我們來(lái)看cell上這篇文章,，和昨天介紹的FANTOM項(xiàng)目研究目的和方法幾乎一樣。
通過(guò)這篇文章我們來(lái)看下他們是如何研究增強(qiáng)子表達(dá)和腫瘤之間的作用機(jī)制的~
FANTOM5項(xiàng)目研發(fā)出了一種捕獲技術(shù),，當(dāng)DNA開(kāi)始轉(zhuǎn)錄合成RNA時(shí),，就能夠立馬捕獲RNA，從而精確地定位啟動(dòng)子,。這項(xiàng)技術(shù)也能夠定位增強(qiáng)子,，因?yàn)檫@些調(diào)控DNA也會(huì)被轉(zhuǎn)錄為RNA。

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研究背景

每個(gè)細(xì)胞組分的生物學(xué)功能都是由如“俄羅斯套娃”樣的多級(jí)基因調(diào)控層次控制的,，包括轉(zhuǎn)錄因子-啟動(dòng)子互作,、增強(qiáng)子激活、DNA甲基化,、microRNA介導(dǎo)的調(diào)控,、翻譯和翻譯后修飾。在癌細(xì)胞中,，調(diào)控網(wǎng)絡(luò)常常被共同導(dǎo)致癌癥表型的分子畸變重構(gòu),。例如，體細(xì)胞突變可以修飾調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中反式和順式元件的功能,，從而賦予與腫瘤發(fā)生相關(guān)的細(xì)胞行為,。大型患者隊(duì)列TCGA研究系統(tǒng)地表征了各種癌癥類(lèi)型的不同水平的關(guān)鍵分子改變，為致癌機(jī)制和潛在治療方法提供了前所未有的見(jiàn)解,。
重構(gòu)癌癥調(diào)控網(wǎng)絡(luò)遠(yuǎn)未完成,，尤其是增強(qiáng)子部分。增強(qiáng)子是重要的非編碼DNA元件,，其與它們的靶啟動(dòng)子在空間上相互作用以調(diào)控下游基因,。作為主要的細(xì)胞發(fā)育調(diào)控元件，增強(qiáng)子在致癌過(guò)程中也發(fā)揮關(guān)鍵作用,。目前,，仍缺乏癌癥細(xì)胞全局的活性增強(qiáng)子表達(dá)分析，這可能是由于大樣本量高通量測(cè)序（如chip-seq）技術(shù)上的難度造成的。
為什么用RNA-seq檢測(cè)增強(qiáng)子表達(dá)：非活性增強(qiáng)子通常由未修飾的核小體組成,，因此不能被轉(zhuǎn)錄因子或聚合酶接觸（接近）,。當(dāng)增強(qiáng)子被激活以響應(yīng)信號(hào)傳導(dǎo)時(shí)，其局部染色質(zhì)首先被修飾（通常由H3K4Me1修飾）并變得松散,，使得增強(qiáng)子可被轉(zhuǎn)錄因子和RNA聚合酶接觸,。當(dāng)結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子完全激活增強(qiáng)子時(shí)，通常被H3K27Ac重新標(biāo)記,，局部染色質(zhì)完全開(kāi)放,，募集RNA聚合酶在兩個(gè)方向啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄。因此,，增強(qiáng)子表達(dá)水平代表增強(qiáng)子活化的基本特征,，可以通過(guò)RNA-seq檢測(cè)大部分增強(qiáng)子的表達(dá)。

增強(qiáng)子活化過(guò)程

注：CAGE-seq（cap analysis of gene expression）,，結(jié)合mRNA加帽位點(diǎn)鑒定和高通量測(cè)序的手段,，可以高通量地鑒定整個(gè)細(xì)胞內(nèi)mRNA的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，從而獲得準(zhǔn)確的啟動(dòng)子信息和5’UTR信息,。

研究目的

（1）描述癌癥中增強(qiáng)子表達(dá)的全局模式,；
（2）了解增強(qiáng)子激活與其它基因組畸變以及相關(guān)基礎(chǔ)機(jī)制的關(guān)系；
（3）鑒定定關(guān)鍵增強(qiáng)子并探索其潛在的臨床意義,。

研究路線(xiàn)

路線(xiàn)

