自身炎癥性疾病是由先天免疫系統(tǒng)異常激活引起的一組罕見疾病,，其特征為周期性發(fā)燒和系統(tǒng)性炎癥,。例如：家族性地中海熱(FMF)，腫瘤壞死因子受體相關(guān)的周期性綜合征(TRAPS),，IL-1受體拮抗劑缺乏癥(DIRA),，腺苷脫氨酶2缺陷病(DADA2)等,。自身炎癥性疾病很多是由于調(diào)節(jié)先天免疫系統(tǒng)的基因發(fā)生突變導(dǎo)致的單基因遺傳病，這些遺傳變異可以從父母?jìng)鹘o孩子,，導(dǎo)致家庭中出現(xiàn)多例相似的患者,。

隨著人類基因組學(xué)和免疫學(xué)知識(shí)的不斷完善，以及二代測(cè)序等技術(shù)手段的支撐,，自身炎癥性疾病在過去20多年中飛速發(fā)展,。科學(xué)家們能夠鑒定出導(dǎo)致不同自身炎癥性疾病的遺傳變異,，為受累患者的臨床治療和罕見病的基因檢測(cè)提供寶貴的數(shù)據(jù)基礎(chǔ),。

RIPK1（Receptor-Interactingserine/threonine-Protein Kinase-1）是受體相互作用蛋白（RIP）激酶家族的一員，參與了決定細(xì)胞“生死存亡”的多種重要信號(hào)通路,，其激酶活性在RIPK1依賴的細(xì)胞凋亡和細(xì)胞程序性壞死進(jìn)程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用,。RIPK1蛋白的中間結(jié)構(gòu)域（intermediate domain）中含有caspase-8（相關(guān)閱讀：Nature | Caspase-8決定細(xì)胞死亡的不同方式；Nature | Caspase-8通過切割RIPK1緩解凋亡和壞死過度激活,；Caspase-8參與細(xì)胞焦亡過程的新功能——邵峰點(diǎn)評(píng)）的切割位點(diǎn)（Asp324）,。以往的研究發(fā)現(xiàn)，小鼠RIPK1對(duì)應(yīng)位點(diǎn)（Asp325）突變會(huì)引起胚胎致死,，主要是由于增多的細(xì)胞凋亡和程序性壞死,，同時(shí)敲除Ripk3和Fadd，或者M(jìn)lkl和Fadd可以逆轉(zhuǎn)這一致死表型,。然而,，人類RIPK1該切割位點(diǎn)變異對(duì)這些重要信號(hào)通路及人類健康的影響未有報(bào)道。

2019年12月12日,，浙江大學(xué)生命科學(xué)研究院周青課題組,、哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院袁鈞英課題組和復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院王曉川課題組聯(lián)合在Nature雜志上發(fā)表研究論文“Adominant autoinflammatory disease caused by non-cleavable variants of RIPK1”，報(bào)道了人類RIPK1切割位點(diǎn)變異會(huì)阻止caspase-8蛋白酶對(duì)其切割,，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡,、細(xì)胞壞死和炎癥信號(hào)通路的過度激活，從而引起嚴(yán)重的自身炎癥疾病,。揭示的發(fā)病分子機(jī)制指導(dǎo)臨床治療極大的緩解了病人的臨床癥狀,。

周青課題組從來自世界各地的、未能明確診斷的自身炎癥性疾病病例中,，通過全外顯子測(cè)序,，鑒定到了兩個(gè)分別來自中國和加拿大的家系，受累患者的RIPK1蛋白均有D324氨基酸新發(fā)突變,。病人表現(xiàn)出典型的自身炎癥疾性疾病表型，主要包括周期性發(fā)熱,、淋巴結(jié)腫大,、肝脾腫大等（圖1）。

圖1 病人家系信息及部分表型

通過Sanger測(cè)序驗(yàn)證病人確實(shí)攜帶RIPK1雜合突變后，作者從病人全血中分別分離了血清和外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMCs）,。血清細(xì)胞因子檢測(cè)發(fā)現(xiàn)病人血清中促炎細(xì)胞因子IL-6,、TNF和抗炎細(xì)胞因子IL-10等水平顯著升高。PBMCs的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)病人的單核細(xì)胞比例提高,，并且NF-kB和type-I IFN炎癥信號(hào)通路基因轉(zhuǎn)錄水平顯著上升,。

鑒于RIPK1蛋白在細(xì)胞死亡和炎癥信號(hào)通路中的重要作用，作者接下來分別對(duì)來自病人和健康對(duì)照的PBMCs進(jìn)行程序性死亡誘導(dǎo),，結(jié)果發(fā)現(xiàn),，攜帶RIPK1雜合變異的病人細(xì)胞對(duì)TNF誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和細(xì)胞程序性壞死更加敏感，并且可以誘導(dǎo)產(chǎn)生顯著上調(diào)的IL-6,、TNF等炎癥因子,。這些變化可以通過添加RIPK1激酶抑制劑necrostatin-1s(Nec-1s) 緩解，說明其都依賴于上調(diào)的RIPK1激酶活性,。Cyclophilin A 的釋放在細(xì)胞壞死后會(huì)增加,，已作為一種生化標(biāo)志物應(yīng)用于在多種疾病的診斷。作者發(fā)現(xiàn)攜帶RIPK1變異的病人尿液中可以檢測(cè)到cyclophilin A 水平相比健康對(duì)照顯著升高,。這些結(jié)果分別從體外和體內(nèi)證明了RIPK1D324位點(diǎn)的變異促進(jìn)了RIPK1的激活,，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞死亡的增加和自身炎癥的發(fā)生。

