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Ct值是什么,？ Ct值具有什么樣的作用,？ Ct值的正常范圍是多少？ Ct值太大或者太小的原因,？ Ct值是熒光定量PCR最重要的結(jié)果呈現(xiàn)形式,。它被用于計(jì)算基因表達(dá)量差異或者基因拷貝數(shù)。那么熒光定量的Ct值多大可被認(rèn)為是合理,？如何保證Ct值的有效范圍呢,？今天就讓小編來(lái)為大家解答這個(gè)問(wèn)題。 Ct值是什么,？ qPCR擴(kuò)增過(guò)程中,，擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的熒光閾值時(shí)的所對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增循環(huán)數(shù)（Cycle Threshold）,。C代表Cycle，T代表Threshold,。簡(jiǎn)單講,，Ct值就是qPCR中起始模板擴(kuò)增達(dá)到一定產(chǎn)物量時(shí)，所對(duì)應(yīng)的循環(huán)數(shù),。所謂“一定產(chǎn)物量”后續(xù)作進(jìn)一步解釋,。 Ct值有什么作用？ 1.指數(shù)擴(kuò)增,、模板量與Ct值的關(guān)系 理想情況下,，qPCR中的基因經(jīng)過(guò)一定的循環(huán)數(shù)被指數(shù)擴(kuò)增而積累，擴(kuò)增循環(huán)數(shù)和產(chǎn)物量之間的關(guān)系是：擴(kuò)增產(chǎn)物量=起始模板量×（1+En）循環(huán)個(gè)數(shù),。然而qPCR反應(yīng)并不是一直處于理想情況下,，當(dāng)擴(kuò)增產(chǎn)物量達(dá)到“一定產(chǎn)物量”時(shí)，此時(shí)循環(huán)個(gè)數(shù)為Ct值,，處于指數(shù)擴(kuò)增時(shí)期。Ct值與起始模板量的關(guān)系：模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系,。起始模板量濃度越高,，Ct值越小,；起始模板量濃度越低,，Ct值越大。 2.擴(kuò)增曲線,、熒光閾值與一定產(chǎn)物量 qPCR擴(kuò)增產(chǎn)物量是以熒光信號(hào)的形式直接呈現(xiàn),，也就是擴(kuò)增曲線。在PCR早期,，擴(kuò)增處于理想情況下,，循環(huán)數(shù)較少，產(chǎn)物積累少,，產(chǎn)生熒光的水平不能與熒光本底背景明顯地區(qū)別,，之后熒光的產(chǎn)生增加進(jìn)入指數(shù)期?？梢栽?/span>PCR反應(yīng)剛處于指數(shù)期的某一點(diǎn)上來(lái)檢測(cè)PCR產(chǎn)物的量,，以此作為“一定產(chǎn)物量”，并且由此來(lái)推斷模板最初的含量,。因此,，一定產(chǎn)物量對(duì)應(yīng)的熒光信號(hào)強(qiáng)度，也就是熒光閾值,。
在PCR的后期,，擴(kuò)增曲線不再呈現(xiàn)指數(shù)擴(kuò)增,，進(jìn)入線性期和平臺(tái)期。 3.Ct值的重現(xiàn)性 PCR循環(huán)在到達(dá)Ct值所在的循環(huán)數(shù)時(shí),，剛剛進(jìn)入真正的指數(shù)擴(kuò)增期,，此時(shí)微小誤差尚未放大，因此Ct值的重現(xiàn)性極好,，即同一模板不同時(shí)間擴(kuò)增或同一時(shí)間不同管內(nèi)擴(kuò)增,，得到的Ct值是恒定的。 Ct值的范圍,？ 1.擴(kuò)增效率En PCR擴(kuò)增效率是指聚合酶把待擴(kuò)增基因轉(zhuǎn)變生成擴(kuò)增子的效率,。由1個(gè)DNA分子轉(zhuǎn)變生成2個(gè)DNA分子時(shí)的擴(kuò)增效率為100%。擴(kuò)增效率常用En表示,。為了方便后續(xù)文章的分析,，簡(jiǎn)要介紹下影響擴(kuò)增效率的因素。
2.Ct值的范圍 Ct值的范圍為15-35,。Ct值小于15,，認(rèn)為擴(kuò)增在基線期范圍內(nèi)，未達(dá)到熒光閾值,。理想情況下,，Ct值與模板起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系，也就是標(biāo)準(zhǔn)曲線,。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線,，擴(kuò)增效率為100%時(shí)，計(jì)算出基因單個(gè)拷貝數(shù)定量的Ct值在35左右,，若大于35,，理論上模板起始拷貝數(shù)小于1，可認(rèn)為無(wú)意義,。
對(duì)于不同的基因Ct范圍,，因起始模板量中基因拷貝數(shù)和擴(kuò)增效率不同，需做出該基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線,，計(jì)算出基因的線性檢測(cè)范圍,。 3.Ct值的影響因素 由擴(kuò)增循環(huán)數(shù)和產(chǎn)物量之間的關(guān)系：擴(kuò)增產(chǎn)物量=起始模板量×（1+En）循環(huán)個(gè)數(shù)，可以看出,，在理想條件下,，起始模板量和En會(huì)對(duì)Ct值產(chǎn)生影響,。模板質(zhì)量或者擴(kuò)增效率的差異會(huì)造成Ct值偏大或過(guò)小,。 4.Ct值過(guò)大或過(guò)小 小翊威逼利誘了我公司技術(shù)部的牛牛們，總結(jié)出Ct值常見(jiàn)的兩類問(wèn)題的原因和解決方法,，以饗讀者,。
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