研究結(jié)果

增強(qiáng)子篩選及表達(dá)分析流程

1.人類(lèi)癌癥中增強(qiáng)子表達(dá)概況

來(lái)自33種癌癥的8,928個(gè)癌癥樣本TCGA RNA-seq表達(dá)數(shù)據(jù),，共計(jì)鑒定到15,808個(gè)增強(qiáng)子。每種癌癥類(lèi)型>10％樣本平均檢測(cè)到4,591種增強(qiáng)子,。在25種具有足夠樣本量以及隨訪(fǎng)時(shí)間的癌癥類(lèi)型中,，通過(guò)Cox回歸分析與疾病生存期相關(guān)的活性增強(qiáng)子，結(jié)果表明許多活性表達(dá)的增強(qiáng)子與預(yù)后相關(guān),。肝臟肝細(xì)胞癌（LIHC）具有最低的增強(qiáng)子表達(dá)水平（?100RPM）,，而胸腺瘤（THYM）增強(qiáng)子表達(dá)水平最高（?240RPM）。與相同患者的正常組織相比,，大多數(shù)癌癥類(lèi)型的腫瘤組織的增強(qiáng)子表達(dá)水平升高,，即增強(qiáng)子活化。

不同癌癥中表達(dá)的活性增強(qiáng)子及與預(yù)后相關(guān)的活性增強(qiáng)子

不同癌癥活性增強(qiáng)子的表達(dá)水平以及與正常對(duì)照樣本間的比較

2. 腫瘤中增強(qiáng)子活化與腫瘤非整倍性（aneuploidy）正相關(guān)

體細(xì)胞拷貝數(shù)改變（Somatic copy-number alteration, SCNA）和點(diǎn)突變是2種影響癌癥基因組穩(wěn)定性的最常見(jiàn)的突變,。結(jié)合來(lái)自Affymetrix SNP6.0的非整倍體數(shù)據(jù)（SCNA）以及全外顯子組測(cè)序得到沉默（silent）體細(xì)胞突變（不引起氨基酸替換）數(shù)據(jù)（TMB,，突變負(fù)荷/載量），與增強(qiáng)子活化數(shù)據(jù)（RPM）聯(lián)合分析,，表明大多數(shù)癌癥類(lèi)型（19/25）中非整倍體水平與增強(qiáng)子活化水平呈顯著正相關(guān)。相反,，沉默點(diǎn)突變則沒(méi)有相關(guān)性或只有輕微的負(fù)相關(guān)性,。

SCNA / silent TMB vs. 增強(qiáng)子表達(dá)水平RPM

注：橙色或藍(lán)色表示相關(guān)系數(shù)Spearman’s correlation coefficient (rho)檢驗(yàn)為顯著的。

對(duì)腫瘤樣本的1500個(gè)增強(qiáng)子表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行consensus聚類(lèi)分析，得到3種亞類(lèi)（簇）：C1,、C2和C3,，并且不受疾病類(lèi)型驅(qū)動(dòng)。3種亞類(lèi)的腫瘤樣本增強(qiáng)子表達(dá)水平均高于其正常樣本,，其中C2亞類(lèi)的增強(qiáng)子表達(dá)水平最高,。如前所述，SCNA與增強(qiáng)子表達(dá)水平正相關(guān),，故而C2亞類(lèi)中受SCNA的影響比較大,，SCNA影響數(shù)千基因表達(dá)。對(duì)于silent體細(xì)胞突變負(fù)荷TMB,，C1>C2>C3,。增強(qiáng)子激活與基因組不穩(wěn)定性的相關(guān)性可以概括為下圖：C1亞類(lèi)富含具有高突變負(fù)荷和低非整倍性的樣品；C2亞類(lèi)富含具有較高突變負(fù)荷和高非整倍性的樣品,；C3為“normallike”,，接近于正常組織，具有低突變負(fù)荷和低非整倍性,。癌癥類(lèi)型內(nèi)和癌癥類(lèi)型間的分析都表明SCNAs是與增強(qiáng)子激活正相關(guān)的突變形式,，而不是silent點(diǎn)突變。

根據(jù)增強(qiáng)子表達(dá)數(shù)據(jù)對(duì)腫瘤樣本進(jìn)行consensus聚類(lèi)分析 不同亞類(lèi)間的增強(qiáng)子表達(dá)水平,、SCNA和silent突變負(fù)荷比較

