對于細胞系及血細胞,，我們接受寄送來的細胞樣本，并會在公司進行細胞數(shù)量,、細胞活性的質(zhì)控,。10X平臺對細胞活性的要求較高,，建議活細胞數(shù)量在90%或以上,。

對于培養(yǎng)的細胞系，我們公司建議1x10⁶/ml細胞量,。

對于血細胞,，我們公司建議1x10⁷/ml細胞量。

（1）細胞系樣本常溫寄送參考方法

1）將待測細胞接種于細胞培養(yǎng)瓶中

2）待細胞生長到培養(yǎng)瓶面積的50%,，加入37℃培養(yǎng)液灌滿整個培養(yǎng)瓶

3）扭緊瓶蓋,，封口膜封好

4）在培養(yǎng)瓶外側(cè)包裹保溫棉

5）常溫運輸

（2）細胞系樣本凍存寄送參考方法

1）細胞系生長密度達到70%或以上

2）將細胞用凍存液重懸混勻，分裝至凍存管中,，每管1 ml,，每個樣本建議送3管(凍存液配制：90%FBS+10%DMSO，可根據(jù)細胞系特性調(diào)整凍存液體系) ,。

3）凍存方法：室溫準備梯度降溫盒,，內(nèi)置新鮮異丙醇約250 ml(異丙醇可重復(fù)使用3-5次)，將裝有細胞懸液的凍存管放入梯度降溫盒,，置于-80°C冰箱過夜

4）干冰運輸

（3）凍存血液樣本寄送參考方法

1）抽取5 ml人外周血加入到EDTA抗凝管中,。將血液和淋巴細胞分離液置于20°C水浴箱中20 min，并保證所有操作在無菌條件下進行

2）加入等量HBSS稀釋全血

3）吸取2 ml淋巴細胞分離液,，加入15 ml的離心管,，將離心管傾斜45°，用槍吸取4 ml稀釋后的全血,，在離分層液面上1 cm處,，沿離心管壁緩慢加入，使稀釋血液量疊于分層液上,，保持兩者界面清晰(血樣與分層液體積比例約為2:1)

4）20°C,，500×g水平離心20 min(務(wù)必將離心機降速設(shè)置成no break)，離心后管中內(nèi)容物分為三層,，上層為血漿(內(nèi)含細胞碎片),，中間層為分層液，底層為紅細胞,，在上,、中層液體界面處可見到乳白色混濁的單個核細胞層(白膜層，薄),，單個核細胞包括淋巴細胞和單核細胞

5）棄去最上層,，小心將200 μl移液槍插入白膜層，沿離心管壁周緣吸取界面層單個核細胞,，移入另一離心管中

6）加入5 ml HBSS洗滌,，300xg離心10 min，棄去上清

7）加入1 ml HBSS重懸細胞,，于顯微鏡下計數(shù),，以備按照每管1×10⁷/ml細胞濃度進行凍存

8）活細胞精確記數(shù),；之后4°C，300xg離心5 min

9）加入4°C預(yù)冷重懸培養(yǎng)基（含40%FBS）重懸細胞至濃度為20x10⁶ cells/ml,，冰上操作

10）緩慢加入等體積2X冷凍培養(yǎng)基（含30%DMSO）至細胞濃度為10x10⁶ cells/ml,，并輕柔混勻細胞

11）冰上將1ml細胞懸液加入凍存管，遂將凍存管放到4°C預(yù)冷CoolCell? FTS30中,，-80°C放置4 h以上,，確保頂部基底部通風(fēng)口不被堵塞保證足夠的空氣流通

12）液氮凍存，干冰運輸

根據(jù)客戶送樣方式選擇不同的細胞復(fù)蘇方法,，之后用細胞計數(shù)器進行活細胞計數(shù),，若活細胞比例能達到80%，則可繼續(xù)進行后續(xù)實驗,。如上門操作,，則會在客戶制備完細胞懸液之后立即進行活性檢測。

