呤氧化酶法測定 SOD OD 值，根據(jù)試劑盒提供的說明書進行操作,。 8. 統(tǒng)計學分析 應用SPSS 22.0軟件對數(shù)據(jù)進行處理并做統(tǒng)計分析,，統(tǒng)計描述以均數(shù)±標準差(±SD) 表示，SOD OD值測量及Mankin's評分采用單因素方差分析 (ANOVA) 檢驗，雙足平衡支撐力測量組間比較采用ANOVA檢驗,，組內(nèi)采用配對樣本t檢驗,。P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。 結(jié) 果 1. 外部觀察評價兔膝關(guān)節(jié)功能 N組正?；顒?，無明顯跛行及關(guān)節(jié)腫脹；M組與O3-2組均出現(xiàn)明顯跛行,、關(guān)節(jié)活動度明顯受限,、關(guān)節(jié)腫脹及局部疼痛刺激較為強烈；O3-4組與O3-6組患肢局部對疼痛刺激反應弱,，輕微腫脹,，活動時輕度跛行。 2. 雙足平衡支撐力評價兔膝關(guān)節(jié)功能 治療前O3-6,、O3-4,、O3-2、M與N組相比,，差異有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.01),；O3-6組治療前后相比差異具有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.01)，O3-4 組治療前后比較,，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),，O3-2組治療前后比較,，差異無統(tǒng)計學意義 (P>0.05),；治療后O3-6、O3-4與O3-2組比較,，差異有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.01),，但治療后O3-6與O3-4組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),。醫(yī)用臭氧治療KOA至少4周以上,，但不能表明治療時間越長，效果越好（見表1）,。 3. 病理觀察及 Mankin's 評分 肉眼觀：N組,，關(guān)節(jié)軟骨表面光滑，無裂紋,、糜爛及潰瘍形成,，軟骨邊緣無骨贅形成；M組,，關(guān)節(jié)軟骨表面粗糙,，可見糜爛及潰瘍形成，內(nèi)側(cè)髁邊緣可見骨贅形成,；O3-2組,，關(guān)節(jié)軟骨表面可見糜爛及潰瘍形成,，軟骨邊緣可見骨贅形成；O3-4組與O3-6組大體觀察：軟骨表面尚光滑,，少見糜爛,、潰瘍，骨贅形成,。 光鏡下HE染色：N組（見圖1A）,，軟骨表面光滑，細胞排列整齊,，軟骨四層結(jié)構(gòu)清晰,，無裂隙；M組（見圖1B）軟骨表面粗糙不規(guī)則,，四層結(jié)構(gòu)紊亂,，軟骨層變薄，軟骨細胞顯著減少,、排列不規(guī)則,，可見大量纖維軟骨細胞及成簇樣細胞形成，細胞外基質(zhì)分解,，潮線不完整,，大量血管翳形成；O3-2組（見圖1C）,，軟骨表面粗糙不規(guī)則,，軟骨四層結(jié)構(gòu)嚴重紊亂，大量纖維軟骨細胞形成,，細胞外基質(zhì)分解,，未見明顯潮線，可見血管翳形成,；O3-4組（見圖1D）,，軟骨表面較規(guī)則，四層結(jié)構(gòu)尚清晰,，軟骨細胞數(shù)量減少,，細胞排列較整齊，可見細胞輕度增生,，軟骨纖維成分均較模型組及O3-2組少,，少量軟骨細胞增生，潮線基本完整,；O3-6組（見圖1E）,，軟骨表面較光滑，四層結(jié)構(gòu)較清楚，軟骨細胞數(shù)量輕微減少,，少量軟骨纖維細胞形成,，潮線較完整。 （點開圖片可觀看大圖） 光鏡下TB染色：N組（見圖2A）,，ECM著色正常,，且均勻著色；M組（見圖2B）,，ECM著色中至重度降低,，著色不均勻或部分不著色；O3-2組（見圖2C）,，ECM著色明顯降低,，且著色不均勻，部分不著色,；O3-4組（見圖2D）,，ECM著色輕度降低，著色較不均,；O3-6組（見圖2E）,， ECM 著色較正常，著色較均勻,。 （點開圖片可觀看大圖） 根據(jù)關(guān)節(jié)軟骨病理切片HE及TB染色行Mankin's評分,，M組與O3-2組軟骨細胞明顯分裂增生，細胞排列紊亂,，潮線模糊,，甚至可見血管通過，Mankin's評分差異無統(tǒng)計學意義,；O3-4與O3-6組軟骨細胞排列稍紊亂,，輕度分裂增生，潮線不完整,，無明顯血管通過及血管翳形成，Mankin's評分差異無統(tǒng)計學意義,，且較接近正常（N組）,；O3-6和O3-4組與 O3-2組相比差異具有顯著統(tǒng)計學意義（P< 0.01，見表2）,。 4. 醫(yī)用臭氧治療后關(guān)節(jié)灌洗液 SOD OD 值 O3-6與N組比較,，差異有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.01)；O3-4與N組相比,，差異有統(tǒng)計學意義 (P< 0.05),；O3-2與N組比較，差異有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.01)，但O3-2較N組明顯降低,；M與N組比較,，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。O3-6與M組比較,，差異有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.01),；O3-4與M組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),；O3-2與M組比較,，差異有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.01)，但O3-2較N組明顯降低,。O3-6和O3-4與O3-2組比較,，差異有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.01)，O3-6與O3-4組比較,，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),。醫(yī)用臭氧治療KOA至少4周以上且治療時間越長，該結(jié)果表明治療時間越長,，SOD生成越多（見表3）,。 討 論 KOA是最常見的慢性退行性疾病，已嚴重威脅老年人的健康,，其致殘率高,，導致患者日常活動明顯受限,。傳統(tǒng)的治療方法如康復鍛煉,、止痛、消炎,、理療,、針灸等，都只能暫時緩解疼痛癥狀,，不能控制疾病的進展,；Skou和柯雪茹等研究表明，人工全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)后大約20%~30%的患者在疼痛,、殘疾及生活質(zhì)量方面幾乎或根本沒有改善,，相當一部分患者甚至會患上慢性疼痛。而注射治療因其全身副作用小較多應用于臨床,。常見的注射治療法包括玻璃酸鈉和醫(yī)用臭氧注射治療,，玻璃酸鈉注射治療效果顯著，但其價格昂貴,，治療周期較長,。近幾年來醫(yī)用臭氧作為一種非藥理性的治療方法已廣泛應用于KOA的臨床治療,，且療效確切。 KOA 患者的正常力學軸位發(fā)生改變,，使關(guān)節(jié)的最大壓力承受部位由外側(cè)脛骨平臺轉(zhuǎn)移至內(nèi)側(cè)脛骨平臺,，導致內(nèi)側(cè)關(guān)節(jié)軟骨所承受壓力劇增，再加上去除內(nèi)側(cè)半月板,，使關(guān)節(jié)軟骨面之間失去緩沖,，直接接觸相互摩擦，從而使軟骨發(fā)生變形損傷,。本實驗應用經(jīng)典Hulth改良法,，通過改變膝關(guān)節(jié)的正常力學軸位而制模，該法制模穩(wěn)定性好,。本實驗結(jié)果顯示臭氧關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射治療KOA可緩解疼痛,、改善膝關(guān)節(jié)功能。醫(yī)用臭氧關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射治療4周及6周后,，關(guān)節(jié)的雙足平衡支撐力,、關(guān)節(jié)軟骨病理變化及Mankin's評分均無顯著性差異，提示臭氧治療4周及6周療效相當,。但與臭氧治療2周及模型組相比,，差異具有統(tǒng)計學意義，且臭氧治療2周與模型組相比無顯著差異,，提示臭氧治療2周療效差,，至少治療4周以上才有顯著療效。 KOA的發(fā)病因素很多,，而細胞外基質(zhì)(Extracellular Matrix, ECM)的合成與分解代謝的失平衡是OA產(chǎn)生的主要原因之一,。