|
測量熒光圖片的熒光強度，也是一個常用的操作,，單熒光圖片直接測,，多熒光通道merge圖片拆分一下通道也很方便。下面就熒光強度測量中常常會遇到的三種情況進行圖示：通道整體平均（加和）熒光強度,、指定區(qū)域平均（加和）熒光強度以及大量細胞單獨的平均（加和）熒光強度,，本質(zhì)上其實還是在玩選區(qū)。2,、以藍色通道圖為例，選擇Image-Adjust-Threshold,，勾選Dark Background,，點擊Auto,，結(jié)果將自動識別藍色的細胞核，并且以默認的紅色蒙版表示細胞核選區(qū),；3,、選擇Analyze-Set Measurements，勾選必須的測量選項：Mean gray value,；Area 和Integrated Density可以不勾選,，這里勾選；由于是利用threshold產(chǎn)生的紅色蒙版來確定測量的選區(qū),，所以Limited To Threshold必須勾選,，否則是以整個圖片作為選區(qū)進行測定；由于有多張圖片在測量,，把Display Label也勾選上,，以示區(qū)別。 
4,、選擇Analyze-Measure（快捷鍵Ctrl+M或M）,，獲得結(jié)果，結(jié)果Mean表示平均灰度值,，IntDen表示總的灰度值,；這個平均灰度值就可以用來表示圖片中的平均藍色熒光強度了，圖片里面的細胞核越多,，結(jié)果就會越準確,。5,、本教程前四步和之前有關(guān)測量的教程里面,，其實我們測的都是灰度值，這是軟件默認的表示方法,。我們可以通過設置,，測量真正的光密度值：選擇Analyze-Calibrate，選擇最下面一個Uncalibrated OD（未校正的OD值）,，會彈出Uncalibrated OD和pixel value（像素灰階值）的關(guān)系曲線,。
我們從第4步獲得的結(jié)果可知，藍色通道圖片被threshold所選擇的細胞核像素灰度值是53-255,，在上面這條曲線里面,，我們可以看到這個區(qū)間的灰階值和Uncalibrated OD是基本成線性關(guān)系的（事實上灰階值比較低的像素點是黑色的，被當成背景處理了）,，所以可以用Uncalibrated OD來表示細胞核的平均熒光強度,。6、選擇Analyze-Measure（快捷鍵Ctrl+M或M）,，獲得結(jié)果,，結(jié)果Mean為0.416,，這就是平均的Uncalibrated OD，IntDen表示總的Uncalibrated OD,；如果不想測量被Threshold所選擇的所有區(qū)域，比如我就對左下角這個完整的細胞核感興趣,，我只想測量它的平均熒光強度該怎么辦呢,？很簡單，在用Threshold做出選區(qū)之后,，使用其他選區(qū)工具對自己感興趣的區(qū)域進行再次選擇,，然后測量就可以了。比如下圖,，使用矩形工具在圖片上面拉一個框：如果圖片中有多個熒光對象,，我想測量每一個對象的平均熒光強度怎么辦呢？很簡單,，把每一個需要測量的對象都建立選區(qū),，然后分別對每個選區(qū)進行測量即可。1,、打開一張圖片,，選擇Image-Type-8 bit（如果是如本教程拆分出來的單通道圖片，則不需要再轉(zhuǎn)成8 bit）,；2,、選擇Image-Adjust-Threshold，勾選Dark Background,，點擊Auto,，利用threshold構(gòu)建選區(qū)，選出需要測量的區(qū)域,，這里是細胞核,。3、因為有些細胞核連在一起了,，需要用到二值化（Binary）里面的“分水嶺”（Watershred）法來進行分割,，所以這里點擊Apply對紅色蒙版選區(qū)進行二值化；4,、選擇Process -> Binary -> Watershed,，分割連在一起的細胞核；5,、選擇Analyze -> Analyze Particles,，務必勾選“Add to Manager”，將這一步產(chǎn)生的選區(qū)添加到ROI管理器中,。前面到這里的五步和細胞自動計數(shù)是一樣的,，唯一不同的地方就在于此,，要勾選Add to Manager！
7,、到此,，獲得了所有細胞核的選區(qū)！勾選Show all,，選擇File-Revert（或者關(guān)掉圖片重新打開一次）,，回到熒光照片最初的樣子，但是剛剛建立的幾百個選區(qū)仍然存在,；8,、點擊ROI管理器上面的Measure，將獲得每個選區(qū)的測量結(jié)果,，每個細胞核各自的平均熒光強度就測出來了,。當然，在測量之前同樣可以轉(zhuǎn)換成Uncalibrated OD,；
以上就是常見的熒光強度測量方式,，有沒有幫到你呢？ 鑒于有些同學說Fiji很難下載,，下面我把Fiji的win64版和mac版放在了網(wǎng)盤里面,，有需要的請自行下載。
鏈接：https://pan.baidu.com/s/1JCEtW0jMwnB3mV6jiXlatw 提取碼：xol8（請復制粘貼使用提取碼,，我知道你們分不清1和I和l）
|