3. 以“染色質(zhì)狀態(tài)”為中心的增強(qiáng)子激活,、SCNAs和點(diǎn)突變的互作模型

為什么SCNAs和點(diǎn)突變與癌癥中的增強(qiáng)子激活相關(guān)聯(lián)？據(jù)報(bào)道,，人類(lèi)基因組染色質(zhì)空間組織的變化是整個(gè)基因組體細(xì)胞突變率變化的主要決定因素,。低突變率是開(kāi)放染色質(zhì)DNA的一個(gè)特征，因?yàn)橥蛔兛赏ㄟ^(guò)DNA修復(fù)機(jī)制獲得修復(fù),；同時(shí),，染色質(zhì)開(kāi)放恰好是增強(qiáng)子活化的先決條件。激活后,，增強(qiáng)子與目標(biāo)DNA成環(huán),，并與其互作，產(chǎn)生DNA-DNA拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)上的互作,；當(dāng)發(fā)生斷裂時(shí),，遠(yuǎn)程DNA-DNA物理上接觸增加了部分1D-序列相距很遠(yuǎn)的位點(diǎn)接觸和發(fā)生重排的機(jī)率，由此產(chǎn)生結(jié)構(gòu)變異——這揭示了SCNAs和點(diǎn)突變分別與增強(qiáng)子激活間差異相關(guān)性的分子機(jī)制,，是建立在染色質(zhì)開(kāi)放性差異的基礎(chǔ)上,。在該模型中，緊湊染色質(zhì)有利于點(diǎn)突變并保持增強(qiáng)子沉默,；一旦染色質(zhì)打開(kāi),，增強(qiáng)子被激活的可能性增加,。同時(shí)，由于展開(kāi)的DNA被拉長(zhǎng)了1-2個(gè)數(shù)量級(jí),，所以遠(yuǎn)程DNA-DNA互作發(fā)生的可能性增加,，同時(shí)增加了DNA重排（SCNA）的機(jī)會(huì)。ATAC-seq和H3K27ac的ChIP-seq數(shù)據(jù)標(biāo)識(shí)開(kāi)放染色質(zhì)（open chromatin）,，用H3K9me2和H3K9me3標(biāo)識(shí)封閉染色質(zhì)（closed chromatin）,，開(kāi)放和封閉染色質(zhì)的雙鏈斷裂（DSB，SCNA斷裂點(diǎn)）率和點(diǎn)突變率的確呈現(xiàn)相反趨勢(shì),。

以“染色質(zhì)狀態(tài)”為中心的模型

根據(jù)上述模型,，開(kāi)放染色質(zhì)中的遠(yuǎn)程DNA-DNA互作（Hi-C互作），至少在一定程度上解釋了增強(qiáng)子激活和不同基因組區(qū)域中SCNAs的正相關(guān)性,。為了測(cè)試這種可能性,，作者檢測(cè)了人基因組的雙鏈斷裂（DSB）率最高的500個(gè)10-kb片段，發(fā)現(xiàn)40％（n = 204）富集于Hi-C鑒定到的Loop區(qū)域,。同時(shí),，增強(qiáng)子也傾向與loop區(qū)域重疊。下圖提供了一個(gè)簡(jiǎn)單而合理的假設(shè)模型,，雖然僅試驗(yàn)性地解釋了增強(qiáng)子激活與SCNAs和突變的差異關(guān)聯(lián),。

開(kāi)放染色質(zhì)促進(jìn)DNA結(jié)構(gòu)重排的假設(shè)模型

4. 系統(tǒng)性鑒定與癌癥基因互作的具有因果關(guān)系的增強(qiáng)子

整合增強(qiáng)子和mRNA表達(dá)數(shù)據(jù)，通過(guò)共表達(dá)分析可獲得增強(qiáng)子的候選靶基因,。對(duì)于共表達(dá)的特定增強(qiáng)子-基因組合,，至少存在3種可能的關(guān)系模型：（1）因果關(guān)系，增強(qiáng)子表達(dá)的變化引起基因的差異表達(dá),；（2）reactive關(guān)系,，基因位于增強(qiáng)子的上游；（3）共響應(yīng)關(guān)系,，增強(qiáng)子和基因都響應(yīng)其它分子變化,。本文中以第一種關(guān)系進(jìn)行探討，引入eQTL進(jìn)行分析,?；驹砣缦拢河绊懺鰪?qiáng)子活性的單核苷酸多態(tài)性（SNP）會(huì)影響增強(qiáng)子下游靶基因的表達(dá)，由此使得SNP（或鄰近連鎖遺傳的SNP）成為目標(biāo)基因的eQTL位點(diǎn),；對(duì)于這樣的共表達(dá)增強(qiáng)子-基因?qū)?，使用Hi-C數(shù)據(jù)來(lái)評(píng)估該因果關(guān)系是否為直接調(diào)控。

共表達(dá)增強(qiáng)子與基因之間的關(guān)系模型以及鑒定具有因果關(guān)系的增強(qiáng)子-基因互作的流程

根據(jù)該方法,，鑒定了65個(gè)符合條件的互作,，涉及49個(gè)增強(qiáng)子和47個(gè)癌癥基因，并繪制了預(yù)測(cè)的增強(qiáng)子-基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò),。其中22個(gè)和8個(gè)癌癥基因分別注釋為CGC數(shù)據(jù)庫(kù)中的癌基因（oncogene）和腫瘤抑制基因（TSG）,，表明增強(qiáng)子更傾向于調(diào)控癌基因,。根據(jù)CGC注釋?zhuān)@30個(gè)基因位于不同的癌癥hallmarks基因集中，富集于增殖和轉(zhuǎn)移,。這些增強(qiáng)子-基因共表達(dá)富集于直接調(diào)控和因果調(diào)控?？傊?，這些結(jié)果提供了增強(qiáng)子激活可能有助于腫瘤發(fā)展的途徑的見(jiàn)解。