膝關(guān)節(jié)是由軟骨、軟骨下骨,、韌帶,、滑膜、肌肉等許多不同的組織組成的生物力學器官,，這些組織的ECM提供了他它們的結(jié)構(gòu)和形式,，并定義了他們的生物力學特性。KOA患者關(guān)節(jié)軟骨及滑液中含有大量的細胞因子,，當中性粒細胞受到免疫復合物,、補體等攻擊時，釋放出活性氧(ROS),、NO及超氧化物陰離子(O2-)等氧自由基，這些氧自由基含有未配對的電子,，形成活潑的羥自由基,，打破機體氧化系統(tǒng)與抗氧化系統(tǒng)平衡,。羥自由基可激活金屬蛋白酶 (Metal Matrix Proteinase, MMP)，同時IL-1,、TNF-α等炎性細胞因子也可通過刺激軟骨細胞和滑膜成纖維細胞產(chǎn)生MMP,，MMP通過降解ECM的重要成分蛋白多糖、骨黏連蛋白,、膠原蛋白及軟骨基底膜聚糖,，加速軟骨細胞的衰老與凋亡，導致細胞不能有效地對正常的負荷機制作出反應,。但有研究表明,，KOA可通過刺激機體產(chǎn)生抗氧化酶，如SOD,、過氧化氫酶和谷胱甘肽等,，對抗大量氧自由基，以減輕氧自由基對軟骨的損傷,。醫(yī)用臭氧不僅可以對抗白細胞產(chǎn)生的細胞因子引發(fā)的炎癥反應,，也可通過誘導合成SOD、過氧化氫酶等抗氧化酶抑制氧化應激反應,，從而改善膝關(guān)節(jié)功能,，延緩病情的進展。這一機制符合關(guān)節(jié)自我修復過程,，并能促進修復,。 本研究結(jié)果表明，醫(yī)用臭氧關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射治療4周及6周后,，關(guān)節(jié)液SOD顯著較M組升高,，說明醫(yī)用臭氧可激活機體抗氧化系統(tǒng)，誘導SOD抗氧化酶的生成,，對抗KOA產(chǎn)生的過多的氧自由基,，減少細胞質(zhì)膠原蛋白裂解，抑制MMP的形成,，進而減少對膝關(guān)節(jié)軟骨的損傷,，同時也可以使間質(zhì)細胞和關(guān)節(jié)軟骨合成增多，刺激軟骨進而纖維原細胞增殖,，起到一定的修復作用,，與先前研究結(jié)果一致。且O3-6組較O3-4組升高(P<0.05),，說明臭氧治療時間越長,，療效越顯著。M組關(guān)節(jié)液SOD含量較正常組升高,，但醫(yī)用臭氧治療2周后關(guān)節(jié)液SOD含量較M組顯著降低,，導致出現(xiàn)該結(jié)果的原因可能是正常膝關(guān)節(jié)液含有少量SOD,，KOA的形成可短期內(nèi)誘導SOD抗氧化酶產(chǎn)生以對抗氧自由基，臭氧治療2周可能無法有效激活機體抗氧化系統(tǒng),，并且隨著病程延長SOD逐漸消耗,，同時氧自由基不斷增多，激活更多的MMP,，因此會出現(xiàn)臭氧治療2周時關(guān)節(jié)液SOD反而下降的現(xiàn)象,；另外，臭氧本身也屬于一種強氧化劑,，也可能因為短時間臭氧治療對軟骨的損傷作用大于治療作用,。 從目前研究得出，短療程醫(yī)用臭氧治療KOA未見明顯治療效果,，是否具有損傷作用需進一步研究,，下一步可通過在正常家兔膝關(guān)節(jié)注射臭氧，評估臭氧對關(guān)節(jié)軟骨是否有損傷作用,。臭氧治療KOA應不少于4周,，并且我們認為隨著治療時間越長效果可能會越好，但從O3-6組與O3-4組的Mankin's評分及雙足平衡支撐力占比的結(jié)果比較,，兩組間差異無統(tǒng)計學意義,，分析原因可能因為樣本量較小所致，下一步可通過增加樣本量或延長治療時間探討醫(yī)用臭氧治療時間對KOA的影響,。 綜上所述,，醫(yī)用臭氧關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射治療KOA不少于4周時，對修復關(guān)節(jié)損傷,、改善膝關(guān)節(jié)功能具有顯著療效,，在臨床上對醫(yī)用臭氧注射治療KOA的最佳療程具有指導意義。 參考文獻：薛艷,龐曉林,何軍,楊永濤,關(guān)圓,張東亞.不同療程醫(yī)用臭氧關(guān)節(jié)內(nèi)注射對兔膝骨關(guān)節(jié)炎療效比較[J].中國疼痛醫(yī)學雜志,2019,25(11):871-875. |
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