技術(shù)原理圖

技術(shù)原理：利用8通道的微流體“雙十字”交叉系統(tǒng),，將含barcode的凝膠珠（Gel Beads）,、細胞和酶的混合物、油三者混合,，形成GEMs。

GEMs形成后,，細胞裂解,，凝膠珠自動溶解釋放大量barcode序列，隨后mRNA逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生帶有Barcode和UMI信息的cDNA,，再構(gòu)建標(biāo)準測序文庫,。

將檢測合格的細胞經(jīng)洗滌、重懸制備成合適濃度,，根據(jù)想獲取目的細胞的數(shù)目上樣,。上樣完成后，觀察油包水液珠是否正常形成,。液珠質(zhì)控合格后,，將其吸出轉(zhuǎn)移到PCR管中進行反轉(zhuǎn)錄及文庫構(gòu)建。庫檢合格后,，進行上機測序,。

建庫流程圖

一般情況下，我們推薦每個細胞測50,000-100,000條reads,，應(yīng)用Illumina Hiseq PE150的測序策略,，即得每個細胞測15-30M數(shù)據(jù)量。測序存在一定飽和性,，適當(dāng)加大測序數(shù)據(jù)量可提高基因的檢出率,，下圖為10X對于測序飽和度情況所做的測試分析,。

數(shù)據(jù)分析流程圖

1.1 原始測序數(shù)據(jù)過濾

10X Genomics文庫采用Illumina HiSeq PE150進行測序，read1前26bp為細胞barcode和UMI信息,。為了保證后續(xù)分析的結(jié)果準確可靠,，需要對原始的測序數(shù)據(jù)進行預(yù)處理，獲取用于后續(xù)分析的有效數(shù)據(jù)(Clean Data),。具體處理步驟如下：

1) 去除低質(zhì)量reads,；

2) 去除 N 堿基達到一定比例的 reads（默認設(shè)為10bp）；

3) 去除與 Adapter 之間 overlap 超過一定閾值（默認設(shè)為 15bp）的 reads,；

經(jīng)過如上的數(shù)據(jù)過濾過程,，得到clean data。

1.2 Raw Data數(shù)據(jù)質(zhì)量評估

采用FastQC對下機后的數(shù)據(jù)（raw reads）質(zhì)量進行基本的統(tǒng)計,，每個樣本中包含6個子圖,。

1.3 Clean Data數(shù)據(jù)質(zhì)量評估

我們還會對對質(zhì)控后的數(shù)據(jù)（clean reads）采用FastQC進行基本的質(zhì)量統(tǒng)計，每個樣本中同樣包括6個子圖,。

使用Cell Ranger流程對10X單細胞測序數(shù)據(jù)進行后續(xù)分析：reads比對,，細胞基因表達統(tǒng)計，聚類和差異分析,。

2.1 比對

Cell Ranger流程使用的STAR比對軟件將reads比對到參考基因組上,，然后根據(jù)比對結(jié)果和參考基因組GTF注釋信息，統(tǒng)計外顯子區(qū),、內(nèi)含子區(qū),、基因間區(qū)分別的reads數(shù)量，同時將外顯子區(qū)的reads比對到轉(zhuǎn)錄本上,，僅使用比對到一個基因上且與轉(zhuǎn)錄本方向一致的reads進行UMI統(tǒng)計,。

2.2 細胞和基因表達統(tǒng)計

Cell Ranger利用barcode和UMI 統(tǒng)計每個樣品中的細胞數(shù)量、以及細胞的reads數(shù)和檢測到的基因數(shù),。當(dāng)樣品含有RNA含量極其不同的細胞群體混合物時,，會傾向于忽略細胞。當(dāng)條形碼排列圖（或密度圖）和細胞中的分數(shù)讀數(shù)低于60％時,、或在barcode分布中出現(xiàn)二次分布的是可以觀察到的,。

Cell Ranger具備 multigenome analysis以區(qū)分多物種混合建庫的樣品；細胞barcode被分成H和M兩類,，以UMI的數(shù)量來區(qū)分的,。但當(dāng)出現(xiàn)UMI數(shù)量超過H和M的1%時，稱為多細胞,。因為Cell Ranger僅能檢測到H,、M兩類的多細胞，所以多細胞比例是根據(jù)多重細胞簇數(shù)量來估計的,。