增強(qiáng)子-基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)

5. 靶向臨床上可操作基因的增強(qiáng)子具有潛在的臨床相關(guān)性

增強(qiáng)子作為預(yù)后標(biāo)志物：作者以chr22（chr22：50980817-50981280,，下文簡(jiǎn)稱(chēng)增強(qiáng)子22）和其推斷的目標(biāo)基因SYK為例,，詳細(xì)分析了增強(qiáng)子如何調(diào)控驅(qū)動(dòng)基因從而作為預(yù)后標(biāo)志物。ENCODE ChIP-seq數(shù)據(jù)集注釋到增強(qiáng)子22區(qū)域內(nèi)或其側(cè)翼富集大量蛋白質(zhì)-DNA互作peak,。3個(gè)連鎖遺傳的SNP位于增強(qiáng)子22中,，這3個(gè)SNP都是SYK基因的eQTL（基因型與mRNA或者蛋白表達(dá)水平相關(guān)）。SYK是一種致癌驅(qū)動(dòng)基因,，在多種類(lèi)型的晚期癌癥中被激活,，并且與臨床預(yù)后不良相關(guān)?；颊呱鏁r(shí)間分析進(jìn)一步支持了增強(qiáng)子22作為幾種癌癥類(lèi)型的不良預(yù)后的標(biāo)志物,。由于eQTL、RNA-seq和蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)是從獨(dú)立平臺(tái)生成的,，并且在多個(gè)來(lái)源組織中觀察到相關(guān)性,，所以這些結(jié)果提供了增強(qiáng)子22是預(yù)后標(biāo)志物的證據(jù)，主要通過(guò)對(duì)其下游基因SYK的調(diào)控作用實(shí)現(xiàn),。

不同癌癥中增強(qiáng)子22的K-M生存曲線(xiàn)分析

增強(qiáng)子作為免疫治療反應(yīng)的預(yù)測(cè)標(biāo)志物：PD-L1在癌癥免于免疫系統(tǒng)攻擊中扮演著重要角色,，因此一直是免疫治療“檢查點(diǎn)抑制”的主要靶標(biāo)，尤其是肺癌和黑色素瘤的治療,，下面以距PD-L1約140kb的增強(qiáng)子（chr9：5580709-5581016,，下文稱(chēng)為增強(qiáng)子9）為例進(jìn)行闡述。作者發(fā)現(xiàn)多種癌癥類(lèi)型中觀察到PD-L1 mRNA和增強(qiáng)子9之間的強(qiáng)共表達(dá),；在CCLE（癌癥細(xì)胞系百科全書(shū)數(shù)據(jù)庫(kù)）130個(gè)肺癌細(xì)胞系中也證實(shí)了增強(qiáng)子9與PD-L1共表達(dá),；PD-L1 eQTL位于增強(qiáng)子的鄰近區(qū)域，表明增強(qiáng)子是PD-L1的上游調(diào)控元件,；人類(lèi)細(xì)胞系的Hi-C數(shù)據(jù)集進(jìn)一步證實(shí)了PD-L1基因和增強(qiáng)子9之間的直接相互作用,。ENCODE項(xiàng)目中調(diào)查的161個(gè)轉(zhuǎn)錄因子中，NF-kB是唯一注釋到增強(qiáng)子9的一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子,；ChIP-seq數(shù)據(jù)顯示NF-kB強(qiáng)烈結(jié)合在增強(qiáng)子9上以及PD-L1啟動(dòng)子的p65結(jié)合基序上,，表明NF-kB參與增強(qiáng)子/ PD-L1相互作用。同時(shí),，最近有研究報(bào)道,，NF-kB二聚體對(duì)于PD-L1的激活是必不可少的,。利用CRISPR-Cas9敲除增強(qiáng)子9，獲得穩(wěn)定的增強(qiáng)子9純合缺失的肺癌A549細(xì)胞系,。增強(qiáng)子9的敲除在mRNA和蛋白質(zhì)水平都顯著降低PDL1表達(dá),，掩蓋了IFN-g（活化的NF-kB）誘導(dǎo)PD-L1表達(dá)的效應(yīng)。這些結(jié)果表明,，NF-kB介導(dǎo)的增強(qiáng)子-啟動(dòng)子相互作用的PD-L1活化模型,，強(qiáng)調(diào)了增強(qiáng)子調(diào)節(jié)關(guān)鍵治療靶點(diǎn)的潛在重要方式。

增強(qiáng)子9調(diào)控免疫治療靶點(diǎn)PD-L1表達(dá)