為了進(jìn)一步弄清楚病人發(fā)病的分子機(jī)制,，作者在Ripk1-knockout MEFs中分別過表達(dá)WT和D325突變的RIPK1,，結(jié)果與PBMCs實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，D325位點(diǎn)突變的RIPK1在TNF誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和細(xì)胞壞死過程中激活顯著增加,，進(jìn)而引起細(xì)胞死亡水平的顯著上調(diào),。而細(xì)胞壞死缺陷的RIPK1 D325A突變的knockin小鼠（Ripk3-/-Ripk1 D325A/D325A）MEFs同樣表現(xiàn)出對(duì)TNF誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡更加敏感，同時(shí)說明過度激活的RIPK1對(duì)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞壞死的促進(jìn)是相互獨(dú)立,，互不依賴的,。炎癥因子檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)也證明在TNF的刺激下，RIPK1 D325A突變的MEFs細(xì)胞中IL6,、CXCL2和TNF轉(zhuǎn)錄水平顯著上調(diào),。

根據(jù)病人血清、PBMCs細(xì)胞,、RIPK1 D325突變的MEFs細(xì)胞的研究結(jié)果,，作者發(fā)現(xiàn)RIPK1過度激活顯著提高了病人體內(nèi)、體外病人細(xì)胞,、MEFs中炎癥因子IL-6水平,。IL-6既是細(xì)胞在受到如TNF等刺激時(shí)釋放的炎癥因子，也可以進(jìn)一步誘導(dǎo)其他細(xì)胞發(fā)生炎癥反應(yīng),。目前人們已經(jīng)研發(fā)出IL-6受體的抑制劑并應(yīng)用于臨床,，因此,，作者建議用tocilizumab(anti-IL-6R)對(duì)病人進(jìn)行臨床治療。經(jīng)過幾個(gè)月的治療,，病人的周期性發(fā)燒得到明顯控制,，其PBMC中相關(guān)炎癥因子的基因表達(dá)量也恢復(fù)正常。

實(shí)驗(yàn)中一個(gè)有趣的發(fā)現(xiàn)是,，與病人PBMCs相反,，病人的皮膚成纖維細(xì)胞(fibroblasts) 表現(xiàn)出對(duì)TNF、LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞壞死的抵抗,，而且對(duì)Erastin,、RSL3等誘導(dǎo)的鐵死亡也有抵抗作用。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),，病人成纖維細(xì)胞RIPK1,、TNFR1等蛋白表達(dá)水平明顯下調(diào)，細(xì)胞內(nèi)的還原性谷胱甘肽（GSH）含量高,，活性氧（ROS）含量低,，這些變化部分解釋了成纖維細(xì)胞對(duì)不同死亡形式的抵抗。這一現(xiàn)象提示病人成纖維細(xì)胞為應(yīng)對(duì)RIPK1變異導(dǎo)致的對(duì)多種刺激的高敏感性發(fā)展出多種補(bǔ)償機(jī)制來維持機(jī)體穩(wěn)態(tài),。

本研究首次發(fā)現(xiàn)人類RIPK1非切割變異導(dǎo)致自身炎癥性疾病并解析其發(fā)病分子機(jī)制,。結(jié)果表明不能切割的RIPK1可以促進(jìn)其激酶活性，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡,、細(xì)胞程序性壞死增加,、炎癥因子上調(diào)，為臨床提供更加合理,、科學(xué)的治療建議,；同時(shí)還發(fā)現(xiàn)病人不同種類細(xì)胞響應(yīng)外來刺激的異質(zhì)性，豐富了RIPK1在調(diào)節(jié)不同種類細(xì)胞死亡中的作用,。

據(jù)悉,，浙江大學(xué)生命科學(xué)研究院周青研究員、哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院袁鈞英教授,、復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院王曉川教授和俞曉敏博士為本文通訊作者,。周青課題組博士研究生陶攀峰、博士研究生王俊和王詩豪博士,，袁鈞英課題組吳哲銘博士,、李婉津博士和復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院孫金嶠教授為本文共同第一作者。

值得一提的是,，在同期online的還有來自澳大利亞Walter and Eliza Hall研究所John Silke團(tuán)隊(duì)發(fā)表的長(zhǎng)文文章Mutations that prevent caspase cleavage of RIPK1 cause autoinflammatory disease,，揭示了Caspase介導(dǎo)的RIPK1的切割在胚胎發(fā)育過程中的重要性，同時(shí)還揭示在整個(gè)生命階段其不僅可以抑制壞死還可以維持炎癥穩(wěn)態(tài)（注：和周青等人的工作相似,，主要也是基于RIPK1D325突變進(jìn)行炎癥穩(wěn)態(tài)調(diào)控研究）,。

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