基因分析

基因表達

除了移除低質(zhì)量的細胞，也會排除受技術(shù)操作影響較大的一部分基因。而且查看基因表達結(jié)果，可以幫助改進實驗操作。

通常會看top 50表達的基因占據(jù)了多少reads,。

plotHighestExprs(umi, exprs_values = "counts")

表達最高的50個基因的reads分布相對平緩，且比例不大,，在一定程度上反應(yīng)了測序?qū)φ麄€轉(zhuǎn)錄組覆蓋較好,。但是最高表達的15個基因里面有4個ERCC spikein，表明下次重復(fù)時可以稀釋下spike in的濃度,，把測序的機會更多留給內(nèi)源性基因,。

基因過濾

通常建議移除那些表達水平極低以至于可以視為”未檢測出”的基因。這里針對UMI數(shù)據(jù),，“檢出”定義為至少有2個細胞檢測到某個基因存在多于一個轉(zhuǎn)錄本,。如果是reads counts數(shù)據(jù), “檢出”可以定義為至少有2個細胞檢測到某個基因有至少5個reads count支持。請注意,，對兩種表達量計算方式,，閾值的選擇都與測序深度有關(guān)。自己的數(shù)據(jù)可以做相應(yīng)的修改,。另外一個需要注意的點是基因的過濾必須在細胞過濾后面,，因為部分基因可能只在低質(zhì)量細胞中能檢測的到 (注意下面的colData(umi)$use過濾).

keep_feature <- nexprs(umi[,colData(umi)$use], byrow=TRUE, 
                       detection_limit=1) >= 2
rowData(umi)$use <- keep_feature

table(keep_feature)

## keep_feature
## FALSE  TRUE 
##  4660 14066

細胞類型，建庫方案,，測序深度都會影響閾值選擇,，勿硬套。

存儲過濾后的數(shù)據(jù)

查看過濾后的數(shù)據(jù)集中保留的基因數(shù)和細胞數(shù):

dim(umi[rowData(umi)$use, colData(umi)$use])

## [1] 14066   657

獲取對數(shù)轉(zhuǎn)換的原始count值,，供下一章節(jié)使用,，并且移除PCA的結(jié)果：

assay(umi, "logcounts_raw") <- log2(counts(umi) + 1)
reducedDim(umi) <- NULL

存儲過濾后的數(shù)據(jù)

saveRDS(umi, file = "tung/umi.rds")