2.3 聚類

（1）降維

為了將基因的表達矩陣降低到最重要的特征,，Cell Ranger使用PCA將數(shù)據(jù)集的維度從cells*gene改成cell*M,，M是用戶可選擇的compons事數(shù)量，該分析方法采用了IRLBA算法,，并進行了一定的修改,，目的在于減少內(nèi)存的消耗。

（2）聚類

Cell Ranger使用兩種不同的方法用于對表達相似的細胞聚類：Graph-based基于圖的聚類算法,，是通過構(gòu)建稀疏鄰近的圖,，然后再圖中尋找高度連接的Louvain算法。k值是細胞數(shù)量值取對數(shù)得到,；在聚類的過程中,，若cluster中沒有差異基因，則會進行進一步的層次聚類,，直到?jīng)]有可以合并的cluster,。

K-Means的算法是將數(shù)據(jù)構(gòu)建k個子集，然后計算每個類的中心點,，向中心點聚集,，直到聚類結(jié)果不在變化時停止。

2.4 差異表達分析

每cluster相對于其他所有cluster的差異基因,，Cell Ranger使用簡單快速的sSeq方法(基于負二項檢驗),。當(dāng)counts數(shù)量逐漸增大的時候，Cell Ranger將會自動使用edgeR中的beta檢驗,。差異表達分析是通過對一個cluster中所有細胞特定基因表達量均值相對于所有其他細胞特定基因表達量均值進行分析得到結(jié)果,。

采用10x提供的分析流程cell ranger進行數(shù)據(jù)分析，主要結(jié)果如下所示：reads數(shù)量,，測序質(zhì)量評估，參考基因組比對率,，估算樣本中細胞數(shù)量,、每個細胞中reads數(shù)均值和基因數(shù)中值。

4.1 t-SNE Projection of Cells Colored by UMI Counts

每個細胞barcode進行總UMI計數(shù),，UMI數(shù)量多的細胞可能較UMI數(shù)量少的細胞RNA含量更高,，通過t-SNE算法得到的二維圖。在這個二維空間中,，彼此接近的細胞對具有更相似的基因表達譜,。顯示限于10000個細胞的隨機子集。

4.2 t-SNE projection of Cells Colored by Automated Clustering

通過聚類的算法,，將每個細胞進行聚類分析,。聚類的結(jié)果是將具有相似表達譜的細胞組合在一起，由t-SNE算法得到的二維結(jié)構(gòu),，聚在一起的細胞具有更相似的基因表達,，顯示限于10000個細胞的隨機子集,，K-means最大為10。

4.3 Top Genes By Cluster

展示每個cluster顯著差異的基因,，這是每個cluster中所有細胞特定基因表達量均值相對于其他所有cluster中所有細胞特定基因表達量均值進行分析得到結(jié)果,，log2 fold-change (log2FC)為均值比的對數(shù)值，p值基于負二項檢驗且經(jīng)過多次Benjamini-Hochberg校正,，表示差異顯著性,。

4.4 Sequencing Saturation

顯示測序深度（細胞平均reads數(shù)）的增加對測序飽和度影響的變化曲線， 端點附近曲線斜率為0,，表示從該點測序數(shù)據(jù)近似于飽和,，繼續(xù)增加測序深度無意義

4.5 Median Genes per Cell

顯示測序深度（細胞平均reads數(shù)）的增加對每個細胞檢測得到的基因數(shù)中值影響的變化曲線，斜率表示在該點增加單位測序量帶來的邊際效益,。

通過對不同聚類方式每個cluster差異高表達基因進行富集分析,，可以找到每個cluster差異高表達基因與哪些生物學(xué)功能或通路顯著性相關(guān)。采用clusterProfiler軟件對每個cluster差異高表達基因集進行GO功能富集分析,，KEGG通路富集分析,。